Name: 多模态方法评估骨骼再生与支架性能 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 了解多模态成像方法评估骨骼再生与支架性能，整合偏振光显微镜、扫描电镜和透射电镜技术，实现从宏观到纳米尺度的骨修复全面分析，为生物材料设计和骨整合研究提供关键技术支持。

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本工作得到了以下巴西机构向作者提供的资助：国家科学技术发展委员会（CNPq/Brazil）和里约热内卢州卡洛斯·查加斯·菲略研究资助基金会（FAPERJ）。我们感谢LABNANO/CBPF和CENABIO/UFRJ提供的电子&#160;显微镜设施。语言润色和语法修订使用了ChatGPT（OpenAI, GPT-5.1, 2025）完成。所有修改均经作者审阅并确认。

本方案中展示的结果来自先前一项研究中进行的实验程序21。所有操作均遵循巴西弗鲁米嫩塞联邦大学实验动物使用与护理伦理委员会（CEUA/UFF：779）的伦理指南。简言之，将20只雄性Wistar大鼠（体重介于300至400 g之间）随机分为两组：假手术组（Sham）和cHA-微球植入组。所有动物均接受手术，在胫骨干处制造一个2 mm的骨缺损。假手术组作为血凝块对照组，用于评估非临界性缺损中的骨再生情况，而实验组则在缺损部位植入CHA37微球。术后7天和21天，通过过量全身麻醉处死动物，并采集各组在两个时间点（7天和21天）的胫骨骨块。采用光学显微镜和显微CT评估骨质量及新生骨形成程度。
1. 样品固定与树脂包埋
<ol>
	<li>安乐死后立即取出含有植入生物材料的胫骨，并将其转移至含有Karnovsky固定液（2.5%戊二醛，4%甲醛溶于0.1 M卡考基酸盐缓冲液）的样品瓶中。将样品在-4 °C下保存至少1天。 
	注意：配制和操作固定液时应在通风橱内进行，以避免接触挥发性物质。所有化学品操作必须使用适当的个人防护装备（PPE），并根据需要实施额外的技术安全措施。</li>
	<li>将样品从固定液转移至含有0.1 M卡考基酸盐缓冲液的样品瓶中。保持样品在缓慢旋转条件下，每隔10分钟更换缓冲液一次，共更换2次。在此阶段，使用小型锯子修剪样品边缘，以促进树脂渗透。切割样品时应始终保持其浸润在0.1 M卡考基酸盐缓冲液中，防止干燥。 
	注意：始终确保样品所处的缓冲液体积至少为样品体积的2倍。本方案中使用的所有溶液和树脂均应遵循此原则。处理上述化学品时，应在通风橱内操作并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。将废弃的固定液和卡考基酸盐缓冲液收集于明确标识、化学兼容且盖子密封良好的容器中。遵循机构的标准操作程序（SOPs）对危险化学废物进行安全储存和处置。</li>
	<li>使用浓度递增的丙酮（10%、30%、50%、70%、90%和100%）开始脱水过程。每个浓度下保持样品旋转30分钟。100%无水丙酮步骤重复3次。 
	注意：操作丙酮时应在通风橱内进行，并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。使用后，将残留溶剂收集于明确标识、化学兼容且盖子密封良好的废液容器中。遵循机构的标准操作程序（SOPs）对危险化学废物进行安全储存和处置。</li>
	<li>通过将样品依次转移至丙酮与Spur树脂不同比例的混合液中进行渗透处理：2:1、1:1、1:2，最后使用纯树脂。每一步持续12小时，并在室温下保持旋转。完成梯度丙酮-树脂渗透后，更换纯树脂2次。最后将样品转移至含有纯树脂的模具中，并在70 °C下聚合24小时。 
	注意：树脂按照产品说明书配制以获得中等硬度。操作Spur树脂时应在通风橱内进行，并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。使用后，将残留物收集于明确标识、化学兼容且盖子密封良好的废液容器中。遵循机构的标准操作程序（SOPs）对危险化学废物进行安全储存和处置。</li>
</ol>
2. 使用微型计算机X射线断层扫描（microCT）进行样品可视化
注意：采用显微CT（microCT）评估植入物定位及骨再生情况，并有助于识别进一步分析的潜在感兴趣区域。此步骤应在样本包埋于树脂中后进行。
<ol>
	<li>使用制造商提供的样品台作为基座，确保样品固定稳妥，防止扫描过程中发生移动。可用低密度材料（如聚苯乙烯、纱布或微量离心管）对样品进行支撑。</li>
	<li>采用以下最佳扫描参数进行成像：管电压/电流 = 60 kV/133 mA；角度步长 = 0.33°；平均帧数 = 5；体素大小 = 5 µm；旋转模式 = 180°。对于含有金属植入物的样品，应采用360°旋转并使用0.5 mm铝滤片。 
	注意：在骨再生过程中，类小梁编织骨的厚度通常处于常规显微CT成像的分辨率极限范围内。为准确量化小梁骨的传统形态学参数（如小梁厚度、小梁间距和小梁数量），建议使用最小体素尺寸（如上所述为5 µm）。若在该标称分辨率下，感兴趣区域（ROI）超出视野范围（FOV），应首先使用多区域扫描（multiscan）功能对ROI进行拼接。仅当无法通过多区域扫描获取完整ROI时，才考虑增大体素尺寸。</li>
	<li>扫描完成后，原始采集数据由一系列编号的图像文件组成。使用制造商提供的软件进行重建，并重点关注最小化样品感兴趣区域内的伪影。 
	注意：图像边界处常出现伪影，尤其是在无需分析的区域。可使用制造商软件对最终重建体积进行裁剪，以去除这些区域。</li>
	<li>使用多种3D可视化软件（如Avizo、VGStudio Max、CTVox和Dragonfly22）对重建后的体积数据进行分析。应用数字图像滤波器以去除伪影。本实验中采用非局部均值去噪方法实现此目的19。 
	注意：非局部均值去噪滤波器的平滑参数应尽可能保持较低，以免模糊界面的重要细节。</li>
</ol>
3. 光学显微镜样品制备
<ol>
	<li>根据实验目的选择样本切片方向。胫骨可沿骨的长轴进行横向或纵向切片。使用横向切片可获得覆盖整个缺损体积的连续切片。纵向切片适用于评估沿长轴方向的骨再生情况，但该方法仅能提供缺损的一个单一剖面。
	<ol>
		<li>按照实验策略，使用低速金刚石锯片将样本切成1 mm厚的切片。 
		&#8203;注意：建议使用厚度为0.006至0.012英寸的金刚石锯片。较薄的刀片可实现高精度切割，并因刀片本身厚度小而减少材料损耗。</li>
		<li>向液体储槽中加液，直至液面覆盖锯片底缘。 
		&#8203;注意：蒸馏水适用于骨样本。然而，若预计会产生过度加热（例如含有金属植入物的样本），应使用设备制造商提供的油填充储槽。</li>
		<li>将样本固定在样品夹持器上，并将其连接至仪器臂。确保样本稳定且与锯片表面水平。使用定位旋钮调整样品切割区域对准锯片。</li>
		<li>开始切割时采用较高的转速设置（210–250 RPM），并施加轻压，直至样本表面形成压痕。随后降低转速（至93–124 RPM），以平稳完成切片过程并防止过度振动。</li>
		<li>切割完成后立即停止锯片运转。正确调整系统，确保样本一旦从原始块体分离即刻停止切割。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用体视显微镜检查样本。首先在低倍镜下（例如5x–10x）观察整个样本，然后根据科学问题提高放大倍数（例如20x–40x）以选择感兴趣的区域。具体放大范围可能因所用仪器而异。本研究中选择了新形成骨与生物材料之间界面密度较高的区域进行进一步分析。</li>
	<li>用于减薄的样本安装
	<ol>
		<li>将样本安装在支撑物上，以便在抛光过程中便于操作。如果样本仅用于光学显微镜分析，则使用瞬干胶将样本已预先抛光的一面直接粘附于塑料盖玻片上。 
		&#8203;注意：推荐使用塑料载片，因其具有更好的粘附性。也可使用玻璃载片（需用中性洗涤剂彻底清洗），但玻璃载片在抛光过程中会增加样本脱落的风险。</li>
		<li>对于需进一步采用关联分析方法的样本，应安装在两部分组成的铝管组件上。本方案中开发了一种自制铝管组件，包括一个直径为2.5 cm的内实心圆柱体和一个在外侧提供机械支撑的空心外圆筒。样本被固定在内实心圆柱体上。</li>
		<li>将内铝圆柱体置于加热板上，加热至适合熔化石蜡的温度（通常约为60–70 °C，具体取决于所用石蜡类型）。 
		&#8203;注意：蜂蜡也可使用。处理包埋蜡时应在通风橱内操作，并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。使用后，应将残留物收集于明确标识、化学兼容且配有合适盖子的废物容器中。遵循机构标准操作程序（SOP）进行危险化学品的安全储存与处置。</li>
		<li>在圆柱体表面涂抹少量石蜡，并使其完全熔化。</li>
		<li>熔化后，将样本感兴趣的一面朝下放置于涂有石蜡的表面，并轻轻按压以确保完全接触。 
		&#8203;注意：感兴趣面应朝向圆柱体表面，以便在相对侧进行减薄处理。避免使用过多石蜡，否则可能导致安装不平整，影响抛光质量。</li>
		<li>将圆柱体从加热板上取下，并在室温下冷却使石蜡固化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抛光过程中监测样本厚度
	<ol>
		<li>在抛光过程中，使用低至中等倍率（例如10x–20x）的反射显微镜监测样本厚度。图示说明显微镜校准及样本厚度测量方法见图2。</li>
		<li>使用标准盖玻片对显微镜Z轴进行校准，其厚度通常约为150 µm。用红色永久性记号笔标记盖玻片一侧，再用蓝色记号笔在另一侧相邻区域做标记。将盖玻片安装在玻璃载片上。</li>
		<li>使用微调焦旋钮和微米刻度尺，先聚焦于盖玻片底面，再聚焦于顶面。</li>
		<li>记录Z轴位移值。该值对应盖玻片厚度（约150 µm），作为参考基准。</li>
		<li>在抛光样本过程中，定期使用此Z轴校准方法估算样本厚度，而无需将其从铝圆柱体上取下。 
		&#8203;注意：该技术可在抛光过程中快速、无损地估算厚度。也可将样本从夹具上取下，使用数显卡尺或千分尺进行测量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>减薄与抛光
	<ol>
		<li>使用粒度为1200、2500和4100的砂纸进行粗抛和中等程度抛光。此步骤的目的是将样本减薄至约0.15 mm，同时去除明显的表面不平整。</li>
		<li>先使用1200粒度砂纸，然后过渡到2500粒度。此过程中施加轻压。在抛光期间定期使用反射显微镜监测样本厚度。</li>
		<li>达到目标厚度后，使用4100粒度砂纸对样本两面进行抛光。抛光可手动进行，或使用设定为低转速的半自动抛光机完成。每次抛光步骤中均需持续用蒸馏水彻底清洗样本。 
		&#8203;注意：抛光过程中保持样本和砂纸湿润有助于降低温度，并防止较粗糙砂纸造成的表面污染。</li>
		<li>最终抛光时，在安装于抛光盘上的毛毡抛光布上涂抹少量金刚石抛光膏（例如6 µm或3 µm）。根据样本表面粗糙度选择金刚石抛光膏的颗粒大小。 
		&#8203;注意：6 µm抛光膏适用于初步精抛，而3 µm抛光膏推荐用于最终镜面抛光。如条件允许，依次使用两种抛光膏可获得最佳效果。但仅使用6 µm抛光膏仍可实现满意的抛光效果。</li>
		<li>以最小压力轻轻抛光样本两面。在显微镜观察前，使用压缩空气或棉签干燥样本抛光面。</li>
		<li>为将样本从圆柱体上分离，使用加热板加热使石蜡熔化，并用无水丙酮清除样本上残留的石蜡。 
		注意：处理包埋蜡和无水丙酮时应在通风橱内操作，并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。使用后，应将残留物收集于明确标识、化学兼容且配有合适盖子的废物容器中。遵循机构标准操作程序（SOP）进行危险化学品的安全储存与处置。</li>
		<li>使用浸油作为封固介质，将样本夹在玻璃载片与盖玻片之间，并利用偏振光显微镜评估胶原纤维取向。从低倍镜（例如5x–10x）开始对样本进行整体观察，再提高至中等倍镜（例如20x–40x）以识别可能适合通过电子显微镜进一步探索的区域。 
		注意：若需继续进行关联分析流程并随后通过扫描电子显微镜分析样本，建议不要密封样本。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 扫描电子显微镜样品制备
<ol>
	<li>小心地将样品从载玻片上取下。使用移液器吸头轻轻将盖玻片从载玻片上滑下。用滤纸吸除多余的浸油。用中性肥皂清洗样品。在小型容器内进行清洗，以避免样品意外丢失。 
	&#8203;注意：如果样品上仍有残留的浸油，请使用蘸有70%乙醇的棉签轻轻擦拭表面进行清洁。</li>
	<li>将样品置于滤纸上自然晾干。也可使用压缩空气或棉签辅助干燥。样品完全干燥后，使用碳导电胶带将其固定在样品台上。对样品进行溅射镀膜，覆盖一层10 nm厚的金，以防止成像过程中产生电荷积累。</li>
	<li>利用双束FIB-SEM显微镜通过多种方法对样品进行分析。
	<ol>
		<li>在SEM（扫描电子显微镜）模式下，使用二次电子或背散射电子，对先前通过光学显微镜选定区域的样品形貌、生物材料以及新生骨组织界面进行评估。</li>
		<li>在聚焦离子束-扫描电子显微镜（FIB-SEM）模式下，执行切片-成像断层扫描。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在使用二次电子探测器的SEM模式下，选择先前已通过偏振光显微镜和SEM分析过的区域，继续进行切片-成像断层扫描数据采集。</li>
	<li>根据目标特征调整沟槽体积、像素尺寸和切片厚度等参数。在本实验设置中，切片-成像断层扫描的沟槽体积为15 µm × 10 µm × 10 µm，像素尺寸为20 nm，切片厚度为60 nm。建议尽可能采用各向同性的体素尺寸，以提高三维（XYZ）成像质量。 
	注意：这些参数可能因具体的FIB-SEM系统而异。请咨询设备操作人员，根据您的分析需求及系统性能确定最佳条件。</li>
</ol>
5. FIB-SEM 切片-成像断层扫描的对齐、滤波处理与分割
<ol>
	<li>切片-成像断层扫描技术可生成一系列按顺序编号的图像。为进行图像对齐，需将该图像序列转换为 MRC 文件，通常称为图像栈（stack）。</li>
	<li>使用 IMOD 软件执行 MRC 文件生成和图像栈对齐。 
	注意：其他软件（如 Avizo 和 FIJI/ImageJ）也提供图像栈对齐插件。如需详细操作指南，请参考各软件的官方文档。此外，Peddie 等人23的研究综述了图像栈对齐过程中采用的各种方法。</li>
	<li>为生成 MRC 文件，请打开终端或命令提示符，导航至包含图像序列的文件夹，并执行以下命令：tif2mrc imagerootfile*.tif stackname.mrc
	<ol>
		<li>对于非 TIFF 格式的图像，请使用 raw2mrc 命令替代。添加 -g 参数（例如 tif2mrc -g），可将 24 位 RGB 图像转换为 8 位灰度图像，从而显著减少计算时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从终端启动 Etomo，选择 对齐连续切片（Align Serial Sections） 选项。按照以下步骤对图像栈进行对齐：（1）将未对齐的图像栈加载到单个帧中；（2）使用“初始自动对齐”选项卡进行对齐；（3）使用“生成对齐图像栈（Make Aligned Stack）”选项卡生成对齐后的图像栈，然后打开该对齐图像栈。 
	注意：此过程所需时间可能为数分钟，具体取决于图像栈的大小和系统性能。</li>
	<li>完成后，请检查结果。对齐后的图像栈文件将被命名为 stackname_ali.mrc。 
	注意：本流程使用系统默认参数进行图像栈对齐。然而，用户可根据需要修改初始对齐和最终图像栈生成的相关参数。如需详细指导，请参阅 IMOD 官方文档：&#160;https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html.https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html。</li>
	<li>使用 Avizo 软件进行进一步的图像滤波处理。打开对齐后的图像栈，并依次应用以下滤波器：快速傅里叶变换（FFT）滤波器（位于 Sandbox Filter 插件中，选择垂直条纹方向，容差值设为 2）、阴影校正向导（调整掩膜范围以覆盖图像中所有阴影区域，归一化因子设为 100）、直方图均衡化（使用默认配置）以及非局部均值滤波器（参数调整为 5；0.1；10；3）。 
	注意：其他图像分析软件中也提供等效滤波器。在 FIJI/ImageJ 中，我们推荐使用以下处理流程：FFT 滤波器、背景减除（Subtract Background）、局部对比度增强（CLAHE）以及非局部均值滤波器。</li>
	<li>继续使用软件进行图像分割和三维重建。可采用多种分割策略，包括手动分割和基于阈值的分割。此外，诸如分水岭算法（Watershed algorithm）等附加工具可帮助实现分割过程的自动化，从而减少分割所需时间。</li>
</ol>
6. 透射电子显微镜样品制备
<ol>
	<li>采用聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）制备薄片，以评估骨/生物材料界面。 
	注意：如果植入的生物材料并非陶瓷或金属（如本研究所述），可使用超薄切片机制备适用于透射电子显微镜（TEM）观察的超薄切片。但需注意，切割矿化材料会显著缩短金刚石刀的使用寿命。</li>
	<li>将超薄切片在5%醋酸铀酰水溶液中进行20分钟的后染色。 
	注意：操作醋酸铀酰时，应在通风橱内进行，并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。使用后，将任何残留溶剂收集至明确标识、化学兼容且配有合适盖子的废液容器中。请遵循机构的标准操作程序（SOP），安全储存和处置危险化学废物。</li>
	<li>使用透射电子显微镜（TEM）对切片进行分析。为实现全面分析，应结合成像技术与选区电子衍射（SAED）、能量色散X射线光谱法（EDS）以及电子断层扫描技术。</li>
</ol>

<ol><li>Reznikov, N., Shahar, R., Weiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+hierarchical+structure+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Bone hierarchical structure in three dimensions.</a> Acta Biomater. 10 (9), 3815-3826 (2014).</li>
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<li>Bassim, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+damage+during+FIB+sample+preparation+of+soft+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Minimizing damage during FIB sample preparation of soft materials.</a> J Microsc. 245 (3), 288-301 (2012).</li>
<li>Witzke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Sample+Preparation+Using+Focused+Ion+Beam+and+Ultramicrotomy+of+Human+Dental+Enamel+and+Dentine+for+Multimicroscopic+Imaging+at+Micro-+and+Nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Comparative Sample Preparation Using Focused Ion Beam and Ultramicrotomy of Human Dental Enamel and Dentine for Multimicroscopic Imaging at Micro- and Nanoscale.</a> Materials. 15 (9), 3084(2022).</li>
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<li>Grandfield, K., McNally, E. A., Palmquist, A., Botton, G. A., Thomsen, P., Engqvist, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+biointerfaces+in+three+dimensions%3A+electron+tomography+of+the+bone-hydroxyapatite+interface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Royal+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Visualizing biointerfaces in three dimensions: electron tomography of the bone-hydroxyapatite interface.</a> J Royal Soc Interface. 7 (51), 1497-1501 (2010).</li>
<li>Grandfield, K., Palmquist, A., Engqvist, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+laser-modified+Ti6Al4V+and+bone+interface+revealed+with+STEM+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of laser-modified Ti6Al4V and bone interface revealed with STEM tomography.</a> Ultramicroscopy. 127, 48-52 (2013).</li>
</ol>

作者声明，他们不存在任何已知的相互竞争的经济利益或可能被认为影响本文所报告工作的个人关系。

已采用多种成像技术来研究骨组织结构，并评估生物材料在诱导骨整合方面的有效性7,21,22,23,24。在本实验方案中，我们建立了一套整合X射线显微断层扫描（microCT）、光学显微镜和电子显微镜的工作流程，用于分析在大鼠胫骨缺损植入生物材料后所形成的矿化骨组织。实施该工作流程需要大量投入，并依赖于专业仪器设备。尽管microCT和光学显微镜相对易于获取且数据采集时间适中，但高分辨率技术如聚焦离子束-扫描电子显微镜（FIB-SEM）断层成像、薄片制备以及透射电子显微镜（TEM）则需要更先进的设备。此外，切片-成像断层扫描的数据处理工作量大，单个数据集的处理可能耗时数月，尤其是在三维重建与图像分割阶段。然而，骨再生研究通常需要大量样本，因为生物学重复可能增加数据变异性，影响统计学的稳健性。为应对这一挑战，建议所有样本...

骨是一种复杂且具有层级结构的组织1,2。理解其结构组织对于回答细胞如何参与组织架构以及结构变化如何影响力学功能等基本问题至关重要3。在这一背景下，损伤后骨的重塑仍是研究的核心课题。骨折愈合是一个复杂的多阶段过程，始于最初的炎症反应，随后发生血管生成以及前体细胞向软骨细胞和成骨细胞的分化4,5。关于生物材料在促进骨整合中的作用，已有诸多讨论，特别是其生物相容性及其防止纤维包裹形成的能力6。
评估生物材料诱导骨整合的常用方法是光学显微镜，该方法可实现组织学的定量与定性分析。已有研究表明，该方法是评价骨植入物成功与否的一种可靠且有效的方式7,8。然而，与骨组织层级结构相关的若干问题无法仅通过单一成像方法进行探究3，尤其是组织学方法，其至少在一定程度上受限于该技术的放大倍数限制。
三维成像技术的进步对于理解骨组织的层级结构至关重要。诸如显微计算机断层扫描（microCT，可采用同步辐射或常规实验室X射线源）9,10,11、结合切片-成像断层技术的双束扫描电子显微镜（FIB-SEM）12,13,14以及透射电子断层成像技术15,16等方法，已在多个尺度上为骨组织结构提供了新的认识。
基于不同的三维成像方法，学者提出了一种骨组织层级结构模型，最初确定了骨结构组织的九个不同层级1。该模型近期已被修订并扩展至约12个层级，为研究骨组织结构与功能之间的关系提供了有价值的参考依据2,17。尤为重要的是，这一提出的层级模型为评估损伤后骨修复的效果奠定了基础。判断再生骨组织是否重现了天然的层级结构，是评估骨愈合质量的关键标准，尤其是在损伤部位使用生物材料的情况下。 
尽管已有讨论采用多种成像技术来研究骨组织结构6,7,18,19,20，关于整合多种成像模式以在多个空间尺度上评估骨矿物质组织的 workflow，目前研究仍十分有限。如前所述，骨是一种复杂的复合组织，由有机相（细胞、胶原和大分子）和矿化基质组成。从样品制备的角度来看，这种复杂性在溶剂渗透样品、硬组织切片以及整合不同成像策略方面带来了技术挑战&#160;同一样本。
本研究的关键创新在于建立了一种可重复、关联性强且涵盖多尺度的成像工作流程，该流程结合了三维成像与多种互补技术。如图1A所示，该工作流程的设计使得同一样本能够依次通过不同的成像模式进行检测。由于其中部分技术具有破坏性或需要切片处理，因此工作流程的顺序首先采用非破坏性方法，再逐步过渡到涉及切割或材料去除的检测手段。
该样品制备与分析工作流程广泛适用于硬质或矿化组织样本，包括皮质骨、松质骨、植入前支架，以及植入后骨/生物材料界面的评估。通过结合覆盖不同视野范围和分辨率区间的多种成像模式（图1B），该工作流程可实现从厘米尺度到微米乃至纳米尺度的样本分析。尽管该流程的顺序经过优化，可用于单个样本的关联性分析，但每种技术也可根据实验目标独立应用。该方法能够对生物材料的骨整合情况进行详细评估，并对愈合区域内的新生骨组织生长进行评价。

<table><tbody><tr><td>丙酮&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>67-64-1</td><td></td></tr><tr><td>铝制圆柱体</td><td>自制</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Avizo 版本 2022.1</td><td>ThermoFisher</td><td>n/a</td><td>用于图像滤波、分割和三维可视化的软件</td></tr><tr><td>二甲胂酸钠三水合物</td><td>Ted Pella</td><td>18851</td><td>用于配制卡考基酸缓冲液的粉末，配制 0.2 M 储存液</td></tr><tr><td>粒径为 3 &amp;micro;m 的金刚石抛光剂</td><td>Ted Pella</td><td>895-8</td><td></td></tr><tr><td>粒径为 6 &amp;micro;m 的金刚石抛光剂</td><td>Ted Pella</td><td>895-9</td><td></td></tr><tr><td>Diamond Wheel x.006</td><td>South Bay Technology</td><td>DWH 3063</td><td></td></tr><tr><td>Diamond Wheel x.012</td><td>South Bay Technology</td><td>DWH 4122</td><td></td></tr><tr><td>毛毡抛光布</td><td>Ted Pella</td><td>816-20</td><td></td></tr><tr><td>平底包埋胶囊</td><td>EMS</td><td>70021</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Knittel</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>玻璃载玻片</td><td>Knittel</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛，25%，电镜级</td><td>Ted Pella</td><td>18426/18427</td><td></td></tr><tr><td>金溅射仪 K550X</td><td>EMITECH</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院 (NIH)</td><td></td><td>用于图像对齐、滤波、分割和三维可视化的软件</td></tr><tr><td>IMOD 版本 5.1</td><td>科罗拉多大学</td><td></td><td>用于图像对齐、分割和三维可视化的软件</td></tr><tr><td>研磨与抛光机</td><td>South Bay Technology</td><td>型号 910</td><td></td></tr><tr><td>低速金刚石轮切割机&amp;nbsp;</td><td>South Bay Technology</td><td>型号 650</td><td></td></tr><tr><td>低粘度包埋试剂盒</td><td>EMS</td><td>14300</td><td>用于 SPURR 树脂的试剂盒，按照产品说明书要求配制&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Micro-CT Skyscan 1273&amp;nbsp;</td><td>Bruker</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>显微镜 Jeol 2100F 200kV&amp;nbsp;</td><td>Jeol</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>显微镜 Olympus BX51</td><td>Olympus</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>显微镜 Tescan Lyra3</td><td>Tescan</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>显微镜 Zeiss Axioplan</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td>配备一级 λ 波片</td></tr><tr><td>多聚甲醛，电镜级</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>用于配制甲醛溶液的粉末，配制 16% 储存液</td></tr><tr><td>塑料载玻片</td><td>Exakt</td><td>41500</td><td></td></tr><tr><td>QuickStick 135 粘合蜡</td><td>South Bay Technology</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>砂纸&amp;nbsp;粒度 1200</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>砂纸&amp;nbsp;粒度 2500</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>砂纸&amp;nbsp;粒度 4100</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>超级胶水</td><td>Loctite</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>水溶性冷却液&amp;nbsp;</td><td>South Bay Technology</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Whatmann 1 号滤纸</td><td>sigma</td><td>WHA1001150</td><td></td></tr></tbody></table>

评估骨再生与支架性能的多模态方法

Multimodal Approach to Assess Bone Regeneration and Scaffold Performance

植入物的临床成功在很大程度上取决于其促进骨修复和实现骨整合的能力。尽管在新型支架的设计方面已取得显著进展，但针对植入物在不同骨组织尺度上的成功效果仍缺乏充分的系统性评估。骨是一种具有层级结构的组织，其结构复杂，从纳米和微米尺度的胶原原纤维排列及其矿化，到宏观尺度上密质骨与松质骨的排列，均呈现出多级次的组织特征。这种层级结构对维持骨的功能和力学性能至关重要。因此，全面评估生物材料在多个尺度上对骨修复的影响，对于判断植入材料的有效性和安全性至关重要。然而，制备适用于整合性多模态分析的样品仍面临技术挑战。在本研究中，我们提出了一种用于评估骨再生在不同层级水平上表现的实验方案，并分析新生骨组织与植入支架之间的界面。该方法为评估支架诱导骨修复的有效性提供了可靠的技术路径。结合选用的三维和二维成像技术，对于准确评估骨愈合过程中形成的复杂矿化组织具有关键作用。

对树脂包埋样品的初步分析采用显微计算机断层扫描（microCT）进行。这种非破坏性技术可实现对整个缺损区域的三维可视化，从而对样品进行定性和定量分析。microCT成像中的对比度主要来源于样品中不同材料的密度差异。图1展示了在大鼠胫骨非临界性缺损中植入CHA37生物材料后的microCT分析结果。该样品于植入后12周采集，并按照前述树脂包埋方案进行制备。microCT分析生成了一个三维模型，揭示了样品的内部结构（图3A-B），并可区分骨组织、生物材料、树脂以及新生骨组织（图3C-D）。通过分析体积、材料碎片分布以及小梁骨与生物材料所占相对体积等参数，我们能够在微米尺度上有效表征骨组织与材料之间的相互作用24。作为此类分析的一个实例，Zelaya等人的研究<sup class="x...

我们提出了一种在多个层次水平上评估骨再生的实验方案。该多模态方法能够实现跨不同长度尺度的结构分析，有效解决了样本制备中的挑战，并为评价生物材料促进骨再生的效果提供了可靠的分析流程。

植入物的临床成功在很大程度上取决于其促进骨修复和实现骨整合的能力。尽管已有显著进展……

我们的研究评估了不同生物材料在骨组织再生过程中对骨结构的影响。由于骨组织具有多层次的层级结构，因此骨再生需要进行多尺度评估。本方案可实现对样品在不同尺度上的分析。首先，将含有植入生物材料的树脂包埋胫骨固定在样品台上，并将其连接到仪器臂上。根据所需的切片方向调整样品位置。使用低速金刚石锯片将骨组织切成约 0.7 毫米厚的切片。填充液体储液罐，直至液面完全覆盖刀片的底边。确保样品稳定，并与圆盘表面水平对齐。使用定位旋钮调整样本位置，直至目标切割区域与刀片对齐。使用较高的转速设置开始切割样品，并施加低压力，直至形成凹痕。然后降低转速，以平稳完成切片并尽量减少振动。切割完成后立即停止锯片运转。然后使用体视显微镜检查用于固定的切割样品。固定时采用自制装置，该装置由一个内层实心不锈钢圆柱体和一个外层空心圆柱体组成，后者可在抛光过程中提供机械支撑。接下来，将内层圆柱体置于加热板上，加热至约 120 至 140 摄氏度。选择合适的石蜡，将少量石蜡涂抹在加热后的圆柱体表面，并使其完全熔化。然后将待测样品的目标表面朝下放置在涂有石蜡的区域，轻轻按压样品以确保其与熔化的石蜡充分接触。随后将铝制圆柱体从加热板上取下，于室温下静置，使石蜡完全固化。进行粗磨和中等抛光时，选择粒度为1,200、2,500和4,100的砂纸，将样品厚度减薄至约0.15毫米。首先使用1,200目砂纸，然后在施加轻压的情况下使用2,500目砂纸。在抛光过程中，定期使用反射显微镜监测样品厚度。达到目标厚度后，使用400目砂纸对样品的两面进行抛光。每次抛光过程中需持续用蒸馏水清洗样品。最终抛光时，根据样品的表面粗糙度选择粒径为六微米或三微米的金刚石抛光膏。将少量金刚石抛光膏涂抹在安装于抛光盘上的毛毡抛光布上，对样品进行抛光。为使样品从圆筒上分离，可在加热板上加热蜡以融化。将装置从加热板上取下后，将样品从圆筒中取出。然后使用最小压力轻轻抛光样品的两侧，并用滤纸擦干抛光后的表面。在显微镜分析之前，使用浸油作为封固介质，将样品置于载玻片和盖玻片之间进行封片。采用偏振光显微镜观察胶原纤维的取向，起始放大倍数为5倍至10倍的低倍镜。 最后，制备样品用于扫描电子显微镜观察，以进一步分析骨-生物材料界面。在完成抛光和初步的光学显微镜检查后，样品的内在特征使得在光学显微镜下识别的区域能够与显微计算机断层扫描数据集中的相应位置相对应。偏振光显微镜可区分原有的骨组织（显示为蓝色）与愈合过程中新形成的骨组织（显示为橙色）。高倍偏振光显微镜观察显示，新形成的骨组织与原有的皮质骨紧密相邻，在较薄的区域中，Ⅰ型胶原纤维呈垂直方向排列。扫描电子显微成像实现了对感兴趣区域的精确定位。随后采用切片-成像断层扫描技术对所选区域的三维结构进行了进一步分析。沟槽断面显示出正在生长的小梁骨的骨形态。透射电子显微镜可对骨-生物材料界面进行纳米尺度的观察，并可结合选区电子衍射进行分析。选区电子衍射图谱表明，生物材料区域和骨组织区域均由羟基磷灰石晶体构成。对成像界面区域进行的能谱X射线元素映射显示存在磷和钙。该多模态工作流程提供了单一成像技术无法实现的互补性信息。该工作流程需要耗费大量时间，依赖专业技术知识，并需使用专用仪器设备。它可以研究功能相关性、长期骨重塑以及生物材料设计。

multimodal-approach-to-assess-bone-regeneration-scaffold

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

多模态方法评估骨骼再生与支架性能

人类血管周围干细胞（PSCs）是一类新型干细胞，可用于骨骼组织再生，其功能类似于间充质干细胞（MSCs）。PSCs可通过FACS（荧光激活细胞分选）从标准吸脂手术中获取的脂肪组织中分离，随后与成骨诱导性支架材料结合，以实现骨形成。 体内.

使用人血管周围干细胞进行骨再生

本文介绍了一种逐步构建具有工程化微通道的类骨模板的通用方法。通过微通道的毛细作用，展示了该模板的高吸收和高保留能力。...

类骨模板中微通道的独特毛细作用可增强细胞募集以修复大段骨缺损

自体和同种异体骨移植是治疗严重颅面骨缺损的公认方法。然而，移植物成分对血管新生、细胞分化与骨形成之间相互作用的影响尚不明确。本文介绍一种多模态成像方案，旨在阐明移植物邻近区域血管生成与成骨作用之间的相互依赖关系。...

利用计算机断层扫描和光学成像技术研究颅骨自体移植与异体移植中成骨-血管生成偶联以评估骨整合

此处，我们介绍一种用于可视化血管形成的实验方案 体内 通过多光子显微镜在三维支架中实时观察。在转基因支架中的血管生成研究采用小鼠颅骨临界骨缺损模型。治疗组中检测到的新血管数量多于对照组。...

通过多光子显微镜观察血管生成 在体 内 用于颅骨临界骨缺损修复的基因修饰3D-PLGA/nHAp支架

本文介绍了一种在小鼠体内构建并进行活体成像不同类型人源化骨髓微环境的方法。该方法基于人源间充质细胞所构建的支持性微环境，通过添加人源内皮细胞可诱导形成人源血管，而添加重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）则可诱导形成人-鼠嵌合的成熟骨组织。...

人源化骨髓微环境的小鼠生物工程构建及其活体成像可视化

用于修复大段骨缺损的新型生物材料数量正在持续增加，旨在促进骨愈合并克服与骨移植相关的并发症。本文介绍了一种用于骨修复生物材料临床前生物相容性测试的多学科策略。...

骨再生用生物材料的生物学相容性评价

在本研究中，我们详细描述了脱细胞化、物理表征、成像以及 体内...

脱细胞苹果来源支架在骨组织工程中的应用 体外 和 体内

体内骨类器官法用于获取治疗性造血干细胞/祖细胞

本方案提出一种综合性方法，通过多模态分析手段在全球范围内评估骨再生过程中的骨形成情况。该方法旨在提供有关新骨形成定性与定量的信息，从而提高基础研究和临床前研究的严谨性与有效性。...

体外模型中组织矿化的全面表征

本文介绍了一种在绵羊膝关节中制备可控性骨软骨缺损的整合性实验方案，旨在建立适用于骨与软骨组织再生研究的实验模型。该方案详细阐述了在股骨髁上诱导全层骨软骨缺损的方法，采用的技术可最大限度减少对动物福利的影响，并降低实验结果的变异性。...

建立与评估一种全层骨软骨缺损的绵羊模型

本研究建立了一种大鼠股骨半节段性缺损模型，用于评估骨替代材料在无内固定或外固定条件下承受负荷时的力学性能和成骨性能。...

用于评估承重区域骨替代材料性能的大鼠半节段性骨干骨缺损模型

了解多模态成像方法评估骨骼再生与支架性能，整合偏振光显微镜、扫描电镜和透射电镜技术，实现从宏观到纳米尺度的骨修复全面分析，为生物材料设计和骨整合研究提供关键技术支持。

评估骨再生与支架性能的多模态方法

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