使用过氧化物酶体特异性探针对哺乳动物细胞进行染色

因此，我们的研究重点是理解过氧化物酶体，这是一种对脂质代谢和细胞氧化平衡至关重要的细胞器。我们的目标是揭示其结构与功能的调控机制，以及这些过程在疾病状态下的变化。为实现这一目标，我们开发了荧光探针，使我们及更广泛的科学界能够观察多种动物细胞中的过氧化物酶体。

本文中，我们开发了适用于活细胞和固定细胞的染色方案，为研究帕罗西汀在生理与病理条件下的生物学功能提供了有力工具。其中一个主要的实验挑战是在动物细胞中实现对过氧化物酶体的非侵入性标记。尽管抗体染色有助于克服这一难题，但目前 commercially available 针对帕罗西汀相关蛋白的抗体仍十分有限。

另一个挑战是以非侵入性方式实时观察过氧化物酶体，这需要灵活可调的实验方案。最后，传统的染色方法无法提供功能性的读出结果。虽然基于过氧化物酶的染色结果可能因过氧化物酶体功能状态的波动而变化，带来一定挑战，但同时也带来机遇，因为它使我们能够在细胞内区分过氧化物酶体的不同功能状态。

从前一天接种在含有盖玻片的培养板中的哺乳动物细胞开始，细胞密度应处于30%至70%的融合度。在避光的微量离心管中，用新鲜培养基稀释过氧化物酶体探针，使其终浓度为4 µM。选择需要染色的孔，并使用记号笔在孔外侧进行标记。

从选定的孔中吸出0.5毫升培养基，并沿孔壁逐滴加入已准备好的探针培养基。加样后，将细胞在37摄氏度下孵育10至15分钟。从此步骤开始，使用铝箔将细胞避光保护。

孵育结束后，小心吸除染色培养基，用 PBS 洗涤细胞两次。然后将培养板置于化学通风橱中，加入含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液固定细胞，在室温下孵育 20 分钟。固定完成后，将多聚甲醛移至指定废液容器中，并用 PBS 洗涤细胞一次。

接下来，加入含0.5%Triton X的PBS以通透细胞，并孵育2.5分钟。孵育后，去除Triton X溶液，用PBS洗涤细胞两次，每次10分钟。为封闭细胞，将细胞在含5%牛血清白蛋白的PBS中于4°C条件下孵育过夜。

按照标准方案进行免疫荧光染色操作。最后，通过显微镜成像获取固定细胞和活细胞的图像。使用Peroxi_SPY探针对活细胞进行染色，可导致探针依赖ATP结合盒超家族D亚型介导进入过氧化物酶体，从而在代谢活跃的细胞中产生较高的过氧化物酶体与细胞质荧光比值。

在表达GFP-SKL的野生型HEK-293T细胞中，Peroxi_SPY555染色显示出与过氧化物酶体明显的共定位，而在缺乏过氧化物酶体的PEX19基因敲除细胞中，染色信号则不存在。在人成纤维细胞中，Peroxi_SPY染色与阵发性标记蛋白GFP-SKL共定位，证实其靶向过氧化物酶体。过氧化物酶体密度的定量分析显示，不同细胞类型之间存在显著差异。

在COS-7细胞中使用250纳摩尔Peroxi_SPY染色20分钟的优化条件，与原始的1微摩尔、10分钟方案相比，显著提高了过氧化物酶体与细胞质的荧光比值。HEK-293T细胞经Peroxi_SPY孵育24小时后，尽管过氧化物酶体染色强度降低，但其过氧化物酶体与细胞质的荧光强度比值仍优于15分钟孵育组。一种固定方案实现了成功的抗体共染色，表现为HuH-7和HEK-293T细胞中Peroxi_SPY标记信号与抗PEX14免疫荧光染色信号均得到良好保留。

定量结果显示，与活细胞染色相比，固定和透化处理会影响过氧化物酶体的荧光强度。我们开发了Peroxi_SPY染料，可用于在活体和固定动物细胞中可视化过氧化物酶体。我们的荧光探针提供了一种简单快速的方法，以研究过氧化物酶体的动态变化、异质性及功能障碍，这些研究在此前是受限的。

本方案将能够实现基于成像技术的过氧化物酶体研究，适用于多种细胞类型，包括源自阵发性疾病患者的细胞。