可重复的实验装置设置 在体 小鼠颈部淋巴管收缩性与淋巴流动的双光子成像

我们提出需要一种新的成像方法，用于观察小鼠颈淋巴管的收缩功能以及淋巴系统对红细胞的清除作用。研究颈淋巴管功能具有挑战性，尤其是在需要长期观察淋巴流动的收缩性及示踪剂循环的情况下。首先，将一根长270毫米、宽43毫米的钢制光学导轨作为装置的基座放置。

在钢制光学导轨顶部安装两个支架座，确保两者之间的距离为175毫米。将两根直径为12毫米的安装支杆插入支架座中，并使用M6螺钉固定每一根支杆。然后在两根安装支杆上各安装一个支杆固定环。

将一个直角固定杆夹固定在其中一个安装杆上，并使用 M6 螺丝牢固固定。将一根 12 毫米的安装杆插入直角杆夹的侧孔中。将一个 3D 打印的支架安装到插入的侧向安装杆上，并使用两对 M3 螺丝将其牢固固定。

使用紫外光固化胶，将直径为12毫米的盖玻片粘附在3D打印保护外壳的底面。然后使用M4螺钉/螺母组合将保护外壳固定到3D打印支架上。利用两个平台夹具及M6螺钉、螺母和垫圈，将精密平行移动平台安装在钢制光学导轨基座上，用于实现垂直方向的运动。

然后将一个长度为155毫米、宽度为110毫米的3D打印外壳放置在桌面上。该外壳用作收集生理盐水溶液的储液池。在导线与第一加热元件的连接处覆盖一层薄薄的硅胶。

将温度传感器一固定在垫片上，并用硅胶密封。将加热元件和温度传感器的导线焊接至多芯电缆。在连接处填充硅胶，并用热缩管密封。

将加热元件二和温度传感器二放入泡沫滚筒中。将电源线和电源按钮的连接器固定在控制单元外壳的壁上。在 enclosure 内安装一个 24 伏直流电源、一个直流降压转换器和两个 MOSFET 模块。

组装电路并焊接所需元件后，将 Arduino Uno 和键盘屏幕固定在盖子外壳中。找到温度选择区域，调节温度后按下运行。

将小鼠麻醉后，在双眼眼睑上涂抹眼药膏，以防止手术过程中眼球干燥。当后肢回缩反射和尾部蜷缩反射消失后，将小鼠仰卧放置在加热装置上，以便暴露腹部区域。将控制单元插入输入电压为175至240伏交流电的电源插座中。

使用医用胶带将动物身体固定于与台面平行的位置，并将头部置于偏离矢状轴的角度，使颈部一侧置于滚轮上。用结扎线缠绕上切牙并固定于装置后端，同时使用医用胶带帮助维持动物体温。随后，剃除颈部区域的毛发。

然后去除残留的松散毛发，并覆盖动物以维持无菌区域。进行初次消毒时，使用酒精棉片对颈部皮肤进行消毒。随后使用0.5%氯己定溶液或2%碘溶液进行抗菌处理，并重复消毒过程两次。

通过夹捏脚趾反射确认麻醉深度后，从下颌至锁骨沿颈部皮肤做长约两厘米的纵向切口，进行皮肤切开。然后使用显微外科弯剪进行筋膜切开。用弯镊轻轻拨开唾液腺和浅层颈部肌肉，以暴露胸锁乳突肌。

确保不损伤可见的血管，并持续用生理盐水湿润手术区域，以防止组织损伤。使用显微外科剪对胸锁乳突肌进行肌膜切开，以暴露气管与颈动脉之间的区域。继续分离肌肉和筋膜，同时进行肌膜切开和筋膜切开。

接下来，在5至7毫米的深度处定位深部颈淋巴结以及传入和传出淋巴管。将固定动物的装置放置在可移动的显微镜载物台上，并使用M6螺丝牢固固定该装置，以确保成像过程中的稳定性。

使用医用胶带将预先充满生理盐水的导管固定在支架上。在动物头部一侧的加热元件下方放置一个直径为1厘米的滚轮，以保持相对于显微镜台面45度的倾斜角度。然后将固定的导管置入手术切开的颈部区域，使其位于动物锁骨附近，并打开生理盐水供应，用生理盐水填充开放的颈部腔隙。

将装有生理盐水的保护套筒下放至颈部区域，使淋巴管位于观察视野的中心。然后将保护套筒放置在气管上，注意不要施加压力。最后，根据物镜的工作距离，将非水浸式双光子物镜缓慢下放至保护套筒内的适当深度，进行颈段淋巴管的双光子成像观察。

在操作后，通过组织中伊文思蓝的积聚确认了深部颈淋巴结的成功识别。在光生物调节前后，对颈淋巴管收缩性进行了双光子监测。光生物调节显著增强了2月龄和18月龄小鼠的颈淋巴管收缩性，且增强程度相似。

定量分析显示，24月龄小鼠的颈部淋巴管收缩能力显著低于2月龄和18月龄小鼠；然而，2月龄与18月龄小鼠之间的数值差异无统计学意义。光生物调节可显著增强2月龄和18月龄小鼠的颈部淋巴管收缩能力，但在24月龄小鼠中无此效应。

注入右侧脑室的红细胞在注射后4小时可在颈部淋巴管中观察到，并在5小时时持续沿管腔移动，证实了脑部至外周的定向流动。我们的方案可在维持淋巴管收缩功能长达5小时的同时，实现对颈部淋巴管功能的活体监测。本方法具有良好的可重复性，适用于多种双光子显微镜和物镜，且在成像深度达500微米时仍能保持高质量图像。

该技术有望成为研究脑部引流系统生理学及颈部淋巴管功能的通用工具。