一种简单的微吸取技术，用于从冷冻保存的马中分离体细胞，作为克隆的核供体
2025年12月19日
该方案采用了一种简单的微吸技术，用于从冷冻保存的马中分离出可存活的体细胞（SCs）。与传统方法不同，该技术避免了长时间体 外 培养，克服了精子污染，使得能够立即用于体细胞克隆。
我们旨在证明，冷冻保存马中的体细胞对于恢复具有高遗传价值个体的帮助。我们当前的挑战是能够选择具有完整二倍体DNA的体细胞作为核供体。首先，将液氮罐中的马用吸管取出。
将肉体暴露在空气中10秒，然后在37摄氏度的水浴中解冻30秒。取一个250微升的解冻样本。用一毫升补充的DMEM-F12培养基稀释。
将混合物在37摄氏度孵育30分钟。从培养稀释液中移出25微升液液，放入管子中，稀释于975微升DPBS中，辅以0.1毫克每毫升聚乙烯醇或聚乙烯吡咯里酮。轻轻混合悬挂。
在整个细胞采集过程中，保持稀释后的混合物温度在37摄氏度。将装有稀释马的培养皿盖放在显微镜台上，为体细胞采集做准备。选择一个直径合适的微量移液器用于体细胞采集，并将其连接到机械吸吸系统。
小心地将微量移液器插入微滴液，并与碗盖底座对齐。移液器吸取培养基后，开始对体细胞进行单独采集。关注微滴底部，那里可见各种细胞形态。
将微量移液器尖端放置在每个体细胞旁边，并在负压下抽吸。收集所有圆形和细长细胞，无论大小。收集10个细胞后，将其沉积到碗盖上表面的10微升微滴中。
在整个采集过程中，将所有收集到的体细胞保留在该微滴中。收集到所需数量的体细胞后，使用微滴进行简单的清洗程序，去除精子、杂质和微生物污染物。使用第二个碗盖，依次对体细胞进行三步清洗。
使用微量移液器将体细胞转移到第一滴中，并让它们沉降三到五分钟。用同样的方法将细胞从第一滴转移到第二滴。再次重复转移，并将体细胞放入第三滴。
最后，将分离出来的体细胞沉积到预备好的微滴液中，用于体细胞核移植。微抽吸技术成功从冷冻保存的马中回收体细胞，捕获率在三匹种马中每小时317.7至424.7个细胞之间。3号种马产量最高。
根据大小和形态，识别出五种不同的体细胞类型。我们鉴定出一批体细胞在形态和存活率上存在冷冻保存马的群体，这些细胞可能作为核供体非常有用。细胞可以根据其形态进行选择，且该程序无需建立原级培养。
我们将重点提升这些细胞在增量马后的存活率。
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概述
本协议介绍了一种微吸引技术，用于从冷冻保存的马精液中分离活体体细胞。该方法避免了长时间的体外培养和精子污染，使得体细胞在克隆中可以立即使用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 生殖生物学
背景
- 体细胞可以从冷冻保存的马精液中提取。
- 活体体细胞的分离对克隆目的至关重要。
- 传统方法通常涉及漫长的培养时间。
- 精子的污染可能会阻碍克隆过程。
研究目的
- 展示从马精液中分离体细胞的技术。
- 使这些细胞能用于克隆高遗传价值的个体。
- 确保所选体细胞具有完整的二倍体DNA。
使用的方法
- 从液氮中解冻马精液稻草。
- 使用37摄氏度的水浴进行解冻。
- 用补充的DMEM-F12培养基对解冻的精液进行采样和稀释。
- 应用微吸引技术进行细胞分离。
主要结果
- 成功分离出活体体细胞。
- 在分离过程中减少精子污染。
- 分离的细胞可以立即用于克隆。
- 所选细胞中的二倍体DNA完整性得到保护。
结论
- 微吸引技术对体细胞分离有效。
- 该方法增强了马体细胞克隆的潜力。
- 未来的应用可能会导致马类育种中遗传恢复的改善。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient recovery of viable somatic cells from cryopreserved equine semen addresses a critical bottleneck in genetic resource utilization for advanced reproductive technologies. This microaspiration technique enables immediate access to diploid donor cells for somatic cell nuclear transfer (SCNT), bypassing the need for prolonged culture and mitigating sperm contamination. The approach expands the potential for genetic rescue and portfolio diversification in animal biotechnology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of somatic cell viability and diploid status from cryopreserved samples.
- Supports functional validation of nuclear donor suitability for SCNT workflows.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing morphological selection of donor cells.
Screening & Assay Development
- Provides a rapid, reproducible method for isolating somatic cells free from sperm interference.
- Delivers standardized cell populations for downstream cloning assays without primary culture establishment.
- Enables quantitative assessment of cell yield and morphology for process optimization.
Translational & Preclinical Research
- Improves continuity from genetic resource banking to preclinical cloning applications.
- Aligns with translational objectives by enabling recovery of high-value genotypes from archived material.
- Reduces biological risk by ensuring donor cell integrity prior to embryo generation.
Pipeline & Workflow Integration
This microaspiration method integrates at the interface of genetic resource recovery and SCNT-based cloning, bridging cryopreservation banking with immediate nuclear donor preparation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on donor cell viability and genetic integrity from cryopreserved sources.
- Screening: Standardizes somatic cell isolation for reproducible SCNT input.
- Analytics: Enables quantitative measurement of cell yield and morphological diversity.
- Translational Research: Connects biobanked semen to actionable cloning workflows for genetic rescue.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable protocol for diverse genetic backgrounds and archived samples.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in donor cell suitability and reduces mechanistic ambiguity in SCNT.
- Operational Value: Streamlines cell isolation, enhances reproducibility, and eliminates lengthy culture steps.
- Strategic Value: Enables rapid go/no-go decisions for genetic recovery projects and optimizes resource allocation.
- Portfolio Impact: Expands the range of viable genetic material for cloning and risk-adjusted breeding strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in micromanipulation and cell morphology assessment.
- Needs access to mechanical aspiration systems and microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization for cell selection and washing procedures.
- Adaptable to various semen samples but may require optimization for different species or preservation conditions.
- Cell viability post-isolation may vary and should be monitored for SCNT readiness.
