基于荧光的钙成像结合自动细胞分割技术在原代人呼吸道上皮细胞培养中的应用

单细胞转录组学揭示了囊性纤维化气道上皮的异质性。我们旨在理解细胞类型特异性的功能及其变化如何影响疾病的发病机制。当前的挑战在于精确测量单细胞蛋白质组学及其功能。

这仍然需要技术上的改进。首先，在含有添加了20%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的Eagle最小必需培养基的T-25培养瓶中培养Calu-3细胞。当细胞融合度达到约70%时，用5毫升PBS洗涤细胞。

洗涤后，直接向细胞中加入1毫升TrypLE，将培养瓶置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育10至15分钟。然后加入4毫升新鲜完全培养基以中和TrypLE，并充分混匀细胞悬液。将细胞以约90%至100%融合度接种至96孔板中，每孔约40,000个细胞。

将细胞置于96孔板中过夜，使其贴壁。每天更换培养基，在细胞达到融合后继续培养2至5天，以促进细胞分化。实验当天，洗涤Calu-3细胞，并用适当的染料进行孵育。

接下来，每孔加入 100 µL 用钙缓冲液稀释的 2.5 mM 丙磺舒，以维持染料位于胞质空间，并用铝箔包裹培养板，避光保存直至成像。对于原代气道细胞，移除 transwell 培养小室的基底外侧培养基，并在顶端加入 300 µL 钙缓冲液进行清洗。

然后在基底外侧加入 750 微升钙缓冲液进行洗涤。用移液器吸去缓冲液，并在两侧再重复洗涤一次。接着，在顶端侧加入 200 微升染料溶液，在基底外侧加入 600 微升染料溶液，于 37 摄氏度和 5% 二氧化碳条件下孵育 1 小时。

孵育期间，用钙缓冲液配制毒胡萝卜素，作为三倍中间储备液。将浓度调整为6 µM，以使孔中终浓度达到2 µM。孵育结束后，用移液器从顶膜和基底膜两侧腔室中移除染料溶液。

用300微升钙缓冲液清洗细胞顶部两次，用750微升钙缓冲液清洗基底外侧两次。然后用移液器吸去缓冲液。接着，在顶部腔室加入100微升含2.5毫摩尔普罗苯西的钙缓冲液，在基底外侧腔室加入500微升相同溶液。

保持 transwell 小室在培养板内，用铝箔纸将整个培养板包裹以避光，并将包裹好的培养板放置一旁待成像。打开 Fiji 软件，选择“文件”菜单，点击“打开”以上传视频文件。

在弹出的窗口中，保留所有默认设置并确认选择。如有需要，可通过选择“图像”，点击“调整”，然后点击“亮度对比度”来调整图像显示。调节各个荧光通道的亮度和对比度，以获得细胞的最佳观察效果。

为便于细胞追踪，选择“图像”，点击“颜色”，然后点击“合并通道”以合并通道。在弹出窗口中，为每个单独的通道分配相应的文件，并确认选择。进行追踪时，选择“分析”，选择“工具”，然后打开“ROI 管理器”。

在弹出的窗口中，同时启用“显示全部”和“标签”选项。使用手绘选择工具，根据细胞边界和细胞核染色仔细描记单个细胞。然后按 T 键将每个描记的细胞添加到 ROI 列表中。

确保在视野的四个角以及视频的中心区域均对细胞进行追踪。当所有细胞均被准确追踪后，在“ROI Manager”窗口中点击“More”，然后选择“Multi Measure”。在弹出的窗口中，点击“OK”以开始测量。

在 Fiji 中打开视频文件。使用图像调整工具优化核染色和绿色荧光通道的显示效果。通道优化完成后，通过选择“图像”并点击“复制”来复制单帧图像。

在弹出的窗口中，取消选中“复制图像栈”选项，并将复制的图像另存为 PNG 图像文件。通过选择“图像”并选择“复制”，对另一通道重复帧复制操作。在弹出窗口中点击“确定”，并将图像保存为 PNG 文件。

通过选择图像、点击颜色，然后点击合并通道，将两个保存的图像合并。随后将每个PNG文件分配至相应的通道，并确认合并。将合并后的图像上传至细胞后处理图形用户界面，以生成细胞掩膜。

使用核染色作为通道一、细胞质染色作为通道二，选择 cyto3 模型对图像进行分割。现在，将生成的掩膜图像保存为 PNG 文件。在 Fiji 中打开该文件，并将其转换为 TIFF 文件。

最后，通过将掩膜文件和原始视频文件拖放到软件界面中，在钙成像分析套件中同时打开这两个文件。点击“分析数据”以生成可下载的图表以及包含所有分析细胞的归一化和原始强度值的可下载 CSV 文件。使用 Fluo-4 AM 和 Cal-520 AM 两种染料检测时，经毒胡萝卜素（thapsigargin）刺激后，单个 Calu-3 细胞的荧光强度随时间推移相对于基线呈上升趋势；然而，使用 Cal-520 AM 检测的 Calu-3 细胞在毒胡萝卜素刺激后的最大钙依赖性荧光激活显著高于使用 Fluo-4 AM 检测的结果。类似地，无论是使用哪种染料，原代气道和支气管细胞在毒胡萝卜素刺激后，其归一化荧光强度均随时间逐渐增加。

此外，用 Cal-520 AM 负载的细胞中，钙依赖性荧光激活的最大值显著更高。基于机器学习的分析识别并量化了单个视野中 1,441 个单个细胞的钙依赖性荧光变化。软件生成的归一化荧光轨迹显示了在毒胡萝卜素刺激后，所识别的全部 1,441 个细胞的钙反应。我们的研究将有助于理解不同类型细胞对其环境的响应，从而推动靶向治疗药物的开发。

我们的研究结果有望精准识别特定的细胞类型，并将某些活细胞对环境刺激的反应归因于特定细胞。未来，我们计划探究在疾病和健康细胞中，细胞类型特异性的信号传导如何改变，以确定其中起关键作用的细胞类型。