小鼠肌肉内移植人多能干细胞衍生的胰腺内分泌细胞

我们利用干细胞衍生的胰岛样细胞团研究人类内分泌胰腺的发育，以揭示糖尿病的遗传基础。传统的肾包膜下移植方法具有高度侵入性。肌肉内移植方案则提供了一种更简单、可重复且侵入性更小的替代方法。

首先，加入 0.5 毫升 5% 抗黏附溶液，以覆盖含有倒置金字塔形微孔的 24 孔微孔板的底部。在室温下以 1,300 ×g 离心 10 分钟。然后在显微镜下检查微孔中是否存在气泡。

重新离心培养板以去除任何残留气泡后，吸除抗黏附溶液。随后每孔加入 0.5 毫升 PBS 洗涤一次，并重复洗涤步骤一次。接着，用含 0.5 毫摩尔 EDTA 的 1 毫升 PBS 洗涤由 hPSCs 分化而来的培养胰腺前体细胞。

吸去含 0.5 毫摩尔/升 EDTA 的 PBS，加入胰蛋白酶覆盖孔壁。然后在 37°C 下孵育 8 至 12 分钟。用两倍体积的 DMEM/F12 或 PBS 稀释胰蛋白酶，并用移液器轻柔地重悬细胞。

将悬液转移至锥形管中，并立即进行下一步操作。在室温下以200 g离心3分钟。小心吸除上清液，并用预热的S4培养基轻轻重悬沉淀。

接下来，吸除微量培养板孔中的 PBS。轻柔地将 1.25 毫升悬浮细胞加入微量培养板的每个孔中。在室温下以 100 ×g 离心 3 分钟，使细胞均匀分布于微孔中。

将微孔板小心转移至加湿的培养箱中。使用分化培养基进行换液时，应沿孔壁轻柔地吸出和加入培养基，以防止产生湍流及使细胞团从微孔中移位。将适量生成的细胞团转移至1.5毫升微量离心管后，将注射器连接至针管组件，并用S7培养基充满注射器。

从微量离心管中直接将细胞团块吸入导管内。将导管对折，并将对折部分插入200微升移液器吸头中。然后将吸头-导管-针头组件插入15毫升锥形管中，并用胶带将导管两端固定在管口边缘。

在4摄氏度下以100 × g离心2分钟，使类器官聚集体沉淀，随后立即将离心管置于冰上。为将类器官聚集体移植至麻醉的NOD scid gamma小鼠，需剃除右后腿膝下内侧的毛发，并用70%乙醇消毒。然后将管路从移液器吸头脱离，并连接至注射器。

将管路剪至靠近致密细胞团的位置，并将其连接到针头的钝端。推动生理盐水，直至第一个细胞团到达针尖。然后将小鼠置于俯卧位，身体向右侧倾斜，并伸展右腿。

将针头插入右大腿内侧内收肌与缝匠肌之间的内侧区域，深度为四到五毫米。然后在回撤针头约三毫米的同时注射细胞簇。旋转注射器，拔出针头，让小鼠恢复。

移植后六周移植物恢复并进行组织切片后，进行免疫染色以进行后续成像分析。将四阶段胰腺前体细胞的单细胞悬液接种至微孔板中，以生成尺寸可控的三维聚集体。在24至48小时内，形成致密的球形细胞簇。

荧光显微镜证实了报告基因标记的hPSC系中存在PDX1和胰岛素表达细胞。六周后，肉眼可见移植部位出现类似孔环状的团块，位于肌肉内。切除后，在体视显微镜下可识别出呈浅色球形带状结构的外植体。

在移植动物中观察到C肽阳性细胞的强效检测信号。胰岛素染色证实移植物内存在人源β样细胞。检测到胰高血糖素和生长抑素阳性细胞，表明α细胞和δ细胞群体得以保留。

本方案有助于开展体内功能检测，并评估移植的人源移植物的存活与成熟情况。最重要的注意事项是确保高质量的干细胞分化，以及在细胞簇形成过程中轻柔操作细胞，以最大限度地提高细胞活力并保证良好的细胞存活率。这些模型有助于研究单基因糖尿病和β细胞功能障碍背后的遗传机制。