建立基于小鼠前列腺类器官的宿主-病原体相互作用研究模型

本研究旨在深入了解细菌病原体如何感染前列腺上皮，以及哪些宿主-病原体相互作用决定了感染的结局。现有的体外模型难以充分反映前列腺上皮的多样性。该模型提供了一个生理学上更相关的系统，能够体现组织中存在的不同类型细胞。

首先，获取在24孔板中培养于细胞外基质液滴上的三维小鼠前列腺类器官。吸出所需孔中的培养基，并向每孔加入500 µL新鲜培养基。使用P1000移液器在每孔中机械破坏细胞外基质液滴。

将此悬液收集到15毫升锥形管中，每管收集的孔数不超过两个。加入新鲜培养基，使体积达到10毫升。轻轻倒置管子3至4次以混匀，然后在4摄氏度下以450 ×g离心5分钟。

吸去上清液。将沉淀重悬于2 mL预热至37°C的酶溶液中，于37°C水浴中孵育15分钟。孵育期间，每5分钟使用P1000移液器混匀细胞悬液一次。

孵育后，加入新鲜培养基，使终体积达到10毫升。轻轻倒置离心管三至四次以混匀。在4摄氏度下，以450 ×g离心5分钟。

吸走上清液，注意不要扰动沉淀。用300微升含有10微摩尔ROCK抑制剂的培养基重悬沉淀。使用血细胞计数板对悬液中的细胞进行计数。

将悬浮液用含有10 µM ROCK抑制剂的培养基稀释至浓度为每毫升62,500个细胞。然后每孔接种200 µL悬浮液至48孔板中，或每孔接种300 µL至腔室载玻片中。将培养板置于37°C、5% CO₂的细胞培养孵箱中孵育。

一天后，检查大部分单个细胞是否已附着于二维培养表面。每两到三天更换一次培养基，并继续培养至七天内达到汇合状态。为诱导分化以富集腔面细胞，在接种时向细胞悬液中加入10纳摩尔的五α-双氢睾酮（DHT）。

将尿路致病性大肠杆菌（Escherichia coli）菌株，即UPEC，划线接种于添加了100微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂平板上。在37摄氏度下培养16至24小时。使用无菌接种环，挑取单个细菌菌落接种至3毫升含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB液体培养基中。

在37摄氏度下静置培养12至16小时。振荡混匀过夜培养的细菌菌液。在600纳米波长下测定菌液的光密度。

然后，计算在3 mL肉汤中达到起始光密度为0.05所需的菌液体积。将计算出体积的细菌培养物加入新鲜的含氨苄青霉素的LB肉汤中。在37°C下静置培养24小时。

孵育后，涡旋振荡细菌培养物。在600纳米处测定光密度。计算获得光密度为1所需的培养物体积。

将所需体积的样品在室温下以 12,000 G 离心两分钟。吸除并弃去上清液。将细菌沉淀重悬于一毫升不含 DHT 的 primus 和无菌类器官培养基中。

然后，用小鼠前列腺类器官培养基稀释该悬液，使感染复数达到100。吸除已准备好的类器官模型中的培养基。向48孔板的每孔中加入200微升含有细菌的培养基。

在37摄氏度、5%二氧化碳的细胞培养箱中孵育1小时。吸出含有细菌的培养基，并用新鲜培养基洗涤孔板3次，以去除胞外细菌。接着，加入含有50微克/毫升庆大霉素的培养基，在37摄氏度、5%二氧化碳的细胞培养箱中继续孵育30分钟。

吸弃培养基。加入新鲜培养基，其中添加10微克/毫升庆大霉素，继续感染至指定时间。对感染细胞进行荧光染色后，使用共聚焦显微镜成像，并通过流式细胞仪定量感染细胞。

在未添加双氢睾酮的对照条件下，大多数细胞为细胞角蛋白5阳性的基底细胞，仅有少数细胞显示低水平的CD24⁺腔面细胞表达。添加1纳摩尔DHT后，出现混合的基底细胞和腔面细胞群体，但CD24⁺水平仍保持较低。将DHT浓度增加至10纳摩尔可促进细胞向腔面细胞分化，同时在培养7天后仍保留部分基底细胞。

这与定量研究结果一致，后者显示随着DHT浓度随时间增加，细胞角蛋白5阳性基底细胞减少，而CD24A阳性腔细胞增多。在感染后0小时，尿路致病性大肠杆菌（UPEC）大量黏附于上皮细胞。经庆大霉素处理1小时后，UPEC阳性细胞数量急剧下降。

24小时时，感染细胞的数量与1小时时相似。24小时的共聚焦成像显示，细胞内细菌持续复制，形成类似群落的簇状结构。该方案使研究人员能够在保留上皮细胞多样性的模型中研究细菌感染动态及其病原体相互作用。

未来的研究可利用此模型探究多种前列腺疾病，包括感染、癌症生物学以及潜在治疗化合物的测试。