评估骨再生与支架性能的多模态方法

我们的研究评估了不同生物材料在骨组织再生过程中对骨结构的影响。由于骨组织具有多层次的层级结构，因此骨再生需要进行多尺度评估。本方案可实现对样品在不同尺度上的分析。

首先，将含有植入生物材料的树脂包埋胫骨固定在样品台上，并将其连接到仪器臂上。根据所需的切片方向调整样品位置。使用低速金刚石锯片将骨组织切成约 0.7 毫米厚的切片。

填充液体储液罐，直至液面完全覆盖刀片的底边。确保样品稳定，并与圆盘表面水平对齐。使用定位旋钮调整样本位置，直至目标切割区域与刀片对齐。

使用较高的转速设置开始切割样品，并施加低压力，直至形成凹痕。然后降低转速，以平稳完成切片并尽量减少振动。切割完成后立即停止锯片运转。

然后使用体视显微镜检查用于固定的切割样品。固定时采用自制装置，该装置由一个内层实心不锈钢圆柱体和一个外层空心圆柱体组成，后者可在抛光过程中提供机械支撑。接下来，将内层圆柱体置于加热板上，加热至约 120 至 140 摄氏度。

选择合适的石蜡，将少量石蜡涂抹在加热后的圆柱体表面，并使其完全熔化。然后将待测样品的目标表面朝下放置在涂有石蜡的区域，轻轻按压样品以确保其与熔化的石蜡充分接触。随后将铝制圆柱体从加热板上取下，于室温下静置，使石蜡完全固化。

进行粗磨和中等抛光时，选择粒度为1,200、2,500和4,100的砂纸，将样品厚度减薄至约0.15毫米。首先使用1,200目砂纸，然后在施加轻压的情况下使用2,500目砂纸。在抛光过程中，定期使用反射显微镜监测样品厚度。

达到目标厚度后，使用400目砂纸对样品的两面进行抛光。每次抛光过程中需持续用蒸馏水清洗样品。最终抛光时，根据样品的表面粗糙度选择粒径为六微米或三微米的金刚石抛光膏。

将少量金刚石抛光膏涂抹在安装于抛光盘上的毛毡抛光布上，对样品进行抛光。为使样品从圆筒上分离，可在加热板上加热蜡以融化。将装置从加热板上取下后，将样品从圆筒中取出。

然后使用最小压力轻轻抛光样品的两侧，并用滤纸擦干抛光后的表面。在显微镜分析之前，使用浸油作为封固介质，将样品置于载玻片和盖玻片之间进行封片。采用偏振光显微镜观察胶原纤维的取向，起始放大倍数为5倍至10倍的低倍镜。

最后，制备样品用于扫描电子显微镜观察，以进一步分析骨-生物材料界面。在完成抛光和初步的光学显微镜检查后，样品的内在特征使得在光学显微镜下识别的区域能够与显微计算机断层扫描数据集中的相应位置相对应。偏振光显微镜可区分原有的骨组织（显示为蓝色）与愈合过程中新形成的骨组织（显示为橙色）。

高倍偏振光显微镜观察显示，新形成的骨组织与原有的皮质骨紧密相邻，在较薄的区域中，Ⅰ型胶原纤维呈垂直方向排列。扫描电子显微成像实现了对感兴趣区域的精确定位。随后采用切片-成像断层扫描技术对所选区域的三维结构进行了进一步分析。

沟槽断面显示出正在生长的小梁骨的骨形态。透射电子显微镜可对骨-生物材料界面进行纳米尺度的观察，并可结合选区电子衍射进行分析。选区电子衍射图谱表明，生物材料区域和骨组织区域均由羟基磷灰石晶体构成。

对成像界面区域进行的能谱X射线元素映射显示存在磷和钙。该多模态工作流程提供了单一成像技术无法实现的互补性信息。该工作流程需要耗费大量时间，依赖专业技术知识，并需使用专用仪器设备。

它可以研究功能相关性、长期骨重塑以及生物材料设计。