Name: 同一食管癌患者建立肿瘤类器官、癌相关成纤维细胞及其对应成纤维细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-03T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: 学习从同一食管鳞状细胞癌患者同时分离肿瘤类器官、癌相关成纤维细胞及其对应成纤维细胞的方法。该技术消除患者间差异，为研究肿瘤微环境与基质相互作用提供可重复的实验平台。

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本研究得到了顺天堂大学青年研究者奖（2024年和2025年）以及日本文部科学省科学研究费补助金（23K07362、21K08693）对P. Z.的资助。我们谨向病理科与肿瘤科以及食管与胃肠外科全体成员致以诚挚的感谢。

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作者声明无利益冲突。

既往研究采用癌症类器官及患者匹配的癌相关成纤维细胞（CAFs），探究CAFs在人结肠癌、乳腺癌、胰腺癌以及头颈部癌症中对增殖和耐药性的作用20,21,22,23,24。这些研究表明，CAFs可影响肿瘤细胞的增殖和药物抵抗能力。然而，据目前所知，尚无已发表的研究报道将癌症类器官与患者匹配的CAFs用于食管鳞状细胞癌（ESCC）的实验研究。
本研究建立了一种从同一食管鳞状细胞癌（ESCC）患者样本中同时分离癌类器官、癌相关成纤维细胞（CAFs）和癌旁成纤维细胞（CFs）的实验方案，其中CFs可作为患者特异性的CAFs对照。在多个样本中，癌类器官的建立成功率约为70%，而CAFs和CFs的建立成功率均约为80%。这三种细胞群体在体外培养中均能稳定良好地增殖。该模型系...

食管癌在全球范围内具有较高的发病率和死亡率1。该病主要分为两种组织学亚型：食管鳞状细胞癌（ESCC）和食管腺癌（EAC）2。其中，ESCC 比 EAC 更为常见，尤其在东亚和非洲地区发病率更高3。目前针对 ESCC 的治疗策略相对明确4,5。对于局限于黏膜层的早期病变，内镜下切除是一种根治性且微创的治疗选择。对于局部进展但可切除的病例，新辅助放化疗联合食管切除术已被证实具有临床疗效。而对于不可切除或转移性病例，全身化疗仍是主要治疗手段。然而，治疗耐药和疾病复发仍是当前面临的主要临床挑战。
肿瘤不仅由癌细胞组成，还包含复杂的肿瘤微环境，后者由多种间质细胞类型构成。其中，癌相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤微环境的主要细胞成分，已被证明在肿瘤进展及治疗反应中发挥关键作用6,7,8,9。在食管鳞状细胞癌（ESCC）中，CAFs参与肿瘤恶性行为及治疗耐药性的报道也日益增多10,11,12。然而，CAFs在ESCC恶性进展中的确切分子机制仍 largely 不清楚。
在以往大多数研究中，癌症相关成纤维细胞（CAFs）对癌细胞的作用通常是利用在培养皿中传代多年甚至数十年的多种食管鳞状细胞癌（ESCC）细胞系进行评估的。这类细胞系会逐渐适应体外培养条件，与原始肿瘤的特征相差甚远13。此外，ESCC细胞系来源于不同患者，携带多种遗传和表观遗传改变，导致各ESCC细胞之间存在明显的个体间差异。因此，使用不同ESCC细胞系所得的实验结果常常彼此不一致。基于此，若实验中采用不同的ESCC细胞系与患者来源不匹配的CAFs，可能难以以可重复且可靠的方式精确解析这些细胞间的相互作用。
为解决这些局限性，已建立一种实验方案，可从同一食管鳞状细胞癌（ESCC）手术标本中同时分离获得患者匹配的肿瘤类器官、癌症相关成纤维细胞（CAFs）以及非肿瘤对应的成纤维细胞（CFs）。患者来源的类器官通常能够重现原发肿瘤的关键结构和表型特征，同时保留其分子异质性。所建立的类器官在三维（3D）培养条件下形成球状结构，并表现出稳定的增殖能力。通过波形蛋白（vimentin，一种成纤维细胞标志物）阳性确认，CAFs 和 CFs 均富集了成纤维细胞群体。
本方案提供了组织处理、酶解离、类器官接种、CAFs/CFs分离、传代及冻存的详细且可重复的操作步骤。为帮助研究人员在实施前评估其适用性，本方案包含了实用信息：类器官通常在3–5天内形成，7–10天内达到传代条件，并可稳定扩增超过十代；CAFs和CFs可传代至少八代；类器官和成纤维细胞可在约20天内完成冻存。类器官的建立成功率约为70%，CAFs和CFs的建立成功率约为80%。此外，本方案还包括经验证的条件培养基实验，使用CAFs或CFs的条件培养基，为评估基质细胞对肿瘤类器官行为的旁分泌效应提供了可靠方法。综上，该匹配的肿瘤类器官–基质共培养平台为研究食管鳞状细胞癌（ESCC）肿瘤–基质相互作用提供了一个实验上易于操作且具有生物学相关性的模型，并有助于推动精准治疗策略的开发。

<table><tbody><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>100 倍青霉素-链霉素溶液（PS）</td><td>Nacalai</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>FastGene</td><td>FG2001</td><td></td></tr><tr><td>24 孔细胞培养板</td><td>TPP</td><td>92024</td><td></td></tr><tr><td>48 孔细胞培养板</td><td>TPP</td><td>92448</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>FastGene</td><td>FG2004</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>TPP</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>6 孔细胞培养板</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Cayman</td><td>9001799</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td>类器官基础培养基 = Advanced DMEM/F12 + GlutaMAX + 1× PS</td></tr><tr><td>Alexa488 标记抗小鼠 IgG 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素 B</td><td>ThermoFisher</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>抗波形蛋白抗体（V9）</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6260</td><td>使用时稀释比例为 1/500</td></tr><tr><td>B-27</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>瓶口滤器</td><td>Sartorius</td><td>180F15</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛，孔径 100 &amp;micro;m</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 I 型</td><td>SIGMA</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>胶原蛋白包被 60 mm 培养皿</td><td>IWAKI</td><td>4010-010</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Wako</td><td>043-07216</td><td></td></tr><tr><td>Dispase I</td><td>GODO SHUSEI</td><td>386-02271</td><td></td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Nacalai</td><td>08459-64</td><td></td></tr><tr><td>ECLIPSE Ti2</td><td>Nicon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>SERANA</td><td>S-FBS-CO-015</td><td></td></tr><tr><td>成纤维细胞生长培养基 2</td><td>PromoCell</td><td>C-23020</td><td>成纤维细胞培养基-1 = 成纤维细胞生长培养基 2</td></tr><tr><td>G418</td><td>Invivogen</td><td>ant-gn-1</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HFDM-1</td><td>KSK</td><td>87-160</td><td>成纤维细胞培养基-2 = HFDM-1 + 1% FBS + 1 × PS</td></tr><tr><td>Hoechst33342&amp;nbsp;</td><td>Nacalai</td><td>04929-82</td><td></td></tr><tr><td>潮霉素</td><td>Invivogen</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte 系统</td><td>Essen BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-WRN 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>基底膜基质 = Matrigel</td></tr><tr><td>N2</td><td>ThermoFisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰-L-半胱氨酸</td><td>Wako</td><td>017-05131</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>TCI</td><td>N0078</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Nacalai</td><td>14249-24</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-05</td><td></td></tr><tr><td>重组人 EGF</td><td>PEPROTECH</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>重组人 FGF-10</td><td>PEPROTECH</td><td>PEP-100-26</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Selleck</td><td>S1077</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片，11 号</td><td>Feather</td><td>8-3086-02</td><td></td></tr><tr><td>STEMFULL</td><td>住友电木</td><td>MS-90150</td><td>低吸附 15 mL 管 = STEMFULL</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605028</td><td>类器官用胰蛋白酶 = TrypLE Express</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Nacalai</td><td>35556-44</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

从同一食管癌患者建立肿瘤类器官、癌相关成纤维细胞及配对正常成纤维细胞

Establishment of Tumor Organoids, Carcinoma-Associated Fibroblasts, and Counterpart Fibroblasts from the Same Esophageal Cancer Patient

在食管鳞状细胞癌（ESCC）中，治疗耐药性的获得和肿瘤复发仍是主要的临床挑战。癌相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤微环境的关键组分，已知可影响 ESCC 的进展及治疗反应。然而，CAFs 在肿瘤恶性行为中的诸多作用仍不明确，这可能归因于 ESCC 患者之间的个体差异。目前可用于研究的多种人 ESCC 细胞系被认为在一定程度上模拟了人类癌组织的特性。这些细胞系也可被传代培养 体外 多年来，细胞在培养皿中长期培养，导致其适应了体外培养条件。此外，人食管鳞状细胞癌（ESCC）细胞系在不同原发患者中存在多种不同的遗传和表观遗传改变，从而导致患者间的异质性。然而，以往大多数研究在实验中使用的是与患者不匹配的癌相关成纤维细胞（CAFs），并依赖于长期培养的癌细胞系。每种癌细胞系内部以及癌细胞与CAFs之间的患者间异质性，可能导致实验结果的可重复性和可靠性降低。为消除患者间异质性，本研究从同一患者体内分离出三种不同的细胞类型：从手术切除的ESCC组织中获取的癌类器官和CAFs，以及从相邻非肿瘤组织区域分离的对应成纤维细胞（CFs），作为患者特异性的CAFs对照。本文提供了一项详细的操作方案，可实现癌类器官、CAFs和CFs的同步分离。癌类器官在三维培养条件下生长良好。CAFs和CFs均对波形蛋白（vimentin）呈阳性染色，该蛋白是成纤维细胞的标志物之一，表明这些细胞在成纤维细胞谱系中得到了有效富集。本方案使我们能够建立ESCC类器官及与之匹配的患者源性成纤维细胞，为研究肿瘤与间质间的相互作用提供了一个排除患者间异质性的宝贵实验平台。

组织样本取自食管鳞状细胞癌（ESCC）患者手术切除的肿瘤区域以及距肿瘤3 cm的相邻非肿瘤区域，该患者未接受新辅助化疗。肿瘤区域用于分离癌类器官和癌相关成纤维细胞（CAFs），而非肿瘤区域用于分离正常成纤维细胞（CFs）。手术组织被切成约0.5 mm大小的组织块（图2A），随后进行酶消化处理，进而分别分离出癌类器官和成纤维细胞。类器官和成纤维细胞需要大约18–21天的培养时间，以生长至可用于冷冻保存的细胞储备状态。
肿瘤类器官在3–5天内形成可见的球状体，并在7–10天达到传代准备状态。来源于肿瘤组织的类器官表现出稳定的形态，成功传代≥10次，在相差显微成像下形成一致的球状结构。比较培养第2天与第3天的情况，第3天时球状体的数量和尺寸均显著增加（图2B）。此外，球状体数量持续稳定增加，直至第6天（图2C）。这些结果表明所建立的肿瘤类器官具有活跃的增殖能力。大多数肿瘤类器官在维持良好定义的球形形态的同时持续...

本方案描述了一种从同一食管鳞状细胞癌（ESCC）患者中同时分离癌类器官、癌相关成纤维细胞（CAFs）和非肿瘤相关成纤维细胞（CFs）的方法。使用这些来自同一患者的匹配样本可避免个体间差异带来的问题，为ESCC研究提供合适的实验平台。

在食管鳞状细胞癌（ESCC）中，治疗耐药性的获得和肿瘤复发仍是主要的临床挑战。

establishment-tumor-organoids-carcinoma-associated-fibroblasts

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科研

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Cancer Research

癌症研究

同一食管癌患者建立肿瘤类器官、癌相关成纤维细胞及其对应成纤维细胞

本方案描述了食管腺癌类器官的传代培养和冷冻保存方法，包括使用和不使用单细胞消化的两种方式，以帮助研究人员根据实验设计选择合适的策略。...

食管腺癌类器官的传代培养与冷冻保存：单细胞消化的优缺点

本方案描述了通过化学致癌方法诱导生成并表征小鼠口腔-食管三维类器官的关键步骤，这些类器官代表了正常、癌前病变及鳞状细胞癌病灶。...

建立三维类器官模型研究口腔-食管鳞状细胞癌

类器官-成纤维细胞共培养为研究提供了模型 体内...

利用类器官共培养对食管成纤维细胞进行功能表征与可视化

肿瘤类器官已彻底改变了癌症研究及个体化医疗的方法。它们代表了一种具有临床相关性的肿瘤模型，使研究人员能够在临床治疗中领先于肿瘤的发展。本方案建立了源自新鲜胰腺肿瘤组织样本及胰腺腺癌患者来源异种移植瘤的肿瘤类器官。...

从新鲜组织建立胰腺癌来源的肿瘤类器官和成纤维细胞

本方案描述了代表肿瘤进展不同阶段的食管类器官模型的建立及其组织学分析。该方法使研究人员能够研究从正常组织向癌变组织转变过程中细胞形态、空间结构以及分子标志物表达模式的变化。...

建立模拟食管组织从正常向癌变进展的类器官模型及其组织学分析

为了实现对播散性人结直肠癌（CRC）细胞在组织中定植的高灵敏度检测，本文展示了一种在将PDX来源的CRC类器官细胞注射到受体小鼠之前，高效转导绿色荧光蛋白（GFP）慢病毒颗粒的方案，并通过立体荧光显微镜进行观察。...

高灵敏度检测由患者来源结肠肿瘤类器官经GFP慢病毒转导培养后产生的微转移灶

患者骨髓来源的前列腺癌骨转移样本及其异种移植瘤的三维培养物可维持原始肿瘤的功能异质性，从而形成囊状结构、球状体以及复杂的类肿瘤类器官。本文提供了一种针对异质性患者来源样本进行三维培养的优化策略及实验方案，并介绍了利用成像流式细胞术（IFC）对其进行分析的方法。...

建立与分析源自前列腺癌骨转移患者样本及其异种移植瘤的三维（3D）类器官

提供了一种共注射癌细胞和成纤维细胞并随时间监测肿瘤生长的实验方案。该方案可用于理解成纤维细胞作为肿瘤生长调控因子的分子基础。...

一种用于研究肿瘤相关成纤维细胞在肿瘤生长中作用的小鼠模型

本文旨在提供一种从三阴性乳腺癌同源小鼠模型中分离和培养原代癌症相关成纤维细胞的实验方案，并介绍其在针对肿瘤微环境的新型纳米颗粒临床前研究中的应用。...

从小鼠同源性乳腺癌模型中分离原代癌症相关成纤维细胞用于靶向纳米颗粒研究

高度准确的 体外 高通量检测系统被开发用于评估基于患者来源肿瘤类器官（PDOs）的抗癌药物，这类类器官类似于癌组织，但不适合用于 体外...

高通量 体外 使用患者来源肿瘤类器官的检测方法

学习从同一食管鳞状细胞癌患者同时分离肿瘤类器官、癌相关成纤维细胞及其对应成纤维细胞的方法。该技术消除患者间差异，为研究肿瘤微环境与基质相互作用提供可重复的实验平台。

从同一食管癌患者建立肿瘤类器官、癌相关成纤维细胞及配对正常成纤维细胞

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