利用数字滴液PCR（ddPCR）测定土壤中的微生物生物量

本研究采用微滴数字PCR和全基因组测序技术，精确量化不同类型土壤中的微生物生物量。传统方法需要大量土壤样品并使用有害化学试剂。ddPCR仅需少量土壤即可实现基因绝对定量和生物量碳的精确测定。

首先，在20摄氏度的室温下，准备好土壤DNA提取试剂盒的试剂，以从土壤微生物中分离DNA。短暂离心2毫升珠磨管，并确认珠子已沉降至管底。加入100毫克土壤，随后加入800微升CD1溶液，短暂涡旋混匀。

使用珠磨机匀浆器，以每秒6米的速度匀浆40秒，充分裂解样品，然后将珠击打管在室温下以15,000 g离心1分钟，实现机械细胞裂解。将上清液（可能仍含有土壤颗粒）转移至干净的2毫升微量离心管中。加入200微升CD2溶液。

涡旋5秒，然后在15,000 g离心1分钟。将最多700微升上清液转移至干净的2毫升微量离心管中，注意不要扰动沉淀。向上清液中加入600微升CD3溶液，涡旋5秒。

将650微升混合物加入离心柱中，在15,000 g条件下离心1分钟。弃去滤过液，并对剩余的裂解液重复此步骤。接着，将离心柱放入一个干净的2毫升收集管中。

向离心柱中加入 500 µL 溶液 EA，于室温下以 15,000 ×g 离心一分钟。弃去流出液，将离心柱放回原来的收集管中。向离心柱中加入 500 µL 溶液 C5，按之前的方法进行离心。

弃去流出液后，将离心柱放入一个新的2 mL收集管中，在室温下以16,000 g离心2分钟。将离心柱转移至一个新的1.5 mL洗脱管中。向离心柱滤膜的中央加入50至100 µL的溶液C6。

在15,000 g离心1分钟。弃去离心柱后，将含有洗脱液的离心管于4摄氏度保存。根据制造商说明书，使用荧光计和双链DNA宽范围检测试剂盒对提取的DNA进行定量。

在分析细菌和真菌时，选择特异性的16S rRNA和18S rRNA引物。解冻后，将所有试剂在冰上涡旋混匀。设置数字液滴聚合酶链式反应（ddPCR）。

将液滴生成器芯片（DG8）放入芯片架中。向芯片的每个样品孔中加入总共 20 微升反应混合液。然后向芯片上标注为“oil”（油）的孔中加入 70 微升 Evagreen 液滴生成油。

将 cartridge 放入液滴生成仪中，并用垫圈盖好。将生成的液滴各 40 微升转移至 96 孔半裙边板的每个孔中，用于 PCR 扩增。使用预设为 180 摄氏度、持续 5 秒的板封仪对板进行密封。

设置热循环程序，并将加热盖温度设为 105 摄氏度。PCR 完成后，将 96 孔板转移至酶标仪。使用 QuantaSoft 2.1 版本软件，调节扩增信号的阈值，以区分阴性和阳性微滴。

从每个孔中评估各项参数，例如每纳克DNA中的基因拷贝数、每纳克提取DNA中的总基因拷贝数、每克干重土壤（经提取处理）中的基因拷贝数，以及每克干重土壤中的细胞数量。此外，计算每孔对应的每克干重土壤中细菌和真菌的微生物生物量碳（MBC）。对五个采样点的土壤DNA进行三重复分析，所得微生物DNA浓度平均值范围为每样品每克干土32纳克至4,590纳克。

土壤B中16S rRNA基因拷贝数最少，平均每克干土为8.8 × 10⁷，18S rRNA基因拷贝数平均每克干土为4.6 × 10⁶。相比之下，土壤E的16S和18S rRNA基因拷贝数最高，平均每克干土分别为4.4 × 10⁹和2.5 × 10⁹，显著高于其他所有样品。尽管土壤A、B、C和D中的真菌拷贝数相近，但土壤D中的细菌数量与土壤B和E相比存在显著差异。土壤E的微生物含量最高，而土壤B样品的微生物含量最低，且显著低于土壤A、D和E。本方案可使研究人员通过微生物生物量及真菌与细菌比例来评估土壤微生物群落的动态变化与结构。

用于微滴数字PCR的同一份模板DNA可用于DNA测序，以实现微生物群落和功能分析。