Name: 一种针对不同哺乳动物大脑中定量细胞计数研究的比较方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-16T13:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: 了解哺乳动物神经元群体跨物种比较分析方法，探索实验室啮齿类与人类大脑的神经发育差异。该研究为揭示哺乳动物大脑进化模式提供了重要的技术框架和可比性数据。

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感谢Matteo Piumatti和Chiara La Rosa为本研究中报道的皮层未成熟神经元实验方案的制定所做出的贡献。本工作获得都灵储蓄银行基金会（Fondazione CRT - Cassa di Risparmio di Torino，项目号RF=2022.0618）对LB的资助；PRIN2022（项目号2022LB4X3N）对LB的资助；美国国家科学基金会（国家科学基金会，项目号EF-2021785、DRL-2219759）和美国国立卫生研究院（国家卫生研究院，项目号NS092988、AG067419）对CCS的资助。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方法在考虑脑尺寸和神经解剖结构差异显著的多种物种时，可提供可比的定量数据。该方法可用于评估不同哺乳动物全脑中细胞群体的一致性，也可用于追踪单一物种从出生后到衰老各阶段的发育过程。本方法基于以下假设：将涉及相对较多样本数量的脑组织（完整的半脑）和物种，均由同一实验室按照采样与固定的质控标准进行处理，随后采用相同的分析流程进行分析33（图1和图2）。
该方案中的关键步骤包括那些由于脑大小以及伦理/实际原因而无法完全标准化的变量（例如，在受保护的哺乳动物物种中不允许进行的操作）。最常见的因素是死后间隔时间（PMI）和组织固定，这两者可达到相似（尽管不完全相同）的条件。根据我们的经验，只要将 PMI 控制在 1 小时以内（如绵羊、马）或 15 小时以内（如黑猩猩），并通过浸入法找到合适的固定时间（图 2），即可接受一定程度的变异。在每种情况下，方案是否最优需通过评估组织质量来判断（切片后的整体外观、组织和细胞形态、免...

神经科学研究在很大程度上依赖近交系小鼠和大鼠，以将研究结果外推至人类。尽管在分子、细胞甚至解剖结构方面存在诸多相似之处，但重要的种间差异仍然存在，这可能对临床前数据的解释产生误导1,2。尽管需要开展比较研究，但当涉及较大体积的脑组织时（例如，从小鼠平均0.5 g到人类1300 g；图1A），技术与实际操作上的困难往往限制了此类研究的进行。此外，不同实验室采用的实验方法存在异质性，这可能限制结果之间的比较，尤其是定量分析，有时会引发争议。脑结构可塑性研究便是如此，特别是与神经发生过程相关的研究3,4,5，这一主题对于理解发育期神经可塑性及脑修复机制具有重要意义6,7。
脑可塑性领域的最新发现强烈表明，在进化过程中，不同类型的神经发生过程在发生频率、速率以及解剖学位置上出现了显著差异8。一个例子是，与实验啮齿类动物相比，成年大型哺乳动物中由干细胞驱动的神经发生明显减少5,9,10，这可能与脑区和功能在适应生态压力过程中表现出的不同程度的扩展有关7,8，同时也可能与不同的神经发育时间进程相关11,12。神经发生的速率在小鼠与人类之间似乎存在显著差异，从而引发了研究结果可否转化的问题13。
另一方面，一种新型的“不分裂的神经发生”现象，表现为神经元停滞于成熟受阻阶段（即所谓的未成熟或静息神经元14,15,16,17,18,19），据推测其在小脑容量到大脑容量的物种中逐渐增加20,21。有趣的是，这种不依赖干细胞的未成熟神经元群体存在于大脑皮层中（在具有脑回结构的物种中，该区域负责高级认知功能22,23），远离经典的神经发生区域；而后者主要与嗅觉和空间导航相关，在无脑回结构的物种中仍具有重要意义7,8。这些跨脑结构和哺乳动物物种之间的差异已超出单纯的比较研究兴趣，因为它们可能在从小鼠到人类的转化研究中影响可塑性的潜力。因此，至关重要的是以“可比较的方式”评估这些差异在多大程度上代表了广泛不同的哺乳动物之间的系统发育变异，尤其应重点关注实验啮齿类动物与灵长类动物之间的比较。
本文介绍了一种近期建立的研究方法，用于分析在脑大小、脑回复杂程度及社会生态位方面存在显著差异的哺乳动物中，大脑皮层第II层未成熟神经元（cINs）种间变异的方法22,24,25。该方法基于三个原则：i）选择多个（多样化的）哺乳动物物种，并采用相同的实验流程进行平行处理；ii）尽量减少在结构差异较大的脑组织中难以完全标准化的变量（如固定程序、死后间隔时间、年龄），并通过使用所研究细胞群体中广泛共有的特征作为内部阳性对照，来解决免疫细胞化学中抗体的物种特异性问题；iii）确立对应的解剖结构作为参考点，以便在不同物种脑组织的相应解剖水平上进行细胞计数（图1B 和 图2）。通过计数使用公认标记物双皮质素（DCX15,17,26）识别的细胞所获得的数据（例如细胞密度），可映射到系统发育树上以揭示进化模式，并进一步分析其与脑大小、脑回复杂程度及皮层表面积等不同参数之间的协变关系。
<img alt="脑大小进化图表和大脑皮层示意图；哺乳动物物种比较；平滑脑与沟回脑。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69446/69446fig1.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图 1"> 
图 1：用于评估皮层被膜中cINs分布与数量的多种不同哺乳动物脑组织的处理。（A）属于不同物种和目类的哺乳动物具有显著差异的脑大小、脑沟回程度以及皮层扩展程度。脑图标经BioRender授权复制。（B）从脑大小和皮层被膜延伸程度差异显著的动物脑组织中切取的代表性冠状面甲苯胺蓝染色切片。使用组织学染色的连续切片（冰冻切片，冠状面，厚40 µm）以识别每种动物的主要神经解剖结构（见图 3）；注意脑大小和皮层周长的显著差异。图A中的动物图标已获La Rosa等22许可复制。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69446/69446fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
最后，由于所有可塑性过程通常都会随着年龄增长而逐渐减弱27,28，比较神经可塑性研究中的另一个问题是评估这种减弱过程在不同物种中的时间进程差异，而这些差异可能与哺乳动物间不同的神经发育过程时间进程相关12,29,30。事实上，存在快速成熟（如小鼠）与缓慢成熟（如灵长类）物种这一事实，进一步限制了目前最常用的模式系统——实验小鼠——在解决生物医学科学难题方面的能力。本文所述方法还可用于分析各物种生命周期中不同年龄阶段的细胞群体，并进一步比较不同物种间的变化趋势。在小脑容量与大脑容量不同的哺乳动物之间，已发现cIN密度的系统发育差异以及这些细胞随年龄持续存在的差异22,28。

<table><tbody><tr><td>10% 甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基丁烷&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320404</td><td>异戊烷</td></tr><tr><td>3,3&amp;prime;-四盐酸联苯胺水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C0759</td><td></td></tr><tr><td>组织学用DPX封片剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;06522</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Merck</td><td>1.00983</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>102466</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Killik - O.C.T. 包埋剂</td><td>Bio-optica</td><td>&amp;nbsp;05-9801</td><td></td></tr><tr><td>Mesquite 软件</td><td>Mesquite Project</td><td>Mesquite 版本 3.81 (build 955)</td><td></td></tr><tr><td>Neo-mount 封片剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.09016</td><td></td></tr><tr><td>磷酸缓冲液 (PB)</td><td>na</td><td>na</td><td>自行配制</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)</td><td>na</td><td>na</td><td>自行配制</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Riedel-de Haen</td><td>6213</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠二水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71645</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠二水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71500</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>甲苯胺蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89640</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC-HRP 试剂盒 过氧化物酶（标准型）</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>247642</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于广泛不同哺乳动物大脑中定量细胞计数研究的比较方法

A Comparative Approach for Quantitative Cell Counting Studies in Widely Different Mammalian Brains

大多数神经生物学研究是在实验啮齿类动物上进行的。尽管哺乳动物大脑之间存在许多相似之处，但也存在重要差异，这些差异在转化研究中可能产生误导。在脑可塑性，特别是神经发生方面，已发现显著的物种间差异。由于进化过程中的权衡，不同的神经发生过程可能占据主导地位，从而在脑结构和哺乳动物之间表现出差异，并改变不同物种（如小鼠与人类）的可塑性潜力。比较差异较大的物种会引发多个问题：当涉及大脑体积较大的物种时，比较研究会遇到技术困难；不同实验室采用异质性的实验方法可能限制结果的可比性；这种异质性可能与哺乳动物神经发育过程的时间进程不同有关，从而为比较增加了额外变量。
为了克服这些局限性，建立了一种研究哺乳动物皮层第II层未成熟神经元群体在物种间差异的方法，所涉哺乳动物在脑容量、大脑沟回结构、社会生态位和年龄方面存在显著差异。尽管存在一些无法完全标准化的变量，本文提出了一种方法，通过减少脑组织采集过程中的异质性，并采用共同的解剖结构作为参考点，以在对应的脑区水平上进行细胞计数。所获得的数据（如细胞密度）可映射到系统发育树上，以揭示进化模式，并可分析其与神经解剖学特征（如脑容量、皮层表面积）之间的协变关系。该方法已显示出不同系统发育类群之间皮层未成熟神经元数量存在显著差异，并揭示了其与脑容量之间的协变关系。该方法还可用于量化同一物种在不同发育阶段的差异，并可推广至其他多种哺乳动物及其他生物学过程，以获得可比较的结果，从而更准确地量化成年脑中不同细胞群体的数量，支持脑可塑性的研究。

在所有被研究物种的大脑皮层中，DCX+细胞始终具有一系列共同特征，表明存在一个高度保守的未分化神经元群体（图4A）。简而言之，这些细胞：（i）在拓扑结构上排列成单层，位于皮层第二层（cortical layer II）；（ii）表现出未成熟神经元在不同发育阶段所描述的形态学亚型，（a）其中以体积较小的单极/双极细胞为主，仅少数细胞具有复杂的树突结构，类似锥体神经元；（b）大多数细胞共表达未成熟标志物PSA-NCAM和DCX，但从不共表达与细胞分裂相关的Ki67抗原；（c）一个亚群的大体积复杂细胞还表达NeuN，表明其已启动成熟过程22,25。
除了这些共同特征外，当使用本文所述方法对cINs的线密度进行量化时，不同物种间的差异极为显著，在所检测的样本中差异幅度可达一个数量级（图4B）。在哺乳动物中，未成熟细胞群体具有共同特征，而细胞出现频率和数量却...

现代神经科学需要探索多种物种之间的差异，包括实验啮齿类动物和人类。然而，在涉及大脑较大的哺乳动物时，技术难题随之而来。该方法针对差异较大的哺乳动物中神经元群体的种间变异进行研究，获得可比较的结果，进而绘制出揭示进化模式的图谱。

大多数神经生物学研究是在实验啮齿类动物上进行的。尽管哺乳动物大脑之间存在许多相似之处，但重要的差异也同样存在，……

研究发现，不同哺乳动物的大脑结构可塑性可能有显著差异。因此需要系统性定量分析来揭示真相。我们对不同大脑的系统分析，可以给出类似的结果，放在系统发育的背景下。首先，取一块20摄氏度冰箱中含有游离脑片的12孔板，取出一些切片放入装有PBS溶液的培养皿中。选择各部分并放在幻灯片上。在对切片进行组织学染色后，根据特定的神经解剖特征确定大脑的水平。将其定义为第1到第4级，使用相同数量的40微米厚序列切片，并从每个脑层级选取三个等距的冠状切片，进行免疫组化染色。在工作站上打开Neurolucida软件，将载玻片放置在显微镜下，使用选定的细胞计数物镜。在低倍分辨率下，使用软件“描图”菜单中的自由手绘轮廓线工具勾勒皮层第二层。沿着周边追踪，得到皮层2的长度，包括古皮层和新皮层。从标记工具栏中选择单元格计数的首选符号。计数1型细胞通过一个小型体细胞识别，体形为双极性，体形在每个关注区域的体细胞直径在3到9微米之间。计数2型细胞由体细胞体识别，体质体具有复杂的树突状树状结构，体质直径在9至18微米之间。现在，收集来自古皮层、新皮层和大脑皮层的系统发育分析数据，这些数据是通过结合古皮层和新皮层的数据获得的。将皮层层2的周长（以毫米计）收集到轮廓测量工具栏中可见的表格文件。在同一电子表格上，收集标记工具栏中可见的类型1和类型2单元格数量。通过为每个脑、区域和脑层级添加1型和2型细胞，计算并记录细胞总数，每层分三段，每标本共12片。利用收集到的数值，通过将单元数除以周长（毫米）来计算每个区域各区段的线性细胞密度。通过将1型或2型细胞数除以总细胞数，再乘以100，计算出1型和2型细胞的比例。接着，使用公式计算每个标本中1型和2型细胞的百分比。利用电子表格中的平均函数，计算每个物种所考虑的四个标本中这些百分比的平均值。利用线性细胞密度进行系统发育分析，并利用每个冠状切片中计数的总细胞来估算每个半球未成熟神经元的总数。利用电子表格上的中位函数计算每个标本所考虑的12个切片的密度中位数。以中位数作为中心衡量标准，因为每组样本较小，且部分组分布不对称。使用Neurolucida软件中的自由轮廓工具，在体形直径上画一条垂直于主轴的线。在每个脑区每个标本中随机选取至少100个随机选取的两种类型DCX阳性细胞，以获得1型和2型细胞的体细胞直径范围。现在，用学名在记事本中列出被分析的物种。将列表上传到网站时间树。org 并导出为 NWK 文件。在Mesquite Project Software上，上传NWK文件，整合数据，并将生成文件保存为PDF文件。最后，在之前创建的数据表中，添加一栏，列出每个物种的脑容量。计算DCX正细胞密度的自然对数和大脑大小的自然对数。在所选的统计软件上进行统计分析并下载获取的文件。将残差输入到数据手册的新列中，以便制作残差图。所有研究物种大脑皮层中的DCX阳性细胞均一致呈现出沿皮层2形成单层的拓扑排列，主要包括小型、单极或双极细胞，以及少量大型复杂细胞。这些细胞在缺乏Ki67表达的情况下共表达了PSAN-NCAM和DCX。并包含一个表达NeuN的复杂细胞亚群。皮层未成熟神经元的线性密度在不同物种间差异很大。系统发育比较分析显示，月桂草类的皮层未成熟神经元密度高于真骨龙类。观察到皮层未成熟神经元密度与脑容量之间存在显著协方差。以及皮层未成熟神经元密度与新皮层2周边之间。我们的发现可以揭示不同类型可塑性之间以及不同大脑区域之间的进化权衡。

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神经科学

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