Name: 以脾病毒诱导的纹状体病理作为多谷氨酰胺脊髓小脑共济失调的临床前模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 了解利用慢病毒载体在纹状体表达突变ataxin-2构建SCA2疾病模型的方法。该模型可重现神经元内包涵体形成和神经元标志物丢失等病理特征，为研究多谷氨酰胺脊髓小脑共济失调的发病机制和评估治疗策略提供高效灵活的平台。

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Clévio Nóbrega 实验室的研究经费由 Cure CSB 项目、斯洛文尼亚罕见病儿童维利姆·尤利扬协会（Viljem Julijan Association for Children with Rare Diseases）以及阿尔加维生物医学中心研究所（Algarve Biomedical Center Research Institute, ABC-Ri）提供。本文部分作者获得了葡萄牙科学技术基金会（Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT）资助的博士奖学金，具体编号如下：Tiago Moreira-Gomes（2022.11008.BD）、Inês T Afonso（2022.10161.BD）和 Rafael G Costa（2022.11973.BD）。

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<li>Moreira-Gomes, T., Nóbrega, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+disruption+of+RNA+metabolism+to+the+targeting+of+RNA-binding+proteins%3A+The+case+of+polyglutamine+spinocerebellar+ataxias%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">From the disruption of RNA metabolism to the targeting of RNA-binding proteins: The case of polyglutamine spinocerebellar ataxias.</a> J Neurochem. 168 (8), 1442-1459 (2024).</li>
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</ol>

作者声明无竞争利益。

本文描述了用于多聚谷氨酰胺脊髓小脑性共济失调（polyQ SCA）的纹状体慢病毒小鼠模型的建立方法。同时还描述了&#160;编码高滴度慢病毒载体的制备 野生型 致病蛋白的全长形式，以及通过立体定位手术将慢病毒（LVs）双侧注射至小鼠纹状体。此外，本文还描述了脑组织采集、组织学处理及基于图像的疾病特征量化方法。综合这些技术，可建立一种慢病毒介导的多聚谷氨酰胺（polyQ）脊髓小脑共济失调（SCA）小鼠模型，该模型在纹状体中表现出蛋白聚集和神经元标志物丢失，且该方法也可应用于其他脑区。尽管本实验方案的主要目标是表征神经病理学特征，以作为疾病建模的关键组成部分20，行为改变可能因靶向的脑区不同而出现17在小鼠纹状体内通过慢病毒介导表达突变型ataxin-2后，在旷场实验中，与注射野生型ataxin-2或未注射的对照动物相比，注射突变型ataxin-2的小鼠表现出活动能力增强和类似焦虑的行为。12重要的是，该模型并非旨在复制经典的共济失调性小脑功能障碍，而是用于解析与多聚谷氨酰胺毒性相...

脊髓小脑性共济失调中的多聚谷氨酰胺病（polyQ SCAs）是一组由多个致病基因中CAG三核苷酸重复序列异常扩增引起的六种常染色体显性遗传神经退行性疾病，这种扩增导致编码蛋白中产生具有毒性的多聚谷氨酰胺（polyQ）片段1。其中最常见的类型是SCA3/马查多-约瑟夫病和SCA22。这些疾病主要影响特定脑区的神经元细胞，包括小脑、脑干以及纹状体等其他区域，从而导致进行性运动失调、步态障碍、严重的神经退行性病变以及早亡3。
为了研究多聚谷氨酰胺（polyQ）性脊髓小脑共济失调（SCAs）并测试治疗策略，已开发出多种动物模型。转基因小鼠、基因敲入品系以及条件性表达小鼠模型已被用于阐明疾病进展的分子基础及相关的细胞通路4,5。然而，构建新的疾病动物模型耗时且成本高昂，通常不适合用于研究脑区在疾病发病机制中的作用6。
基于慢病毒（LV）的小鼠模型为传统模型提供了一种互补的替代方案，具有成本较低以及能够研究大脑特定区域的优势7,8。慢病毒载体可递送较大的转基因片段（最大可达8 kb），能够在特定脑区快速诱导病理变化，而无需进行生殖系修饰，并且适用于不同年龄的动物。将慢病毒载体直接注射到目标脑区，可实现致病基因或治疗基因的区域特异性表达，且相较于其他病毒载体具有较低的免疫原性4。此外，出生后递送可避免发育代偿效应，从而在更接近人类疾病发病条件的情况下研究疾病机制9。通过调整病毒剂量可滴定表达水平，产生严重程度可控的表型，有助于模拟疾病进展的梯度过程。此外，该方法还可根据所选启动子实现细胞类型特异性的基因表达4,7。
多项研究已证明基于慢病毒（LV）的小鼠模型在模拟多聚谷氨酰胺（polyQ）脊髓小脑共济失调（SCAs）方面具有实用性和有效性10,11,12,13。我们及其他研究团队已开发出针对SCA111、SCA212、SCA311,12和SCA714的基于慢病毒的模型，这些模型可用于快速、区域特异性地表达或沉默致病基因，同时再现神经病理学的关键特征。
综上所述，本文所述的慢病毒方法为多聚谷氨酰胺（polyQ）脊髓小脑性共济失调（SCA）的发病机制研究提供了一种多功能且高效的工具。该方法克服了现有动物模型的一些主要缺陷，可加速概念验证研究，并对疾病的发生、定位和严重程度实现更精确的控制——这些特点使其非常适用于治疗药物的筛选以及分子机制的研究。本文介绍了一种可重复的实验方法，用于构建和表征纹状体慢病毒性多聚谷氨酰胺型脊髓小脑性共济失调模型，从而实现对早期致病事件的详细分析以及对候选治疗药物的评估。

<table><tbody><tr><td>0.9% NaCl</td><td>本地供应商</td><td>&amp;mdash;</td><td>用于配制麻醉剂和拮抗剂混合液</td></tr><tr><td>100 mm 细胞培养皿</td><td>SPL Life Sciences</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>ABC试剂盒（亲和素-生物素复合物）</td><td>VECTASTAIN Elite</td><td></td><td></td></tr><tr><td>阿替美唑（5.0 mg/mL）</td><td>本地供应商</td><td>&amp;mdash;</td><td>美托咪定的拮抗剂</td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>II级生物安全柜（符合BSL-2标准）</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>生物素化二抗</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>NZYTech</td><td>MB47002</td><td></td></tr><tr><td>脑切片（例如，30&amp;ndash;40 &amp;micro;m 冠状切片），经DARPP-32免疫染色</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数插件（FIJI）</td><td>内置 / ImageJ</td><td>&amp;mdash;</td><td>用于手动聚集体计数的工具</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱（37 &amp;deg;C，5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，湿化）</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>计算机工作站</td><td>本地供应商</td><td>&amp;mdash;</td><td>用于图像处理和软件运行</td></tr><tr><td>锥形超速离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>358126</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>本地供应商</td><td>&amp;mdash;</td><td>用于去除骨膜</td></tr><tr><td>带样品盘支架的冷冻切片机</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>DAB（二氨基联苯胺）</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>数字立体定位坐标读取器</td><td>Stoelting/WPI</td><td>51725</td><td>用于坐标测量的数字显示器</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良Eagle培养基（DMEM，高糖）</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>11-965-092</td><td></td></tr><tr><td>乙醇 70%、96% 和 100%</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，70%</td><td>本地供应商</td><td>&amp;mdash;</td><td>用于头皮消毒</td></tr><tr><td>芬太尼（0.05 mg/mL）</td><td>本地供应商</td><td>&amp;mdash;</td><td>麻醉剂组分</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS），热灭活</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>FIJI（ImageJ发行版）</td><td>NIH / ImageJ</td><td>https://fiji.sc/</td><td>用于聚集体手动定量的开源软件</td></tr><tr><td>精细镊子（用于脚趾夹捏）</td><td>本地供应商</td><td>&amp;mdash;</td><td>用于监测麻醉深度</td></tr><tr><td>氟马西尼（0.1 mg/mL）</td><td>本地供应商</td><td>&amp;mdash;</td><td>咪达唑仑的拮抗剂</td></tr><tr><td>镊子和手术刀</td><td>本地供应商</td><td>&amp;mdash;</td><td>用于去除骨膜和暴露颅骨</td></tr><tr><td>Hamilton&amp;nbsp;700/1700系列微量/防漏注射器</td><td>Hamilton / Fisher Sci.</td><td>7653-01/10550203</td><td>用于装载病毒溶液</td></tr><tr><td>Hamilton&amp;nbsp;小接头可拆卸针头（26G）</td><td>Hamilton / Fisher Sci.</td><td>7804-03/ 10698205</td><td>用于病毒递送</td></tr><tr><td>加热垫（用于啮齿类动物）</td><td>Kent Scientific / SOMNI</td><td>例如 04-777-177</td><td>用于维持体温</td></tr><tr><td>HEK 293T细胞（&amp;le;第10代，支原体阴性）</td><td>ATCC或同等来源</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>IHCAggreCount软件</td><td>按需提供</td><td>N/A</td><td>用于聚集体半自动检测与定量的专有内部软件</td></tr><tr><td>倒置显微镜（用于观察细胞汇合度）</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>实验室涡旋混合器</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>慢病毒载体（野生型和突变型）</td><td>内部制备 / 核心设施</td><td>N/A</td><td>用于注射的病毒溶液</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>带相机的光学显微镜（明场）</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>美托咪定（1.0 mg/mL）</td><td>本地供应商</td><td>&amp;mdash;</td><td>麻醉剂组分</td></tr><tr><td>微型钻头（兼容立体定位仪）</td><td>Stoelting / 本地供应商</td><td>&amp;mdash;</td><td>用于开颅手术</td></tr><tr><td>微量注射泵（例如，Stoelting）</td><td>Stoelting/WPI</td><td>53210</td><td>用于病毒注射的自动输注泵</td></tr><tr><td>移液器（P1000、P200、P10）及吸头</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>显微图像（IHC切片）</td><td>内部生成</td><td>N/A</td><td>待分析的免疫组织化学图像</td></tr><tr><td>切片机刀片（低剖面，一次性）</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>咪达唑仑（5.0 mg/mL）</td><td>本地供应商</td><td>&amp;mdash;</td><td>麻醉剂组分</td></tr><tr><td>封片介质</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>纳洛酮（0.4 mg/mL）</td><td>本地供应商</td><td>&amp;mdash;</td><td>芬太尼的拮抗剂</td></tr><tr><td>持针器和精细解剖针</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清（NGS）</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. 包埋剂</td><td>Tissue-Tek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>眼科软膏（Bepanthen眼鼻软膏，5% 泛醇）</td><td>Bayer</td><td>11568-0053</td><td>防止手术期间角膜干燥</td></tr><tr><td>轨道摇床</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>p24 ELISA试剂盒</td><td>ZeptoMetrix</td><td>0801111</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm封口膜</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>不含Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;的PBS，pH 7.0</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>10-010-031</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-dR8.2</td><td>Addgene</td><td>质粒 #12263</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（100&amp;times;）</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>苯肼</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>质粒 #12259</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺（PEI），1 mg/mL</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>一抗</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>质粒 #12253</td><td></td></tr><tr><td>qPCR慢病毒滴度测定试剂盒</td><td>abm</td><td>LV900</td><td></td></tr><tr><td>光滑毛刷或火焰抛光的玻璃巴斯德移液管（圆头）</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>刮勺（脑组织托）</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>立体定位仪（用于小鼠）</td><td>Stoelting/WPI</td><td>51730</td><td>用于精确定位脑区</td></tr><tr><td>Stericup 0.22 &amp;micro;m 滤器单元</td><td>MilliporeSigma</td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>缝合线（例如，尼龙5-0）</td><td>Ethicon / 本地供应商</td><td>1664G</td><td>用于伤口闭合</td></tr><tr><td>T75和T175细胞培养瓶</td><td>SPL Life Sciences</td><td>70075/71175</td><td></td></tr><tr><td>转移质粒（目的基因）</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>配备JS-24.38转子的超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>JS-24.38</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅（37 &amp;deg;C）</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯替代品</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

慢病毒诱导的纹状体病理作为多聚谷氨酰胺脊髓小脑性共济失调的临床前模型

Lentiviral-Induced Striatal Pathology as a Preclinical Model of Polyglutamine Spinocerebellar Ataxias

多聚谷氨酰胺脊髓小脑性共济失调是一组由致病基因编码区内的CAG三核苷酸重复序列突变引起的六种神经退行性疾病。该突变导致蛋白质中出现异常扩增的多聚谷氨酰胺片段，使其易于聚集，进而形成神经元内包涵体，这是此类疾病的典型特征。这些疾病发病机制所涉及的分子通路复杂，目前尚未完全阐明。迄今为止，这些疾病仍无法治愈。明确易损脑区中的分子机制对于开发治疗策略至关重要。尽管此类模型无法完全模拟选择性易损性，但仍需建立灵活且具有区域特异性的实验平台，以快速检验相关机制和干预手段，避免构建多种转基因品系所需的时间和成本。近年来，我们及其他研究团队已开发出多种基于慢病毒的模型，用于研究扩增蛋白在脑内特定区域表达所造成的影响。这些模型表现出与疾病部分特征相似的神经病理学和行为学表型，凸显了其在揭示发病机制及开发新型治疗策略中的重要价值。本文中，我们以脊髓小脑性共济失调2型（SCA2）为例，描述了一种纹状体模型的建立过程。我们重点介绍了慢病毒载体的构建与生产，以及立体定位注射表达扩增型ataxin-2（致病蛋白）的病毒载体的操作方法。最后，我们对两种主要的神经病理学标志进行了表征：包涵体的形成和神经元标志物的丢失。该模型通过提供一个可调控的平台，重现了这些关键的病理特征，为解析神经退行性病变的区域特异性机制以及评估靶向治疗干预措施提供了有力工具。

本研究利用现有方案成功鉴定出ataxin-2和DARPP-32的表达。在将慢病毒载体立体定位注射至C57BL/6J小鼠纹状体后，两种蛋白均表现出强烈表达 野生型 12周后检测到突变型ataxin-2。我们此前已证明12 这些构建体特异性地靶向神经元，每平方毫米可有效转导约20,000个神经元3在我们的实验条件下，ataxin-2 的免疫染色显示其呈弥散的细胞质分布 野生型 ataxin-2，不形成离散包涵体（22Q； 图3A，黄色箭头）。相比之下，突变型ataxin-2（104Q）表现出具有明显球形形态的细胞质聚集体（图3B（红色箭头）。这些聚集体呈现为边界清晰、高强度的点状结构，明显区别于野生型条件下观察到的均匀胞质染色，直径通常约为1–5 µm。这些离散包涵体的存在被用作定义突变型ataxin-2病理表达成功的操作标准，表明基于慢病毒的实验方案能够有效诱导靶向脑区中依赖多聚谷氨酰胺的蛋白聚集。
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多聚谷氨酰胺脊髓小脑性共济失调由CAG重复扩增引起，导致易于聚集的蛋白质产生。本方案描述了载体构建、立体定位注射以及包涵体和神经元标志物丢失的分析方法，为研究神经退行性疾病的发病机制及评估靶向治疗策略提供了一个可控的实验平台。

多聚谷氨酰胺脊髓小脑性共济失调是一组由编码区内的CAG三核苷酸重复序列突变引起的六种神经退行性疾病……

本研究报道了一种用于罕见神经退行性疾病（特别是脊髓小脑性共济失调）的慢病毒小鼠模型的建立。该方案所建立的小鼠模型相较于传统的转基因小鼠模型具有一些优势，即构建速度更快、成本较低，并且能够在特定脑区实现特异性转导。这适用于机制研究以及治疗策略的开发。首先，将麻醉后的C57BL6J小鼠置于干净的台面上，通过检测脚趾夹捏反射来确认麻醉深度。剃除动物头部的毛发后，将其放置于立体定位仪中的加热垫上，并使用耳杆和门齿固定杆固定头部位置。将含有两微升慢病毒载体溶液的注射器安装到自动显微注射泵上。设置泵的参数，包括流速为每分钟0.25微升，每侧脑半球注射体积为两微升，并选择合适的注射器类型。在切开皮肤前，使用聚维酮碘或氯己定消毒液与70%酒精交替进行三次手术部位清洁。使用无菌手术刀片，从两耳之间到眼睛处沿中线做一条长约1至1.5厘米的切口。暴露颅骨，并用棉签去除骨膜以清洁骨面。定位前囟，手动或数字方式记录立体定位零点。以颅骨前囟为参照，确定注射坐标的前后位置为前囟前0.6毫米，内外侧位置为正负1.8毫米。在标记的前后和内外侧坐标处小心缓慢钻孔，避免穿透脑组织。将注射针缓慢下降至背腹向坐标位置，然后通过注入少量溶液测试针头是否堵塞，直至观察到明显液滴为止。通过降低注射针来检测孔的位置是否正确。以每分钟0.25微升的速度，将2微升编码野生型ataxin的慢病毒注射到一侧脑半球。5分钟后，缓慢撤出针头，以避免反流。以相同方式将突变或扩增的蛋白质注入对侧。使用3至5针间断的5-0尼龙缝线关闭切口。在将动物放回恢复笼之前，皮下注射拮抗药物混合物以逆转初始麻醉剂的作用，并在12周后分离脑组织。向48孔板的各孔中加入含有0.05%叠氮化钠的磷酸盐缓冲液（PBS）。随后，将脑组织置于干冰上运输，并放入预冷的切片机中平衡5至10分钟，以防止组织损伤。使用解剖刀切除嗅球，因其质地柔软，易于切割。取一豌豆大小的新鲜OCT包埋剂滴加到样本托盘上，将小脑与之接触。待其冻结后，再添加额外的OCT包埋剂以完全包埋整个脑组织。将样本托盘安装至持架中，并进行修块，直至在每个半球观察到呈两个白色圆形的纹状体为止。如果两个半球接受不同的处理，需用针刺穿其中一个半球以保持方向性，并记录该信息以供后续分析。接下来，在仪器面板上切换至切片模式，使用细毛刷或火焰抛光的玻璃移液管收集自由漂浮的切片，并将其放入48孔板中。将第一片切片置于A1孔，第二片置于A2孔，依此类推，按顺序进行。当孔板加满后，可继续使用新的孔板，或持续操作直至整个纹状体完成切片。用透明封膜密封孔板，于4摄氏度保存备用。使用适当的抗体对切片进行免疫组织化学染色，并用二氨基联苯胺显色。观察棕褐色的显色过程，并使反应达到预期的着色强度。采集覆盖整个纹状体的冠状脑切片图像。进行人工计数时，在 Fiji 中打开图像以加载，并在元数据不可用时根据需要校准像素尺寸。选择、分析并设定比例尺以输入已知距离，例如一个像素等于 0.5 微米。导航至插件，然后选择细胞计数器并打开细胞计数器。点击初始化，并选择图像。选择一种标记类型，例如类型一用于聚集体。手动点击每个可见的聚集体以进行标记。记录细胞计数面板中每张图像或切片显示的计数值，并手动导出计数结果，或使用宏来汇总结果。对于半自动定量分析，打开 IHC Aggregount 软件，点击“上传图像”以加载图像。在原始图像显示区域查看图像，并切换至处理选项卡。应用高-低滤波以增强聚集体与背景之间的对比度。应用亮度阈值以从背景中筛选出聚集体，并使用最小尺寸滤波器去除微小颗粒。最后，进入免疫组织化学聚集体检测的常规选项卡。单击“计算总聚集体”和“计算聚集体面积”。观察在矩阵表中高亮显示并列出的检测到的聚集体，包括其鉴定信息、面积和平均大小。在将慢病毒载体立体定位注射到C57BL6J小鼠纹状体后12周，检测到野生型和突变型ataxin-2均显著表达。针对ataxin-2的免疫染色显示，野生型ataxin-2呈弥散的细胞质分布，未形成明显的包涵体。相比之下，突变型ataxin-2表现出具有明显球形形态的胞质聚集体。使用DARP-32（中等棘状神经元的标志物）进行免疫标记显示，野生型和突变型ataxin-2均在纹状体神经元群体中表达。尽管野生型ataxin-2的表达未改变DARP-32阳性神经元的整体形态，但突变蛋白导致神经元标志物的丢失。该方案能够针对特定脑区（即纹状体）中的聚集和神经元丢失片段，响应治疗干预。本方案的主要挑战在于通过精确的立体定位手术实现慢病毒的精准递送，控制生物剂量，并尽量减少组织损伤以获得一致的结果。未来的研究可利用此模型揭示这些发病机制背后的分子机制，并加速靶向治疗和生物标志物的开发。

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来源：Tagliafierro, L.，等．用于高效递送表观基因组编辑工具至人诱导性多能干细胞衍生疾病模型的慢病毒载体平台．J. Vis. Exp.

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小脑区域解剖用于分子分析

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