Name: 开发并标准化一种体 外 显微方法，用于通过LC-MS/MS在原级ALL细胞中细胞内定量长春新碱 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 了解如何使用LC-MS/MS技术定量检测原级儿童急性淋巴细胞白血病细胞中的长春新碱积累水平。该方法为优化化疗药物监测和个体化治疗方案提供了可靠的实验基础。

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感谢巴西博尔德里尼儿童中心及所有为本研究捐献样本的患者。Adrielli C. Soares 获得了巴西高等教育人员进修协调委员会（CAPES）以及圣保罗研究基金会（FAPESP，2023/18389-3）的资助。José A. Yunes 获得了国家科学技术发展委员会（CNPq，308399/2021-8）的生产力研究基金。本研究得到了巴西卫生部 PRONON 项目（国家肿瘤诊疗支持计划，项目编号：25000.211174/2019-45）的研究经费支持。

本研究中使用的白血病样本来自巴西博尔德里尼儿童中心（Centro Infantil Boldrini）接受治疗的患者所留存的生物样本库冻存管，患者通过签署知情同意书同意其细胞用于本研究。该项目已获得机构伦理委员会批准（CAAE 34601120.7.0000.5376）。在动物体内建立患者来源异种移植模型（PDX）的实验方案均遵循博尔德里尼儿童中心动物伦理使用委员会（Comissão de Ética no Uso de Animais，CEUA/Boldrini 0011-2020）的规定和伦理准则进行。
1. 样品制备与药物孵育（第1天）
<ol>
	<li>储备液和工作液的配制
	<ol>
		<li>称取2.5 mg硫酸长春新碱（分子量：923 g/mol），加入2.0 mL二甲基亚砜（DMSO）于2.0 mL微量离心管中，配制成1.354 mM的储备液。涡旋振荡至完全溶解。 
		&#8203;注意：DMSO具有刺激性；操作时应佩戴手套，并在化学通风橱中进行。</li>
		<li>取147.71 µL VCR储备液与1,852.28 µL DMSO混合于2.0 mL微量离心管中，配制成100 µM的工作液。充分涡旋混匀。</li>
		<li>将工作液分装至四个0.6 mL微量离心管中，每管500 µL，于-20 °C保存，可保存数月。避免反复冻融超过三次。</li>
		<li>在2.0 mL微量离心管中，将181.81 µL浓度为1.1 mM的长春碱储备液（硫酸长春碱，1 mg/mL，分子量：909.07 g/mol）与1,818.19 µL无菌超纯水混合，配制成100 µM的长春碱（VINB）工作液。涡旋至均匀。</li>
		<li>将VINB工作液按照与VCR相同的方法进行分装。</li>
		<li>在50 mL离心管中，将49.95 mL甲醇与50 µL VINB工作液混合，配制成含0.1 µM VINB的甲醇溶液。涡旋至均匀，于-20 °C保存，最多可保存3个月。 
		注意：甲醇具有毒性和易燃性；应在通风橱中佩戴适当的个人防护装备进行操作。</li>
		<li>在50 mL离心管中，将49.95 mL超纯水与50 µL甲酸混合，配制成含0.1%甲酸的水溶液。充分涡旋混匀，室温（RT）保存。 
		注意：甲酸具有腐蚀性；操作时应佩戴手套和眼部防护装备。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>原代细胞的解冻与洗涤
	<ol>
		<li>将冻存的细胞样品置于盛有15 mL 37 °C蒸馏水的烧杯中，轻轻摇动直至完全解冻。 
		&#8203;注：有关细胞采集与冻存方案的详细信息可参见先前发表的文献9,10。</li>
		<li>使用无菌一次性巴斯德吸管将冻存管中的内容物转移至含有10–15 mL无菌1×PBS的50 mL锥形离心管中。在室温下以300 × g离心5分钟。</li>
		<li>倒置离心管，弃去上清液。</li>
		<li>用一次性巴斯德吸管将沉淀重悬于10 mL AIM V培养基中。使用自动细胞计数仪计数活细胞并测定平均细胞大小。 
		注：建议使用活率相对于总细胞数不低于80%的细胞进行实验。</li>
		<li>根据测得的细胞浓度，通过简单比例计算获得2.5 × 106&#160;个活细胞所需的体积。例如，若细胞浓度为5 × 106&#160;个/mL，则所需体积为0.5 mL。 
		&#8203;注：为确保数据可重复性，每种处理应设置三个重复。保存自动细胞计数仪提供的细胞平均尺寸数据，用于后续细胞体积的计算。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>药物处理实验设置
	<ol>
		<li>计算为达到2.0 mL总体积中终浓度为1 µM所需的VCR工作液体积。加样前应先涡旋混匀储备液。</li>
		<li>在2.0 mL微量离心管中依次加入AIM V培养基、2.5 × 106&#160;个细胞，最后加入VCR溶液。短暂涡旋混匀后轻甩（5秒），使管盖内壁的液体沉至管底。</li>
		<li>将开口的离心管置于37 °C、5% CO2&#160;条件下孵育3小时。</li>
		<li>孵育结束后盖紧管盖，在室温下以300 × g离心5分钟。</li>
		<li>小心使用移液器吸弃上清液，然后向管中加入1 mL室温PBS。</li>
		<li>重复上述离心（300 × g，5分钟，室温）、弃上清及PBS洗涤步骤两次，共完成三次洗涤。</li>
		<li>使用移液器小心吸除全部上清液，将沉淀重悬于100 µL PBS中，并涡旋至沉淀完全重悬。</li>
		<li>直接向样品中加入400 µL预冷的含0.1 µM长春碱的甲醇溶液（-20 °C），避免液体接触管壁。</li>
		<li>将样品于-80 °C过夜保存。 
		&#8203;注：样品可在-80 °C保存数周（安全暂停点）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. LC-MS/MS 样品处理（第2天）
<ol>
	<li>样品提取
	<ol>
		<li>在从 -80 °C 冰箱中取出样品前，将离心机预冷至 4 °C。</li>
		<li>从冰箱中取出样品后，立即在 4 °C 条件下以 13,000 × g 离心 20 分钟。</li>
		<li>将 300 µL 上清液转移至 1.5 mL 微量离心管中。</li>
		<li>使用真空浓缩仪在 40–45 °C 下完全干燥样品，持续 1 小时 40 分钟。 
		注意：干燥后的沉淀物可在 -20 °C 下保存数周（安全暂停点）。</li>
		<li>将每个沉淀物重悬于 400 µL 水 + 0.1% 甲酸（预先配制）中。轻轻涡旋振荡，直至沉淀完全溶解。</li>
		<li>再次在 4 °C 条件下以 13,000 × g 离心 20 分钟。</li>
		<li>将 300 µL 上清液转移至 2.0 mL 螺口小瓶中，用于 LC-MS/MS 分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）设置与数据采集
<ol>
	<li>流动相制备与色谱柱平衡
	<ol>
		<li>通过将超纯水与 0.1% 甲酸混合，制备溶剂 A。</li>
		<li>通过将乙腈与 0.1% 甲酸混合，制备溶剂 B。 
		注意：乙腈具有毒性和易燃性；应在化学通风橱中操作。</li>
		<li>将每种溶剂在超声波水浴中超声处理 5 分钟。将溶剂瓶连接至泵模块，并以高流速冲洗系统以去除污染物。</li>
		<li>安装反相 BEH C18 色谱柱（1.7 µm，2.1 mm × 50 mm）。 
		注：本研究采用 Acquity H-Class 色谱系统，耦合 Xevo TQS-Micro 三重四极杆质谱仪进行分析。</li>
		<li>使用先前配制的溶剂 A 和溶剂 B 组成二元梯度。</li>
		<li>在前 2 分钟内，将色谱梯度从 5% 溶剂 B 升至 95% 溶剂 B，随后用 2 分钟 100% 溶剂 A 进行色谱柱清洗和重新平衡。</li>
		<li>在整个 4 分钟运行过程中，设置流速为 0.2 mL/min。保持色谱柱温度为 40 °C，并进样每个样品 10 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LC-MS/MS 方法设置
	<ol>
		<li>打开 LC-MS/MS 软件。点击 文件 &#62; 新建 &#62; 质谱方法，以创建新方法。</li>
		<li>进入 功能 选项卡，将 功能类型 设置为多反应监测（MRM）。在 表 1 中输入 VCR 和 VINB（内标）的离子跃迁及参数。</li>
		<li>将 采集时间 设置为 4 分钟。点击 应用 保存。 
		注：采集时间不得超过 4 分钟，以确保进样之间色谱柱的重新平衡。</li>
		<li>在 进样方法 &#62; 编辑液相方法 下配置 UHPLC 参数，并保存为 .mth 文件（表 2）。</li>
		<li>根据 表 3 在 调谐 选项卡下设置离子源参数。保存为 .tun 文件。</li>
		<li>保存完整方法：文件 &#62; 另存为，并 导出为 .mth 文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>创建样品列表并开始运行
	<ol>
		<li>在软件主界面中，打开 样品列表，创建包含样品名称、进样体积、进样瓶位置及所用方法的列表。</li>
		<li>在自动进样器托盘中放置一个装有超纯水的进样瓶，并将其标记为空白样。在每组三重平行进样之间运行空白样，以避免交叉污染。 
		注：开始运行前，确保色谱柱压力（ΔP）稳定且低于 10 psi。</li>
		<li>在 样品列表 中选择所需行，点击 运行 &#62; 确定，开始数据采集。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>数据可视化与导出
	<ol>
		<li>运行完成后，通过选择一个样品并点击顶部菜单栏中的色谱图来查看色谱图。</li>
		<li>在主屏幕上，点击TargetLynx，选择刚刚运行的文件，然后点击处理 &#62; 选择长春新碱方法 &#62; 确定，以生成输出表格。</li>
		<li>点击报告 &#62; 导出表格，并将处理后的数据保存为 .csv 或 .xlsx 文件。 
		注意：需导出分析物和内标物的原始峰面积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据整理与比值计算
	<ol>
		<li>打开导出的文件，并创建以下列：
		<ol>
			<li>样品：添加样品或小瓶名称。</li>
			<li>运行：标明该数值对应的重复实验编号。</li>
			<li>长春新碱峰面积：输入长春新碱峰的峰面积。</li>
			<li>长春碱峰面积：输入长春碱峰的峰面积。</li>
			<li>长春新碱/长春碱比值：将每个长春新碱的峰面积除以其对应的长春碱峰面积进行归一化。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>为每组三个重复实验的长春新碱峰面积、长春碱峰面积以及长春新碱/长春碱比值添加标准差列。 
		&#8203;注意：使用内标物进行归一化可校正提取或进样体积的差异。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结果绘图
	<ol>
		<li>打开首选的绘图软件，并选择分组表格格式。</li>
		<li>选择输入或导入数据到新表格中，在选项下选择输入3个并列子列中的重复值。</li>
		<li>仅绘制每个样品的归一化长春新碱/长春碱比值，不包含原始峰面积值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Inaba, H., Pui, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+diagnosis+and+treatment+of+pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Advances in the diagnosis and treatment of pediatric acute lymphoblastic leukemia.</a> J Clin Med. 10 (9), 1926(2021).</li>
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<li>Richter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+donor+to+the+lab%3A+a+fascinating+journey+of+primary+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">From donor to the lab: a fascinating journey of primary cell lines.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 648272(2021).</li>
<li>Borgmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Childhood+ALL+blasts+retain+phenotypic+and+genotypic+characteristics+upon+long-term+serial+passage+in+NOD%2FSCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Childhood ALL blasts retain phenotypic and genotypic characteristics upon long-term serial passage in NOD/SCID mice.</a> Pediatr Hematol Oncol. 17 (8), 635-650 (2000).</li>
<li>Rosati, M. M., Corrêa, J. R., de Sousa Mariano, S., Cardoso, A., Andrés Yunes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+leukemia+relapse+to+induction+chemotherapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine model of leukemia relapse to induction chemotherapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> J Vis Exp. (224), e68797(2025).</li>
<li>Dams, R., Huestis, M. A., Lambert, W. E., Murphy, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+effect+in+bioanalysis+of+illicit+drugs+with+LC-MS%2FMS%3A+influence+of+ionization+type%2C+sample+preparation%2C+and+biofluid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Matrix effect in bioanalysis of illicit drugs with LC-MS/MS: influence of ionization type, sample preparation, and biofluid.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 14 (11), 1290-1294 (2003).</li>
<li>Yang, Y., Cruickshank, C., Armstrong, M., Mahaffey, S., Reisdorph, R., Reisdorph, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+sample+preparation+approach+for+mass+spectrometry-based+profiling+of+plasma+results+in+improved+coverage+of+metabolome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">New sample preparation approach for mass spectrometry-based profiling of plasma results in improved coverage of metabolome.</a> J Chromatogr A. 1300, 217-226 (2013).</li>
<li>Zhang, J., Dasgupta, A., Ayala, R., Bonapace, C., Kassim, S., Faustino, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+standard+variability%3A+root+cause+investigation%2C+parallelism+for+evaluating+trackability+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Internal standard variability: root cause investigation, parallelism for evaluating trackability and practical considerations.</a> Bioanalysis. 16 (15), 771-776 (2024).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

准确评估原代白血病细胞内的药物浓度对于理解细胞水平的药物代谢过程，以及开发可补充分子谱分析的功能性检测方法至关重要。现有的分析方法通常需要大量细胞，涉及耗时的处理步骤，或依赖于无法真实反映化疗药物细胞内可利用性的间接读数5,6。这些局限性凸显了建立快速、灵敏且可扩展的方法的必要性，以直接在患者来源的样本中定量检测细胞内药物的累积情况。
本方案描述了一种利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）原代细胞内长春新碱（VCR）进行相对定量的微量分析方法。该方法的建立旨在直接、灵敏地评估细胞内药物含量，克服了传统分析方法的局限性——后者通常依赖大量细胞样本、半定量检测策略或间接替代标志物。通过实现对少量原代细胞内VCR含量的测定，该微量方法为研究药物摄取、细胞内药物代谢及药理学行为提供了实用且可重复的实验框架，适用于离体（ex vivo）白血病模型。
本方案的一个关...

急性淋巴细胞白血病（ALL）约占所有儿童癌症的25%，仍是儿童中最常见的恶性肿瘤1,2。尽管治疗手段的进步已显著提高了生存率，目前超过90%，但ALL的生物学复杂性仍在推动人们开发更精确的工具，以在细胞水平上更好地表征该疾病3。
长春碱类药物，尤其是长春新碱（VCR），是急性淋巴细胞白血病（ALL）治疗方案中的关键组分4。由于VCR在细胞内发挥其细胞毒作用，了解其在白血病细胞中的摄取和蓄积情况，对于涉及药物反应、药效动力学以及离体（ex vivo）系统中细胞行为的研究至关重要。然而，目前大多数用于评估细胞内药物浓度的方法依赖于间接测量或半定量技术，限制了实验的可重复性和灵敏度5,6,7。
与此同时，许多研究仍然在很大程度上依赖白血病细胞系，而这些细胞系缺乏患者来源的原代细胞所具有的生物学异质性和临床相关性。原代样本常常带来诸多挑战，例如细胞数量有限、样本质量参差不齐，以及需要采用高灵敏度的分析技术来检测低丰度的细胞内化合物8。
液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）具有准确定量化疗药物所需的特异性和灵敏度，但目前仍缺乏在原代白血病细胞中直接测定细胞内VCR的标准化方案。建立适用于有限患者样本的可靠微量检测方法，可能有助于多种应用，包括药理学谱型分析、药物-细胞相互作用评估，以及不同疾病亚型或治疗条件间的比较研究。
在此方案中，我们描述了一种微量化方法的建立与优化过程 离体 使用LC-MS/MS定量原代白血病细胞内VCR含量。为获得足量样本用于方法开发，将患者样本移植至免疫缺陷型NSG小鼠以建立PDX模型&#160;模型9。之后 体内 扩增后，分离并冻存人白血病细胞10随后，细胞被解冻，与VCR共同孵育，洗涤、裂解，并通过LC-MS/MS分析以测定细胞内药物浓度。
该方法具有多项优势：所需细胞数量少（250万个），灵敏度高、速度快，且适用于临床相关的原代样本。由于该方法可直接测量细胞内药物含量，因此为研究血液系统恶性肿瘤中药物摄取、细胞对化疗药物的反应或其他药理学问题的研究人员提供了一种可靠的定量工具。
总体而言，本方案拓展了可用于研究儿童急性淋巴细胞白血病的分析工具，且可轻松适用于其他药物或样本类型，有助于未来对白血病生物学、药物行为及精准药理学的深入研究。

<table><tbody><tr><td>2.0 mL 螺口小瓶</td><td>Flowsupply</td><td>8-2400</td><td>与同公司生产的带弹簧玻璃插件（5 x 29 mm）配合使用（货号 5-29015）</td></tr><tr><td>2.0 mL 螺口小瓶</td><td>Flowsupply</td><td>8-2400</td><td>与同公司生产的带弹簧玻璃插件（5 x 29 mm）配合使用（货号 5-29015）</td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>100030</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>24010152</td><td></td></tr><tr><td>AIM V</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12055091</td><td></td></tr><tr><td>色谱系统 Acquity UPLC H-Class</td><td>Waters Co.</td><td>https://www.waters.com/nextgen/br/pt/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-h-class-plus-system.html?srsltid=AfmBOoo0mjNgaucBI-Exv97cEmWE96_lVkqKi2IR0IPtA-h1feG-WvtW</td><td></td></tr><tr><td>Countess 3 FL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A49892</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>D 8418</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>玻璃瓶</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>41121800</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>PHCBI</td><td>MCO-50M-PE</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>41121702</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管 2.0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>PPB006</td><td></td></tr><tr><td>Speevac miVac</td><td>Fisher Scientific</td><td>56340</td><td></td></tr><tr><td>数据采集软件</td><td>Waters Co.</td><td>MassLynx</td><td></td></tr><tr><td>三重四极杆质谱仪 Xevo TQ-S micro</td><td>Waters Co.</td><td>https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/xevo-tq-s-micro.html?srsltid=AfmBOoqqmLRNfHGqvtnwaL7xYOOEXPV3NJ9qYNH9HAwqXKXrMvLRQXSW</td><td></td></tr><tr><td>超声波破碎仪</td><td>Quimis</td><td>Q335D</td><td></td></tr><tr><td>长春碱 1 mg/mL</td><td>Libbs</td><td>https://www.libbs.com.br/nossos-produtos/antineoplasico-faulblastina/</td><td>硫酸长春碱</td></tr><tr><td>长春新碱</td><td>Cayman Chemicals</td><td>11764</td><td></td></tr></tbody></table>

一种方法的开发与标准化 离体 采用液相色谱-串联质谱法对急性淋巴细胞白血病原代细胞内长春新碱进行微量定量分析的方法

Development and Standardization of an Ex Vivo Micromethod for Intracellular Quantification of Vincristine in Primary ALL Cells by LC-MS/MS

在原代儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞中定量细胞内长春新碱（VCR）对于理解样本特异性的药物摄取差异，以及支持利用稀缺患者材料开展的实验研究至关重要。本文介绍了一种经过专门优化的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）微量分析方法，适用于通过患者来源异种移植模型（PDX）获得的原代ALL细胞，解决了细胞数量有限、细胞体积小以及多次洗涤步骤后需实现可重复回收等关键挑战。时间进程实验（1至5小时）表明，3小时孵育期可获得最高且最稳定的细胞内VCR水平，且在重复实验中变异性较低。方法优化还确定，每组使用2.5 × 106&#160;个细胞相较于1 × 106&#160;个细胞具有更优的分析稳健性，后者在重复实验中表现出更大的数据离散性。其他关键优化措施包括使用冷甲醇以提高蛋白质沉淀效率，以及引入内标以监测并最小化操作过程中的变异。该方法可在相关浓度范围内实现对细胞内VCR的高灵敏度和精确量化，但在3小时孵育后，最低测试剂量（0.01 µM）无法被定量。总体而言，该微量分析方法为在原代ALL样本中测定细胞内VCR提供了一种实用、可重复且可扩展的技术路径。其设计支持开展比较分析、体外（ex vivo）模型的验证，以及未来将细胞内药物定量整合到更广泛药理学评估中的方法学应用。

使用VCR和VINB孵育的急性淋巴细胞白血病原代PDX细胞进行胞内蓄积实验后获得的代表性色谱结果如图1所示。每种条件下使用2.5 × 106个细胞制备样品。在所述色谱条件下，VCR的保留时间稳定为2.85分钟，基质效应极小，峰形对称且分离良好。这些图谱展示了当本方案正确执行时，VCR和VINB预期的色谱行为。
在将本方案应用于原代白血病细胞之前，已进行了初步实验以确定该方法的线性范围、检测限（LOD）、最佳细胞数量和孵育时间。这些步骤未在本方案中详细描述，但作为方法学验证的一部分，以下展示了标准曲线的代表性结果。
为评估该方法的灵敏度和线性关系，分别在两种实验条件下构建了VCR的校准曲线。在AIM V培养基中，浓度范围为0.001 µM至10 µM时，经log10转换后表现出优异的线性关系（r² = 0.9986）。当向培养基中加入2 × 106个RS4;11细胞后，线性范围为0.01至1 µM，同样显...

本方案旨在建立并优化一种液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），用于相对定量分析长春新碱在原代儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞中的累积量。

量化原代儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞内长春新碱（VCR）对于理解样本特异性……

我们的目标是测量临床相关样本中的长春新碱细胞内，并研究药物细胞相互作用。当前的实验挑战是优化模型间的潜伏时间。此外，模型依赖药物的适应性限制了稳健性，尤其是在初级患者样本中。首先，通过在装有15毫升蒸馏水的小瓶中以37摄氏度轻轻旋转，将冷冻保存的细胞样本解冻，直到内容物完全解冻。使用无菌一次性巴斯德移液器将瓶内内容物转移到一个50毫升锥形管内，内含15毫升无菌1X PBS。将管子放入设定为300克的离心机中，室温下浸泡五分钟。离心后，通过一次平滑的动作将管子倒置，丢弃上清液。现在，用一次性巴斯德移液器将细胞沉淀重新悬浮在10毫升的AIM V培养基中。使用自动计数器计数活性细胞，并测量平均细胞大小。计算出获得2.5乘以10次方六个活细胞所需的体积，使用基于测得细胞浓度的简单比例。使用前很久就用长春新碱的液液做漩涡。将AIM V培养基加入2毫升微管，然后按2.5乘以10次方的六细胞的幂次方，最后加入所需体积的长春新碱溶液。短暂旋转，旋转管子五秒，从盖子中收集液体。接着，将开放的微管与5%二氧化碳在37摄氏度下孵育三小时。孵育后，关闭管盖，在室温下以300克离心五分钟。小心地用移液器去除上清液。然后在室温下加入一毫升PBS到管子里。重复离心和清洗步骤后，用移液器小心地去除所有剩余的上清液。将沉淀重新悬浮在100微升PBS中并进行漩涡，直到沉淀完全重新悬浮。现在，在零下20摄氏度的温度下，直接向样品加入400微升含0.1微摩尔文氏菌的冷甲醇，同时避免接触管壁。将样本存放在零下80摄氏度过夜。在将样品从零下80摄氏度的冷冻室取出前，先将离心机预冷却至摄氏4度。取出样品后立即以13,000克离心机，温度为4摄氏度，进行20分钟。然后，用移液器将300微升上清液转移到1.5毫升微管。将样品放入设定为45摄氏度的真空浓缩器中，浸泡一小时四十分钟，完全干燥。干燥后，用移液器将每个沉淀重新悬浮在含0.1%甲酸的400微升水中。轻轻旋转，直到颗粒完全溶解。现在，再次以13,000克离心，4摄氏度，离心20分钟。将300微升的上清液转移到两毫升螺旋顶小瓶，进行液相色谱串联质谱分析。在软件主界面打开样品列表，输入样品名称、注射体积、瓶口位置和所用方法，创建新列表。将一瓶装有超纯水的水放入自动采样托盘，并在样本列表中指定该瓶为空白。每次三次注射间隙都要用空白针，避免重复。在样本列表中选择所需行，点击运行并确认确定后开始数据采集。运行结束后，从结果中选择样本，点击顶部菜单栏的色谱图查看色谱图。最后，在主屏幕上点击目标链接。选择刚刚运行的文件，点击“处理”。选择长春新碱方法并点击确定以生成输出表。对原发急性淋巴细胞白血病患者来源的异种移植细胞，与一粒微粒长春新碱共孵育三小时，色谱分析持续显示2.85分钟时VCR峰值对称且分辨率良好，确认保留适当且基质干扰最小。AIM V培养基中生成的长春新碱校准曲线显示，在0.001至10微摩尔浓度间具有强烈线性。同样，当2乘以10的6的幂次方RS4时;新增11个细胞，观察到从0.01到1微摩尔的线性反应。长春新碱积累的时间过程分析显示，RS4;11个细胞在长春新碱与文氏母细胞的比率中出现2至3小时的平台期，4至5小时时略有增加，而原发PDX细胞在2小时达到峰值后下降，支持3小时作为平衡潜伏时间的选择。六个PDX患者样本中，长春新碱的归一化积累表现不同，且未正常化长春新碱（由文氏素比值）与平均细胞体积呈正相关。碎裂分析确认长春新碱的基峰对应于主电荷比413.38的前驱离子，在40伏锥体能量和16伏碰撞能量下产生定量离子392.47和确认离子383.38。我们的方案克服了间接方法的局限，使得主要针对白血病细胞的细胞内药物测量能够直接且灵敏。我们的方法便于直接测量细胞内长春新碱，即使细胞投票率较低。未来，我们将研究细胞内药物积累差异是否与体外耐药性相关，并探索相关机制。

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癌症研究

开发并标准化一种体 外 显微方法，用于通过LC-MS/MS在原级ALL细胞中细胞内定量长春新碱

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细胞外囊泡摄取实验 通过 共聚焦显微镜成像分析

本文介绍了一种基于内源性荧光标记的优化切片上相关光镜-电镜联用技术方案，用于研究稀有蛋白质相对于细胞超微结构的定位。该方法的优势通过在未使用巴佛洛霉素处理的饥饿细胞中实现内源性LC3蛋白的超微结构定位得以展示。...

通过切片上相关联的光学-电子显微镜对内源性LC3进行超微结构定位

本文介绍一种磁分离辅助的高速均质化方法，用于大规模制备来源于内体的纳米囊泡，作为一种新型的外泌体模拟物（EMs），其具有与天然细胞外囊泡（EVs）相同的生物学来源，以及相似的结构、形态和蛋白质组成。...

一种磁分离辅助的高速均质化方法用于大规模制备内体来源囊泡

了解如何使用LC-MS/MS技术定量检测原级儿童急性淋巴细胞白血病细胞中的长春新碱积累水平。该方法为优化化疗药物监测和个体化治疗方案提供了可靠的实验基础。

一种方法的开发与标准化离体采用液相色谱-串联质谱法对急性淋巴细胞白血病原代细胞内长春新碱进行微量定量分析的方法

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一种方法的开发与标准化 离体 采用液相色谱-串联质谱法对急性淋巴细胞白血病原代细胞内长春新碱进行微量定量分析的方法

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