Name: 通过在旋转盘共焦点上进行全细胞超分辨率成像，并结合光学光子重分配 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 学习使用旋转盘共聚焦显微镜结合光学光子重分配技术进行全细胞单分子定位显微成像的方法。该方案无需定制光学系统即可实现DNA-PAINT高分辨率成像，为神经科学研究提供可靠的技术支持。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由人类前沿科学计划组织（Human Frontier Science Program Organization, HFSP）资助，向 CZ 提供跨学科博士后奖学金（LT0025/2023-C），以及由工程与物理科学研究理事会向 M.T.（EP/R513143/1 和 EP/W524335/1）和 O.P.L.D（EP/R513143/1 和 EP/T513064/1）提供的资助。S.S. 还获得了英国皇家学会多萝西·霍奇金奖学金（DHF\R1\191019 和 DHF\R\251006）的支持。本工作还得到了陈-扎克伯格倡议基金（Chan Zuckerberg Initiative，项目编号 2023-321188）和英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSCR，项目编号 BB/Y513064/1）向 S.S. 提供的资助。

<ol><li>Lelek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Single-molecule localization microscopy.</a> Nat Rev Methods Primers. 1 (1), 39(2021).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li>
<li>Vignolini, T., Capitanio, M., Caldini, C., Gardini, L., Pavone, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+light+sheet+allows+volumetric+super-resolution+imaging+of+efflux+pumps+distribution+in+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly inclined light sheet allows volumetric super-resolution imaging of efflux pumps distribution in bacterial biofilms.</a> Sci Rep. 14 (1), 12902(2024).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oblique-plane+single-molecule+localization+microscopy+for+tissues+and+small+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals.</a> Nat Methods. 16 (9), 853-857 (2019).</li>
<li>Ghosh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+molecular+interplay+of+CD20+and+therapeutic+antibodies+with+fast+volumetric+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy.</a> Science. 387 (6730), eadq4510(2025).</li>
<li>Wäldchen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Cell+imaging+of+plasma+membrane+receptors+by+3D+lattice+light-sheet+d+STORM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Whole-Cell imaging of plasma membrane receptors by 3D lattice light-sheet d STORM.</a> Nat Commun. 11 (1), 887(2020).</li>
<li>Zagato, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+devices+for+single+objective+single+plane+illumination+microscopy+%28SoSPIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+express%22%5BJournal%5D)">Microfabricated devices for single objective single plane illumination microscopy (SoSPIM).</a> Opt express. 25 (3), 1732-1745 (2017).</li>
<li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+high-and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">3D high-and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nat Methods. 12 (7), 641-644 (2015).</li>
<li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+J+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%22">Handbook of biological confocal microscopy</a>. 236, Springer Science & Business Media. (2006).</li>
<li>Schueder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3D+super-resolution+imaging+of+whole+cells+using+spinning+disk+confocal+microscopy+and+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT.</a> Nat Commun. 8 (1), 2090(2017).</li>
<li>Azuma, T., Kei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+spinning-disk+confocal+microscopy+using+optical+photon+reassignment%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment.</a> Opt Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).</li>
<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instant+super-resolution+imaging+in+live+cells+and+embryos+via+analog+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Instant super-resolution imaging in live cells and embryos via analog image processing.</a> Nat Methods. 10 (11), 1122-1126 (2013).</li>
<li>Zaza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+in+whole+cells+and+tissues+via+DNA-PAINT+on+a+spinning+disk+confocal+with+optical+photon+reassignment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging in whole cells and tissues via DNA-PAINT on a spinning disk confocal with optical photon reassignment.</a> Nat Commun. 16 (1), 4991(2025).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+kinetics+and+super-resolution+microscopy+by+fluorescence+imaging+of+transient+binding+on+DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Single-molecule kinetics and super-resolution microscopy by fluorescence imaging of transient binding on DNA origami.</a> Nano Lett. 10 (11), 4756-4761 (2010).</li>
<li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li>
<li>Thevathasan, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pores+as+versatile+reference+standards+for+quantitative+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super-resolution microscopy.</a> Nat Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3D+cellular+super-resolution+imaging+with+DNA-PAINT+and+Exchange-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT.</a> Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
<li>Ober, R. J., Ram, S., Ward, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+accuracy+in+single-molecule+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Localization accuracy in single-molecule microscopy.</a> Biophys J. 86 (2), 1185-1200 (2004).</li>
<li>Tetley, R., Vaughan, A., Zaza, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTetley%2C+R+%22NIS-Elements+JOB+for+DNA-Paint+Acquisition+at+Serial+Z-Planes%22">NIS-Elements JOB for DNA-Paint Acquisition at Serial Z-Planes</a>. , (2025).</li>
<li>Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+estimate+the+average+localization+precision+of+a+single-molecule+localization+microscopy+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment.</a> Histochem Cell Biol. 141, 629-638 (2014).</li>
<li>Schlichthaerle, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+single+nuclear+pore+complex+proteins+using+genetically-encoded+probes+for+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of single nuclear pore complex proteins using genetically-encoded probes for DNA-PAINT.</a> Angew Chem. 131 (37), 13138-13142 (2019).</li>
<li>Stehr, F., Stein, J., Schueder, F., Schwille, P., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat-top+TIRF+illumination+boosts+DNA-PAINT+imaging+and+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Flat-top TIRF illumination boosts DNA-PAINT imaging and quantification.</a> Nat Commun. 10 (1), 1268(2019).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li>
<li>Whelan, D. R., Bell, T. D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+artifacts+in+single+molecule+localization+microscopy%3A+why+optimization+of+sample+preparation+protocols+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters.</a> Sci Rep. 5 (1), 7924(2015).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+microtubule+ultrastructure+based+on+single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of microtubule ultrastructure based on single-molecule localization microscopy.</a> Cytoskeleton. , (2025).</li>
<li>Steen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-PAINT+palette%3A+A+comprehensive+performance+analysis+of+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The DNA-PAINT palette: A comprehensive performance analysis of fluorescent dyes.</a> Nat Methods. 21 (9), 1755-1762 (2024).</li>
<li>Kessler, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-quenched+fluorophore-DNA+labels+for+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Self-quenched fluorophore-DNA labels for super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Phys Chem B. 128 (28), 6751-6759 (2024).</li>
<li>Kessler, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-quenched+fluorophore+dimers+for+DNA-PAINT+and+STED+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Self-quenched fluorophore dimers for DNA-PAINT and STED Microscopy.</a> Angew Chem Int Ed. 62 (39), e202307538(2023).</li>
<li>Chung, K. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+DNA-PAINT+for+faster%2C+low-background+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic DNA-PAINT for faster, low-background super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 19 (5), 554-559 (2022).</li>
</ol>

作者声明无任何利益冲突。

超分辨荧光显微镜突破了衍射极限，显著提高了空间分辨率。然而，其在生物研究中的广泛应用仍面临持续挑战。特别是视场（FOV）、分辨率和穿透深度之间的权衡，使得难以同时优化这三个因素。通过结合单分子定位显微镜（SMLM）与光学光子重分配增强的转盘共聚焦显微镜（SDC-OPR）的优势，上述问题得到了解决。通过在标准SDC配置中集成微透镜阵列（由商用SDC-OPR系统实现），提高了光子收集效率，同时减小了有效针孔尺寸，从而显著提升了分辨率。与标准SDC相比，SDC-OPR系统在分辨能力方面表现出明显提升，在焦平面内成功区分了相距10 nm14的结构，而标准SDC仅能分辨大于20 nm的距离11。这种增强的分辨能力凸显了光子重分配在实现分子尺度分离方面的优势。具体而言，在焦平面（z = 0 µm）实现了低于2 nm的横向定位精度，在深度达9 µm时横向定位精度仍保持在10 nm以下，同时具备高度可调的视场，分别为53 × 53 µm²或76 × 76 µm²。即使在211 × 211 µm²的大视场下，系统仍实现了9.5 nm的平均面内定位精度。这些结果突显了该系统在整个细胞范围内进行高分辨率成像的能力。
针对所用不同抗体的偶联反应，必须严格遵循方案以确保抗体与DNA的比例达到最佳。&#160;若该比例过高，可能会降低定位精度，并对定量测量（如qPAINT25中进行的测量）产生不利影响。因此，必须使用微量紫外-可见分光光度计验证该比例，确保DNA与抗体的最终比例为1:1。
获得高质量微管超分辨率图像的关键步骤是适当的固定。仅依赖高浓度多聚甲醛（PFA）的传统固定方法常常会破坏微管结构。相比之下，单独使用戊二醛（GA）或将其与PFA联合使用可显著改善结构的保存效果26,27。
为了获得最佳成像效果，必须使用高数值孔径（NA）物镜，以最大化单分子事件中的光子收集效率。在商用 SDC-OPR 系统中，激光功率被有意设置得低于用于 SMLM 的传统全内反射荧光（TIRF）显微镜，以尽量减少样品的光漂白。尽管 DNA-PAINT 可消除光漂白的顾虑，并理论上可采用更高的激光功率，但目前的商用系统仍存在限制，导致其曝光时间相较于 TIRF 照明更长。此外，由于 SDC-OPR 的照明方式为共聚焦，分子在曝光期间不会被持续激发。因此，与连续 TIRF 照明相比，需要更长的曝光时间；在本研究中，采用的曝光时间为 300 ms。然而，根据特定实验的分辨率需求，也可使用更短的积分时间（例如 150–200 ms），而分辨率损失极小28。
优化成像链的浓度是确保单分子信号保持良好分离，同时仍能产生足够定位点以实现精确重构的关键步骤。这一调整类似于标准的单分子定位显微镜（SMLM）成像过程，需精确控制事件密度与信号重叠之间的平衡。针对不同的靶标，应调整其最佳成像链浓度。例如，对于微管，建议初始成像链浓度低于1 nM，并根据需要进行调整。
在长时间采集过程中保持稳定的焦距至关重要，因为轴向（z）漂移无法在后期处理中校正。横向（xy）漂移可以被补偿 通过 RCC 或定位标记。在此设置中，显微镜的完美聚焦系统（PFS）可确保数小时成像过程中的焦点稳定性。
综上所述，将单分子定位显微镜（SMLM）与旋转盘共聚焦光学投影层析成像（SDC-OPR）相结合，为在完整细胞内部深处实现高分辨率成像提供了一个强大的平台，克服了传统成像技术在分辨率、成像深度和视场（FOV）之间的权衡限制。然而，要充分发挥该系统的潜力，必须严格控制实验条件，从抗体偶联与固定，到图像采集参数设置及数据处理，每一步都至关重要。从样品制备到漂移校正的每一个环节，均对获得可靠且高精度的数据起着关键作用。通过仔细优化实验方案，该方法为在复杂的生物样品中进行定量的纳米级成像提供了一种稳健且灵活的解决方案。本实验方案有望帮助科研界更广泛地采用单分子定位显微技术，并从那些使用传统全内反射（TIRF）或高倾斜照明（HILO）难以成像的样品层面获取超分辨图像。上述目标均可借助目前在全球各地显微成像平台普遍配备的商业化显微镜系统实现。
就其他及未来应用而言，该方法不仅适用于全细胞样品，也适用于成像深度更大的复杂组织样品，此前的研究已对此进行了验证。14与需要物理切片的方法不同，该技术能够对完整组织进行三维成像，保留其天然结构，并减少因物理切片引入的人工假象。使用较小的亲和探针（如纳米抗体）相较于全长抗体可进一步增强组织渗透性，从而实现对厚样本更均匀的标记。该方法为研究细胞空间组织及分子分布提供了可能 原位 保真度更高。除了这些应用外，该策略还可用于纳米结构和生物分子组装体的高通量筛选，从而实现对结构异质性与功能的系统性研究。此外，DNA-PAINT 的最新进展已开发出自猝灭成像探针，这类探针基于染料-猝灭剂或染料-染料相互作用29,30,31可有效降低背景信号、增强荧光强度并提高空间分辨率，从而实现更快的成像速度。将这些荧光探针整合到 SDC-OPR 框架中，有望进一步提升成像速度与分辨率。将这些技术进步与 SDC-OPR 系统的优势相结合，可拓展其在更复杂生物样本中的应用，使该平台成为在多种组织中精细解析细胞与分子结构的灵活工具。

单分子定位显微镜技术（SMLM）1 是一类通过在时间上分离单个荧光分子的发射信号并以高精度对其进行定位，从而实现纳米级分辨率的超分辨率成像技术。成功的单分子定位显微镜（SMLM）需要高信噪比（SNR）以检测单分子事件，这传统上限制了其应用范围，仅限于能够提供强而局域化激发光的光学系统。最常见的配置是全内反射荧光（TIRF）2 显微镜与高倾斜层光照明（HILO）3TIRF 通过产生倏逝场，选择性地激发盖玻片表面数纳米范围内的荧光分子，从而降低背景荧光，抑制非焦平面的照明。然而，这种限制使得 TIRF 不适用于对延伸至细胞外区域的深层生物结构（如细胞器）进行成像。HILO 显微镜可实现更大的穿透深度，允许在玻璃基底上方数百纳米范围内进行成像，但代价是视场（FOV）减小。4 以及随着焦平面升高而出现的照明不均，限制了其在较大细胞结构中的应用。最近，诸如晶格光片显微镜（lattice light-sheet）等光片显微镜（LSM）技术5,6,7 单目标单平面照明显微镜（soSPIM）8 已将SMLM拓展至三维及组织尺度成像。通过将激发光束塑造成薄而结构化的光片，LSM实现了光学切片，同时降低了背景信号与光毒性。soSPIM可在单次曝光中捕获与检测轴正交的焦平面，从而实现具有近各向同性分辨率的快速三维成像。soSPIM的应用已实现在完整细胞及小型细胞器中的三维SMLM&#62;20 µm 深度，各向同性分辨率达到40 nm，且背景离焦信号极低9尽管这些方法具有优势，但通常需要透明的样本、专用的光学设备和复杂的校准，且在较厚的样本中仍对光学像差和散射敏感。
共聚焦显微镜通过在探测器前使用针孔并结合光束扫描镜，排除离焦光线，从而提供了一种替代方案10。这种光学切片能力可实现高信噪比（SNR）的深层三维成像。特别是旋转盘共聚焦（SDC）显微镜，结合了传统成像的高速性和宽场探测优势，以及点扫描系统的光学切片能力。在传统SDC中，这一目标通过采用带有平行针孔的旋转圆盘实现，通常还配合使用对齐的微透镜阵列。微透镜收集大部分发射的荧光信号，并将其聚焦穿过针孔，从而降低背景信号。该配置可在无需特殊光学元件或额外样品制备的情况下实现快速光学切片，是一种稳健的技术方案，易于实施并优化，适用于深层三维单分子定位显微镜（SMLM）图像采集11。
本研究采用了配备光学光子重分配技术（SDC-OPR）的 CSU-W1 转盘共聚焦扫描装置。与标准转盘共聚焦（SDC）不同，SDC-OPR 引入了第二组微透镜阵列，将发射的光子投射到互补的针孔图案上12，从而减少散射并回收原本会被丢弃的光子。这种光子重分配技术能有效锐化点扩散函数（PSF），在保持排除离焦光能力的同时，进一步提升横向分辨率13。具体而言，SDC-OPR 的微透镜阵列将离轴光子重定向至其最接近的来源点，从而相比标准 SDC 有效提高检测到的荧光亮度。此外，通过图像去卷积可进一步放大 SDC-OPR 的分辨率优势。via 迭代去卷积算法可在计算上优化 PSF、降低背景噪声，并提高信背比，而无需改变光学配置。这种联合方法在单分子定位实验中，相较于标准 SDC 显著提升了定位精度14。
本文介绍了一种利用配备光学光子重分配（SDC-OPR）功能的转盘共聚焦显微镜进行单分子定位显微成像的稳健且可重复的实验方案。该方法结合了DNA-PAINT的纳米级定位精度与转盘成像的速度、视场（FOV）以及深度穿透能力。DNA-PAINT是点累积成像纳米级拓扑结构（PAINT）技术的一种改进形式15，其原理依赖于荧光标记的“&#34;成像链&#34;”与锚定在分子靶标上的互补“&#34;停靠链&#34;”之间的瞬时杂交。这些可逆的结合事件产生随机的荧光信号，可被精确定位，从而实现对细胞超微结构的高分辨率重建。DNA-PAINT能够使用光稳定性极高的荧光染料，通过可调节的结合动力学精确控制成像条件，并且由于荧光成像链的持续补充，有效减轻了光漂白现象16。
为确保可重复性和特异性，该方法依赖于定制的DNA-抗体偶联物，以将锚定链连接至二抗。文中详细介绍了包括抗体-DNA偶联在内的样品制备步骤，以支持可靠的实验结果。本方案已在核孔复合体（NPCs）等特征明确的细胞结构上得到验证。17 以及固定样品中的微管，为评估重建准确性提供了参考点。分辨率的差异通过量化分析得出 通过 以定位精度作为代理指标，进一步评估其随视场（FOV）和成像深度的变化关系。
此外，本工作流程在多重成像中的高效性通过Exchange-PAINT18得以展示，这是一种基于DNA-PAINT的策略，能够在同一染料和单一激光光源下实现多个靶标的顺序可视化。Exchange-PAINT工作流程被应用于同一样本中线粒体、微管和核孔复合体（NPCs）的多色超分辨率成像。
综上所述，本实验方案为抗体-DNA偶联、样品制备、成像条件及数据分析提供了全面的指导和关键的适应性说明，使研究人员能够在SDC-OPR系统上实现可重复的DNA-PAINT成像。该方法突破了基于TIRF技术在成像深度和视场范围上的限制，从而拓展了单分子定位显微镜（SMLM）在多种生物体系中的应用范围。

<table><tbody><tr><td>(&amp;plusmn;)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸</td><td>Merck&amp;nbsp;</td><td>238813-5G</td><td>Trolox</td></tr><tr><td>3,4-二羟基苯甲酸&amp;nbsp;</td><td>Merck&amp;nbsp;</td><td>37580-25G-F</td><td>PCA</td></tr><tr><td>60&amp;times; Apo NA 1.49 物镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7.0 KDA 离心脱盐柱（含尺寸排阻树脂）&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>89882</td><td>Zeba Spin Desalting Columns 用于步骤 2.4</td></tr><tr><td>Accutase - 酶解细胞解离液</td><td>Promo Cell</td><td>C-41310</td><td></td></tr><tr><td>羊驼单域抗体 (1H1) 抗-GFP 偶联定制 DNA（sdAB-5&amp;rsquo;-TCCTCCTCCTCCT-3&amp;rsquo;）</td><td>Massive Photonics</td><td>Custom product</td><td>果蝇用抗-GFP 纳米抗体</td></tr><tr><td>羊驼单域抗体 (1H1) 抗-GFP 偶联 DNA</td><td>Massive Photonics</td><td>MASSIVE-TAG-Q-FAST anti-GFP - F3</td><td>NUP 用抗-GFP 纳米抗体</td></tr><tr><td>抗α-微管蛋白抗体 (YL1/2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA1-80017</td><td></td></tr><tr><td>抗兔 IgG 抗体</td><td>Massive Photonics</td><td>Massive-sdAB-FAST 2-Plex, Secondary sdAB F2</td><td></td></tr><tr><td>抗 TCR&amp;zeta; 抗体 (6B10.2)</td><td>BioLegend</td><td>644102</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Merck&amp;nbsp;</td><td>A4503-10G</td><td>BSA</td></tr><tr><td>15 mL 锥形离心管</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>17705004</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形离心管</td><td>VWR International</td><td>734-0448</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1 SoRa</td><td>Nikon</td><td></td><td>SDC-OPR 显微镜</td></tr><tr><td>含 Sephadex G-25 的脱盐离心柱（用于 DNA 纯化的尺寸排阻树脂）&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11743309</td><td>品牌：Cytiva。步骤 2.5 使用的 G-25 柱</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Merck&amp;nbsp;</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>无水 DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>DTT&amp;nbsp;（二硫苏糖醇）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15976082</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Marck</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Serva</td><td>2311402</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Merck&amp;nbsp;</td><td>G5516-500ML&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>MP Biomedicals</td><td>219482580</td><td></td></tr><tr><td>马来酰亚胺-PEG2-琥珀酰亚胺酯&amp;nbsp;</td><td>Merck&amp;nbsp;</td><td>746223-50MG</td><td></td></tr><tr><td>McCoy's 5A 培养基</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>16600082</td><td></td></tr><tr><td>MES（2-(N-吗啉代)乙磺酸）</td><td>Merck</td><td>M3671-50G</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>32213-25L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10418464</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL 微量离心管</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11508232</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>10509691&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>微量紫外-可见分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td>Nanodrop</td></tr><tr><td>NaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6546-1L&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>90 nm 金纳米颗粒</td><td>Cytodiagnostics</td><td>G-90-100</td><td></td></tr><tr><td>Orca Fusion-BT cmos 相机</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td>P/S</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（1× 溶液）</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11530546</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Pierce 16% 甲醛（w/v），无甲醇</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11586711</td><td>PFA</td></tr><tr><td>氯化钾&amp;nbsp;</td><td>Merck&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>原儿茶酸 3,4-双加氧酶 &amp;nbsp;</td><td>Merck&amp;nbsp;</td><td>P8279-25UN&amp;nbsp;</td><td>PCD</td></tr><tr><td>氢氧化钠&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>12963614</td><td></td></tr><tr><td>TOM20 抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab186735</td><td></td></tr><tr><td>Tris 缓冲液</td><td>VWR International</td><td>A4577.1000</td><td></td></tr><tr><td>Triton&amp;nbsp;X-100&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>VWR International</td><td>1086031000</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck&amp;nbsp;</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>超滤离心滤膜装置，100 kDa 截留分子量</td><td>Merck&amp;nbsp;</td><td>UFC510024</td><td>制造商：Amicon Ultra</td></tr><tr><td>&amp;mu;-Slide 8 孔高玻璃底培养皿</td><td>Ibidi</td><td>IB-80807</td><td></td></tr><tr><td>&amp;mu;-Slide VI 0.5 玻璃底培养皿</td><td>Ibidi</td><td>IB-80607</td><td></td></tr></tbody></table>

全细胞超分辨率成像 通过 使用光学光子重分配的旋转盘共聚焦显微镜进行dna-paint成像

Whole-cell Super-Resolution Imaging via DNA-PAINT on a Spinning Disk Confocal with Optical Photon Reassignment

单分子定位显微镜（SMLM）能够对细胞结构进行纳米尺度成像，但由于全内反射荧光（TIRF）和高倾斜光片（HILO）照明的局限性，通常仅限于盖玻片附近的成像。本文介绍了一种利用配备光学光子重分配技术（SDC-OPR）的转盘共聚焦显微镜在完整细胞中实现SMLM的实验方案。该方法结合DNA点积累纳米拓扑成像技术（DNA-PAINT），无需定制光学元件或复杂的照明方案，即可在整个细胞体积内实现高精度的单分子成像。本方案逐步说明如何配置商用转盘显微镜（例如CSU-W1 SoRA）以进行SMLM成像，包括针对深层成像优化的采集参数。同时概述了使用DNA偶联探针对细胞内靶标进行标记的样品制备步骤，涵盖多个靶标多色成像的策略。图像采集后，可使用标准软件包进行单分子定位与图像重建。文中还讨论了降低背景信号、优化横向分辨率以及确保全细胞深度范围内成像质量的关键注意事项。该易于实施的方案使研究人员能够利用标准共聚焦设备开展深层、全细胞SMLM研究，从而拓展单分子成像可解决的生物学问题范围，突破近膜区域的限制。

为了展示SDC-OPR系统在超分辨率成像方面的性能（图1A），通过进行 DNA-PAINT 成像实验评估其平面内分辨率（图1B) 关于核孔复合体（NPCs），其作为一种生物学参考结构17. 图1C 显示了U2OS细胞中核孔素96（Nup96）的代表性DNA-PAINT SDC-OPR图像，该蛋白标记有单体增强型绿色荧光蛋白（mEGFPs），并用DNA偶联的抗GFP纳米抗体进行标记。放大图显示了NUP的亚结构， 图1D 显示成对的Nup96蛋白（由箭头指示），符合核孔预期的8重对称性。在 图1E，通过将Nup96对进行比对并对叠加图像的横截面直方图进行绘图，测量了Nup96对之间的欧几里得距离（n = 16对）。分析结果显示其峰间距离为（13 ± 2）nm图1E)，与EM模型以及HILO和TIR成像的结果一致23每个峰拟合显示标准偏差为4 nm，证实了高定位精度（σSMLM = 3.3 nm，NeNA = 4.4 nm），该精度在53 × 53 µm²的整个视场范围内均得以保持，这在基于共聚焦的系统中极为出色。
为展示多色成像能力，对U2OS细胞中的Nup96、线粒体和微管进行了DNA标记，用于Exchange-PAINT18成像。该技术采用与单一荧光染料偶联的正交DNA成像链，使所有靶标均可由同一激光源激发（图2A）。该方法并非同时采集信号，而是通过连续成像轮次将信号分离，从而可简便地整合到任意商用的SDC-OPR系统中。图2B显示了以抗GFP纳米抗体标记呈蓝色的Nup96、以抗TOM20二抗标记呈红色的线粒体，以及以抗α-微管蛋白一抗标记呈绿色的微管。值得注意的是，在单色Nup96成像中获得的优异单分子定位精度在多靶标实验中得以在所有靶标上保持，其定位精度值分别为：核孔复合体（NPC）3.9 nm、α-微管蛋白4.0 nm、线粒体3.3 nm（图2B的图板1、2和3）。
对于大视场成像，使用SDC-OPR系统上可用的不同放大倍数结合不同的相机像素合并设置，对HeLa细胞中的微管进行了成像，以保持78 nm至108 nm之间的像素尺寸（图3）。图3A展示了10个HeLa细胞的微管细胞骨架，颜色表示定位精度。在1×放大倍数下，平均定位精度明显劣于更高放大倍数下的结果（图3B-D），且变异性更大。这是由于在更大的视场中激光功率密度降低，高斯照明轮廓变得明显，导致视场边缘区域的定位精度下降。尽管如此，在基于共聚焦的系统中，能够在211 × 211 µm²的广阔视场范围内实现9.5 nm的平均定位精度，已属优异，可支持对生物学异质性的高分辨率研究。
最后，通过使用系统的最高放大倍数（4×，53 × 53 µm² 视场），在约 500 nm 厚度、1 µm z 步进的共聚焦体积内对固定化的 HeLa 细胞中微管网络进行 DNA-PAINT 成像，展示了对完整细胞成像的可能性。图 4A 展示了每个 z 平面的单分子重构图像，以及相应的定位精度和 NeNA 值。此外，图 4C 提供了 HeLa 细胞中微管网络的三维彩色渲染可视化图像。随着成像深度增加，由于散射和光学像差，检测到的光子数减少，导致基于克拉默-拉奥下限（Cramér-Rao Lower Bound, CRLB）计算的定位精度（图 4A，右图）以及使用 NeNA 指标计算的定位精度均有所下降。然而，SDC-OPR 系统能够高效收集光子，使得在高达 9 µm 的成像深度下仍可实现 σSMLM ≤ 10 nm，且分布较窄。事实上，双层壁状的丝状微管结构在不同深度均被清晰分辨：靠近盖玻片-细胞界面处、中间轴向位置以及细胞顶部，其峰间距为 30 nm 至 40 nm（图 4C），与已有报道的数值一致24。这些结果突显了 SDC-OPR 系统在大视场范围内以及在整个细胞高度上实现高分辨率成像的能力。
<img alt="SOD-CPR 显微镜与 DNA-PAINT 示意图，用于纳米级精度的蛋白质定位。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig1.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图 1"> 
图 1： 不同细胞样本的平面内单分子定位显微成像及多色超分辨率成像。（A）配备光学光子重分配（SDC-OPR）系统的旋转盘共聚焦显微镜示意图，该系统采用微透镜阵列以最大化光子收集效率。（B）DNA-PAINT 原理示意图：荧光标记的 DNA 链（称为 成像器 链）与互补的 DNA 序列（对接 链）发生瞬时杂交，这些对接链被固定在靶向目标蛋白的抗体/纳米抗体上。这些短暂的结合事件产生随机闪烁的荧光信号。（C）在 SDC-OPR 系统上获得的 U2OS 细胞核孔复合体（NPC）DNA-PAINT 成像结果，放大倍数为 4×。插图展示了其高分辨率能力，可清晰分辨单个核孔复合体。（D）经 SDC-OPR 增强的 DNA-PAINT 可实现单个核孔复合体的可视化，其中白色箭头标示了孔结构中特征性的 Nup96 蛋白对。（E）单个核孔复合体对称单元内 Nup96 二聚体间距离测量值的分布（n=16 对）。本图改编自 Zaza 等人14。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="显微镜示意图；细胞结构与过程；蛋白质相互作用；荧光可视化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig2.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图 2"> 
图 2：利用 SDC-OPR 显微镜进行多色成像的 Exchange-PAINT 技术。（A）依次对三个靶标进行 Exchange-PAINT 成像的示意图。三个蛋白质靶标分别使用 DNA 功能化抗体、Fab 片段或纳米抗体进行标记。Cy3B 成像链按链的类型依次成像，每轮成像之间进行洗涤步骤。（B）利用 SDC-OPR 显微镜以 4× 放大倍数对 U2OS 细胞进行三色 Exchange-PAINT 成像，显示微管（红色；使用 DNA 偶联的抗 α-微管蛋白抗体标记）、线粒体（绿色；靶向 TOM20 的 DNA-纳米抗体）和核孔复合体（蓝色；mEGFP 标记的 Nup96，结合抗 GFP 的 DNA-纳米抗体）。比例尺：5 µm。放大区域突出了 SDC-OPR 系统获得的增强分辨率，分别聚焦于（1）线粒体，（2）微管和（3）核孔蛋白（NUP）。比例尺 = 1 µm。本图经 Zaza 等人14修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞结构显微镜；显示不同放大倍数的示意图；1x、2.8x、4x；光谱分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig3.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图3"> 
图3：在 SDC-OPR 显微镜上对大视场进行 DNA-PAINT 成像。在多个放大倍数下获取的微管 DNA-PAINT 图像（抗α-微管蛋白标记）：（A）1× 放大倍数和 1 binning（视场为 211 × 211 µm²），（B）2.8× 放大倍数和 2 binning（视场为 76 × 76 µm²），（C）4× 放大倍数和 4 binning（视场为 53 × 53 µm²）。颜色表示定位精度，1x 放大倍数下为 0–16 nm，其他为 0–4 nm。（D）在 1×（红色）、2.8×（黄色）和 4×（绿色）放大倍数下，距视场中心不同距离（以 µm 为单位）处测得的定位精度。该图改编自 Zaza 等人14。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Super-resolution microscopy images and graph showing optical sectioning for nanostructure analysis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig4.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="Figure 4"> 
图4全细胞DNA-PAINT成像 (A) 左侧。 中国台湾 HeLa 细胞中微管的容积成像 通过 使用 SDC-OPR 在 4 倍放大倍数下获取的 DNA-PAINT 图像，显示从 z = 0 到 9 µm（步长 1 µm）的轴向切片。每个平面均显示 z 位置、定位精度和NeNA指标。比例尺：5 µm（xy). 右侧所有层面的定位精度与穿透深度的关系。B) 同一HeLa细胞微管网络的3D渲染图，该细胞如(A）。颜色代表穿透深度，范围为 0 到 9 µm。C) 每个穿透深度所示高亮小区域的放大图像A）。该图已根据 Zaza 等人的研究修改。14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本方案概述了使用配备光学光子重分配功能的转盘共聚焦显微镜进行深层全细胞单分子定位显微镜（SMLM）成像的实验步骤，从而无需定制光学元件或复杂照明即可实现DNA-PAINT成像。

全细胞超分辨率成像 通过 使用光学光子重分配的旋转盘共聚焦显微镜进行DNA-PAINT成像

单分子定位显微镜（SMLM）能够实现细胞结构的纳米级成像，但通常仅限于盖玻片附近的成像……

我们的方案在旋转盘共聚焦显微镜上使用带有光学光子重分配的DNA-PAINT技术，以克服深度限制。DNA-PAINT现已通过多重复用和定量能力实现极高分辨率，超越了PALM和STORM等SMLM其他技术。首先，使用配备光学光子重分配单元和sCMOS相机的旋转盘共軛軛系统。在成像前30分钟启动显微镜、相机和激光器。然后启动电脑。等待NIS-Elements软件完全加载完毕。现在，在NIS-Elements中选择SoRa旋转盘，然后设置采集参数，选择合适的成像模式。选择60倍Apo数值孔径1.49油浸物镜，以最大化单分子事件的检测效果。然后，根据物镜、相机设置和采样选择合适的放大倍数。相应地调整相机弯曲以匹配选定的放大倍率。设定DNA-PAINT采集的暴露时间。现在，根据成像器染料光谱配置激光波长、激光功率和滤光轮。要记录物镜后的激光功率，将校准后的激光功率计传感器放置在靠近样品面的显微镜台上，记录测量功率。接着，在干净的60倍Apo数值孔径1.49号油物镜上滴一滴浸油。使用舞台适配器将已制备的免疫染色细胞样本固定在显微镜台上，以减少漂移。切换到明场模式，并以纳米粒子为参考，聚焦玻璃平面。然后激活完美专注系统，在获得过程中保持专注。在完美对焦系统激活时，暂时改变绿色荧光蛋白通道的激发，以确定最佳焦平面。在此步骤中使用低功率激光。定义实验名称和保存路径。勾选时间框以设置间隔、时长和循环次数。将间隔设置为无延迟，输入对应总帧数的循环数。确保底部的PFS框被选中了。返回之前定义的SoRa激发设置，点击“立即运行”。第一个蛋白质获取15,000到20,000帧，积分时间为300毫秒。图像分析时，将去卷积图像栈加载到毕加索局部模块中。在菜单栏选择“分析”和“参数”，根据制造商规格输入相机专用参数。接着，将盒侧长度设置为七，以优化单分子定位精度。选择合适的最小净梯度值，并启用预览功能以可视化检测到的本地化。调整梯度阈值以减少背景检测。现在，选择分析，然后定位，开始在所有帧中进行点识别和拟合。将生成的 HDF5 加载到 Picasso 渲染模块中，以可视化重建后的定位地图。选择后处理，然后选择RCC的“解脱”。输入一个初始分割值，从1,000开始，得到xy漂移图。重复使用更低的分段值以改善漂移修正。点击“文件”并“保存本地化”，保存漂移校正后的本地化文件，然后关闭渲染模块。现在，将漂移校正文件加载到毕加索滤波器模块中，并根据定位精度、点扩散函数宽度、光子数量及其他质量指标应用阈值。点击“文件”并“保存本地化”，在关闭筛选模块前保存已筛选的本地化文件。对U2OS细胞中标记单体增强绿色荧光蛋白的核孔蛋白96进行DNA-PAINT成像，在视野中产生了清晰且超分辨的核孔复合体图案。放大视图显示核孔形成对对的核孔8倍对称性96亚基。测量比对的核孔蛋白96对之间的欧几里得距离显示峰间距为13±2纳米。在U2OS细胞中同时观察到核孔蛋白96、线粒体和微管，且在所有靶点上保持了单分子定位精度。大视场 HeLa细胞微管成像显示定位精度随放大倍率和场大小变化，低倍率下精度降低。与1倍放大相比，更高的放大倍率带来了更好且更均匀的定位精度。通过DNA-PAINT采集跨多个轴向平面的微管网络，展示了覆盖整个细胞深度的全细胞成像。定位精度随着成像深度的增加逐渐下降。双壁微管结构在多个轴向位置被解析，峰间距离在30纳米到40纳米之间。我们的方案采用简单且市面上可获得的光学技术，实现深细胞和组织DNA-PAINT成像，同时不牺牲分辨率。高分辨率DNA-Paint主要在TIRF或高光照条件下工作，成像深度仅限于几微米。我们的发现使DNA-PAINT被许多实验室使用，实现了细胞和组织深度的纳米级成像。

whole-cell-super-resolution-imaging-via-dna-paint-on-spinning-disk

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

通过在旋转盘共焦点上进行全细胞超分辨率成像，并结合光学光子重分配

我们描述了一种超分辨率成像方法，用于研究细菌FtsZ环的结构组织，该结构是细胞分裂所必需的重要装置。该方法基于对光激活定位显微镜（PALM）图像的定量分析，可应用于其他细菌细胞骨架蛋白的研究。...

细菌分裂机器的超分辨率成像

我们介绍了如何在固定的培养神经元中实施基于光激活定位显微镜（PALM）的囊泡研究。本方案的关键步骤包括：使用光转化嵌合蛋白标记囊泡，利用超分辨率显微成像系统采集稀疏采样的原始图像，以及对原始图像进行处理以获得超分辨率图像。...

神经元致密核心囊泡的超分辨率成像

活细胞内动态蛋白质的时空信息对于理解生物学过程至关重要。一种称为快速三维结构光照明显微镜（f3D-SIM）的超分辨率显微技术能够揭示细菌细胞分裂Z环的独特信息：不仅呈现其珠状结构，还能展示FtsZ蛋白在环内的快速动态行为。...

利用快速三维结构光照明显微镜（f3D-SIM）对活体细菌中细胞分裂Z环进行超分辨率成像

本方案描述了通过关联超分辨率光学显微镜与扫描电子显微镜图像，获得斑马鱼视网膜亚细胞蛋白定位结果所需的各个步骤。...

相关超分辨率显微镜与电子显微镜技术解析斑马鱼视网膜中蛋白质的定位

本文概述了一种利用基态耗尽（GSD）超分辨率显微技术在哺乳动物细胞中检测一种或多种血浆和/或细胞内膜蛋白的实验方案。本文讨论了采用此类方法在细胞蛋白可视化与定量分析中的优势及注意事项。...

基态耗尽超分辨率成像在哺乳动物细胞中的应用

本方案介绍了如何制备和装载细菌样品以进行活体三维成像，以及如何从这些图像中重建大肠杆菌（E.

用于精确细胞表征与精准蛋白定位的细菌细胞三维成像

本文介绍了一种在完整组织中进行超分辨率活细胞成像的实验方案。我们已标准化了在其原生组织环境中对高度敏感的成体干细胞群体进行成像的条件。该技术通过平衡时间分辨率与空间分辨率，实现在活体组织中直接观察生物学现象。...

超分辨率活细胞成像观察亚细胞结构

基底膜在发育过程中对组织和器官的形态发生至关重要。为了更好地理解导致该结构正确定位的机制，本文介绍了一种利用共聚焦显微镜和超分辨率显微镜观察和表征上皮细胞中基底膜蛋白的细胞内转运与分泌的方法。...

共聚焦与超分辨率成像技术揭示基底膜蛋白极化性细胞内运输及分泌过程 黑腹果蝇 卵子发生

超分辨率显微镜可提供减数分裂中联会复合体内部组分排列的详细信息。在此，我们展示了一种用于解析秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

Caenorhabditis elegans 生殖系中联会复合体的超分辨率显微成像

本方案详细介绍了集成多路阵列探测器的激光扫描共聚焦显微镜系统在高级成像中的应用及其共享资源管理，适用于高分辨率的细胞及亚细胞成像。该工作流程可在同一平台上实现从共聚焦到超分辨率（约120...

超分辨率成像与共享管理：一种用于多通道检测共聚焦显微镜的实验方案

学习使用旋转盘共聚焦显微镜结合光学光子重分配技术进行全细胞单分子定位显微成像的方法。该方案无需定制光学系统即可实现DNA-PAINT高分辨率成像，为神经科学研究提供可靠的技术支持。

全细胞超分辨率成像通过使用光学光子重分配的旋转盘共聚焦显微镜进行DNA-PAINT成像

探索更多视频

全细胞超分辨率成像 通过 使用光学光子重分配的旋转盘共聚焦显微镜进行DNA-PAINT成像

探索更多视频

全细胞超分辨率成像通过使用光学光子重分配的旋转盘共聚焦显微镜进行DNA-PAINT成像