Name: 小鼠体内人类多能干细胞衍生胰腺内分泌细胞的肌肉内移植 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-10T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: 了解将人多能干细胞衍生的胰腺内分泌细胞肌肉内移植到免疫缺陷小鼠体内的实验方法。该技术通过体内葡萄糖刺激胰岛素分泌评估胰岛功能，为糖尿病细胞治疗研究提供可重复的临床前模型。

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我们感谢美国纽约纪念斯隆-凯特琳癌症中心的黄丹玮博士（Dr. Danwei Huangfu）慷慨提供本研究中使用的人多能干细胞系。本工作获得了西班牙科学、创新与大学部（MICIU/AEI/10.13039/501100011033）以及下一代欧盟/PRTR（Next GenerationEU/PRTR）资助的项目 PID2021-122284NA-I00 和 CNS2023-145179（A.B.），以及由网络生物医学研究联盟（CIBER）项目 CB07/08/0029 和 PID2023-150719OB-I00（M.V.）和卡洛斯三世健康研究所（Instituto de Salud Carlos III, ISCIII）的资助。糖尿病及相关代谢疾病生物医学研究网络中心（CIBERDEM）是 ISCIII 的一项倡议，并获得了欧洲区域发展基金（FEDER）的部分支持。

所有涉及多能干细胞（hPSCs）和实验动物的实验均获得机构、地区和国家伦理委员会的批准。本研究所使用的所有hPSC细胞系均在来源机构根据适当的伦理审批和知情同意程序建立并分发。图1展示了整体实验流程，从hPSC的培养，到定向诱导胰腺谱系分化，最终成熟为适合移植的干细胞来源胰岛（SC-islets）。
1. 将人多能干细胞分化为胰腺前体细胞
注意：本方案基于两个关键的前期步骤：1）人多能干细胞（hPSCs）的培养与扩增；2）将其定向分化为内分泌胰腺谱系。这两个步骤已有详细描述7,17。hPSCs 应按照 Lyria-Leyte 等人17的建议，在包被的培养板中使用 B8 培养基进行维持。在细胞进入汇合前的指数生长期收获 hPSCs 用于后续分化。在推荐的接种密度下，细胞应在次日达到 90–100% 汇合度，即可开始分化。向内分泌胰腺谱系的分化操作应依照 Barsby 等人7所述方法进行。所有培养基的完整配方详见表 1。
<ol>
	<li>用基底膜来源的细胞外基质新鲜包被分化培养板。</li>
	<li>接种 0.16–0.19 × 10⁶ 个细胞/cm²2 在第0天（每孔接种170万个细胞至6孔板中）。使用1.5–2倍体积的B8 + CEPT培养基以防止营养耗竭（6孔板每孔3–4 mL）。 
	注意：在传代人多能干细胞（hPSCs）或接种分化实验时，我们优先在B8培养基中添加CEPT，即chroman 1、emricasan、多胺和trans-ISRIB的混合物，而非传统的ROCK抑制剂Y-27632，因其已被证实可增强hPSC的存活率18尽管如此，Y27632 仍是本方案的有效替代选择。</li>
	<li>按照以下时间表使用分化培养基 S1 至 S4 进行换液：S1（第 1–4 天）、S2（第 4–7 天）、S3（第 7–9 天）和 S4（第 9–11 天）。 
	注意：请参阅 表1 有关完全培养基的组成；更多实验步骤细节见 Barsby 等人的描述。7.</li>
</ol>
2. 三维细胞簇的生成及向胰岛素生成细胞的分化
注意：第11天时，已分化的细胞应已发育为胰腺前体细胞。为在此阶段进一步促进内分泌分化，需将细胞从平面培养转为三维培养。
<ol>
	<li>向含有倒置金字塔形微孔（直径 400 µm）的 24 孔微孔板中加入 0.5 mL 的 5% (w/v) 抗黏附溶液（详细信息见表 1），以覆盖孔底。在室温（RT）下以 1,300 g 离心 10 分钟。 
	注意：抗黏附溶液可形成抗黏附表面，防止细胞黏附于塑料表面，并促进均匀聚集。</li>
	<li>在显微镜下检查微孔中是否存在气泡，并根据需要重新离心以去除被困住的空气（图 2A）。吸除抗黏附溶液，并用 0.5 mL PBS/孔洗涤 2 次。使用前保持孔内充满 PBS。</li>
	<li>用 1 mL PBS-0.5 mM EDTA 洗涤细胞，吸除 PBS-EDTA，然后用胰蛋白酶覆盖孔（6 孔板每孔 1 mL）。在 37 ºC 孵育 8–12 分钟（直至轻敲培养皿可见明显细胞脱落）。</li>
	<li>不要去除胰蛋白酶，而是加入 2 倍体积的 DMEM-F12 或 PBS 稀释，并通过移液轻轻重悬细胞。将细胞悬液转移至锥形管中，并立即进行下一步操作。 
	注意：延长胰蛋白酶孵育时间优于剧烈的机械吹打。</li>
	<li>在室温下以 200 g 离心 3 分钟。小心吸除上清液，并将沉淀轻轻重悬于预热的 S4 培养基中（每 24 孔微孔板孔加入 1.25 mL）。</li>
	<li>吸除微孔板中的 PBS。轻柔地将 1.25 mL 细胞悬液加入微孔板的每个孔中。 
	注意：24 孔微孔板的每孔含有 1,200 个微孔。为获得合适大小的细胞簇，接种密度应为每微孔 1,500 个细胞，相当于每孔 180 万个细胞。也可使用 6 孔微孔板，调整体积和细胞数量（约 885 万个细胞加入 5 mL 第 4 阶段培养基中）。</li>
	<li>在室温下以 100 g 离心 3 分钟，使细胞均匀分布于微孔中。小心将微孔板转移至加湿培养箱中。</li>
	<li>使用分化培养基 S5（D14–D18）、S6（D18–D25）和 S7（D25–D46）进行换液。 
	注意：表 1 提供了完整的成分信息，Barsby 等人7描述了更多实验步骤细节。 
	在此步骤中可使用 CEPT 混合物替代 ROCK 抑制剂 Y-27632，因其已被证实可增强类器官形成过程中的细胞存活率18。成功聚集的标志是在 24–48 小时内形成致密的球形细胞簇（见图 2B）。</li>
</ol>
3. 将SC-胰岛移植到免疫缺陷小鼠的腹直肌中
注意：SC-胰岛已在分化的不同阶段（从第4阶段到第7阶段）进行移植。尽管移植已分化的S7阶段SC-胰岛是评估葡萄糖反应性的最佳策略6，移植较早期的前体细胞（S4-S5阶段）或未成熟类胰岛细胞（S6阶段）可能有助于揭示被掩盖的分化或成熟差异 体外 通过使用明确的培养条件实现。然而，移植分化程度较低的前体细胞会增加畸胎瘤形成的风险，主要原因是残留未分化细胞群体的存在。
<ol>
	<li>簇的压缩
	<ol>
		<li>将适量的细胞簇转移至1.5 mL微量离心管中（见注释）。 
		&#8203;注意：细胞剂量取决于实验目的。对于组织学分析，每只小鼠移植0.5×10⁶至1×10⁶个细胞即可实现可靠的移植物回收；而功能检测或在链脲佐菌素（STZ）处理的小鼠中实现糖尿病逆转通常需要更高剂量，可达2×10⁶至5×10⁶个细胞。在致密化之前，干细胞来源的胰岛（SC-islets）应呈现均匀的球形形态，目标直径约为150–250 µm（可接受范围：100–300 µm）。该尺寸范围大致对应每个细胞簇含有约10³至4×10³个细胞，过大的聚集体（&#62;应避免使用300–400 µm的类器官，因其更易发生中心坏死。在压缩前，需通过明场或体视显微镜对代表性孔中的类器官进行成像，以确认类器官的大小和均一性，随后使用标准图像分析软件测量其直径。</li>
		<li>将23 G注射器连接至针管组件，并用S7培养基填充。</li>
		<li>从微量离心管中直接将细胞团簇吸入导管内。将导管对折，把折叠部分插入200 µL移液枪头中。将移液枪头-导管-针头组件插入15 mL锥形管内，并用胶带将两端固定在管口边缘。</li>
		<li>将试管在100 × g条件下离心 g 4 °C下离心2分钟以聚集簇状物，立即将离心管置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞簇移植到小鼠体内 
	&#8203;注意：所有外科手术操作必须佩戴适当的个人防护装备，并严格遵守机构的生物安全和动物福利法规。麻醉剂和锐器应按照批准的安全程序进行操作和处置。
	<ol>
		<li>在NOD小鼠中诱导麻醉scid使用3-5%异氟烷麻醉γ小鼠。</li>
		<li>剃除右腿膝下内侧的毛发，并用70%乙醇消毒。</li>
		<li>将管路从移液枪头拆下并连接至注射器。在紧邻压缩的细胞团处剪断管路，并将其连接至针头的钝端。推动生理盐水，直至第一个细胞团到达针头尖端。</li>
		<li>将小鼠置于俯卧位，身体向右侧倾斜，伸展右后肢。在右大腿内侧区域，于内收肌与缝匠肌之间的部位，将针头插入4-5 mm深度。</li>
		<li>回撤针头的同时注射细胞团，最大体积为 50 µL&#160;约3毫米。注射完成后，在拔出针头时轻轻将注射器旋转180°，以帮助释放已沉积的细胞团，并尽量减少移植材料的反流。</li>
		<li>监测小鼠直至其从麻醉中完全恢复。 
		&#8203;注意：对于功能表征（即 体内 GSIS（第4节）中，每只小鼠应使用单一基因型的SC-胰岛，单次移植即可。然而，若需对移植后成熟过程进行组织学或转录组学表征，可利用双侧后肢（例如，一侧后肢植入来源于携带疾病相关遗传变异的hPSC的SC-细胞簇，另一侧后肢植入该变异已校正的细胞簇）。肌肉内注射的准确性无法直接确认 体内 注射后立即进行。相反，应在取材时通过肉眼识别移植物来回顾性确认移植是否成功（图3）以及组织学分析（图4).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 在体 葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）
注意：通过口服葡萄糖刺激进行的体内葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）试验，用于评估胰岛素在生理刺激下的功能性分泌。所有操作必须遵循机构动物护理与使用指南。移植后的β细胞功能反应随着体内成熟而改善：人C肽最早可在移植后2周检测到，而显著的葡萄糖响应性分泌通常在4周时达到。这些时间进程可能因移植时干细胞来源胰岛（SC-胰岛）的发育阶段不同而有所差异。
<ol>
	<li>在给予葡萄糖前，对小鼠禁食 4-6 小时，但需保证其可自由饮水。</li>
	<li>用蒸馏水配制 20% (w/v) 的 D-(+)-葡萄糖溶液。使用 0.22 µm 滤器过滤除菌，并在使用前恢复至室温。</li>
	<li>称量每只小鼠的体重，并按 3 g/kg 体重计算所需的葡萄糖剂量。</li>
	<li>将相应体积的葡萄糖溶液吸入连接于 1 mL 注射器的 20 G 弯头灌胃针中。</li>
	<li>轻柔固定小鼠并进行口服灌胃，确保灌胃针顺利插入，避免误入气管导致吸入。</li>
	<li>在灌胃前（0 分钟）以及灌胃后 15 和 30 分钟，通过下颌下静脉或尾静脉穿刺采集血液样本，使用毛细管和 1.5 mL 微量离心管收集。血液在室温下静置约 15 分钟使其凝固，随后将样品管置于冰上保存。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 1,000 g 离心 15 分钟，将血清转移至新管中。待 ELISA 分析前，样品应储存于 −80 °C。 
	注意：时间点可根据具体实验模型进行调整。在异种移植模型中评估移植物来源的胰岛素分泌时，必须使用能够区分人源与鼠源胰岛素或 C-肽的检测方法。</li>
</ol>
5. 移植簇的回收
<ol>
	<li>根据机构动物伦理指南对小鼠实施安乐死。</li>
	<li>为尽量减少组织被毛发污染，用70%（v/v）乙醇喷洒小鼠体表。</li>
	<li>去除皮肤以暴露下肢肌肉，并使用放大镜定位移植的细胞簇。使用剪刀和镊子切除含有移植物的组织。</li>
	<li>用PBS冲洗组织一次，然后将其转移至含4%（w/v）多聚甲醛（PFA）的冰上溶液中。在4 °C条件下，以轻柔振荡方式用4% PFA固定组织4小时。</li>
	<li>在PBS中以轻柔振荡方式洗涤样本1小时。将组织转移至含30%（w/v）蔗糖的PBS溶液中，于4 °C孵育过夜。 
	注意：生物组织、血液样本和化学废弃物（包括固定剂和麻醉剂残留物）必须按照机构的生物安全和化学废弃物管理指南进行处理。</li>
</ol>
6. 外植体染色
<ol>
	<li>OCT包埋
	<ol>
		<li>将组织置于充满最佳切割温度（Optimal Cutting Temperature, OCT）包埋剂的模具中进行包埋。</li>
		<li>将模具放入干冰-异丙醇浴中快速冷冻样品，随后于-80 °C保存，直至进行冷冻切片。</li>
		<li>使用冷冻切片机切取5–7 µm厚的切片，并将载玻片置于-80 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫染色
	<ol>
		<li>将载玻片置于室温下平衡15分钟，并放入密闭容器中以避免产生冷凝水。</li>
		<li>用PBS冲洗载玻片，每次5分钟，共3次。</li>
		<li>每张切片加入100 µL封闭/通透溶液，在室温下孵育30分钟（PBS中含0.1%非离子型表面活性剂及5%与二抗同源动物的血清）。</li>
		<li>每张切片加入50 µL用封闭/通透溶液稀释的一抗，于4 °C孵育过夜。</li>
		<li>用PBS冲洗载玻片，每次5分钟，共3次。</li>
		<li>每张切片加入50 µL用封闭/通透溶液稀释的二抗，在室温下孵育1小时。</li>
		<li>用PBS冲洗载玻片，每次5分钟，共3次。</li>
		<li>每张切片滴加15 µL含DAPI的封片液，加盖盖玻片，于4 °C避光保存，直至成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

在本方案中，我们描述了将SC-胰岛进行肌内移植作为一种操作简便、可重复且微创的方法 体内 成熟，具备功能评估的潜力。尽管肾包膜下移植被广泛认为是 &#34;金标准&#34; 对于啮齿类动物的胰岛或干细胞衍生胰岛（SC-islet）移植，该操作需要更高的技术熟练度和更长的手术时间。相比之下，肌内移植位点具有操作简便和实施快速的优势，符合3R原则中的优化理念，可减少手术复杂性和围手术期应激。这些特点使其在需要评估SC-islet基因修饰效果的研究实验室中尤为适用，尤其适用于将操作便捷性作为优先考虑的研究场景。

利用骨骼肌作为内分泌组织移植部位的概念在临床内分泌学中早有先例，最显著的例子是甲状旁腺自体移植，该技术至今仍常规使用9。这表明肌肉组织具备维持长期内分泌功能的能力。然而，肌肉组织血管化程度相对较低，且血管生成潜力较弱，可能导致功能性的移植需要更长时间才能建立，或需要更高的细胞移植数量20。尽管存在这些局限性，肌内胰岛移植已在糖尿病啮齿类动物模型中多次成...

糖尿病是一种异质性代谢紊乱疾病，其患病率在过去三十年中翻了一番，预计到2050年将影响13亿人1。尽管饮食和生活方式等环境因素在2型糖尿病（T2D）的发病中起着重要作用，但遗传易感性也在其发病机制中具有显著贡献2。胰腺β细胞负责胰岛素的合成与分泌，在糖尿病的病理生理过程中发挥核心作用3。为了理解遗传风险如何导致β细胞功能障碍，由人干细胞分化而来的、以三维内分泌细胞簇形式组织的β细胞（下文简称SC-胰岛）提供了一个信息丰富且高度相关的模型系统4,5。近期的实验方案通过使用特定抑制剂和生长因子模拟胰腺发育的关键阶段，能够高效引导人干细胞分化为可产生胰岛素的β细胞6,7。
这些系统能够以可扩展且可重复的方式可靠地模拟发育过程中的关键阶段，克服了供体来源胰岛的局限性，后者无法支持发育建模，且受限于供应不足的问题。小鼠模型虽然为胰腺发育研究提供了重要见解，但往往难以完全重现人类患者中观察到的表型特征5。因此，基于干细胞的系统可用于表征参与人类胰腺发育及β细胞功能障碍的遗传变异8。
尽管取得了这些进展，所生成的SC-胰岛 体外 与成体天然β细胞相比，在转录组学和功能上均保持未成熟状态。它们表现出次优的葡萄糖刺激性胰岛素分泌，并缺乏成熟β细胞标志物（如MAFA和G6PC2）的表达。9,10. 为了弥补这一差距， 体内 通过移植到免疫缺陷小鼠体内以促进成熟是常用方法；该方法通常可改善胰岛素分泌动力学和基因表达谱6.
葡萄糖代谢受到严密调控，需要整合系统性信号。移植的SC-胰岛能够整合来自多个器官的信号，从而提供一个更接近生理状态的环境，这对于评估人类β细胞中遗传变异的功能后果至关重要11。
在小鼠中，SC类胰岛移植已尝试在不同的解剖部位进行。传统移植部位为肾包膜下，该部位可有效促进β细胞成熟，并逆转链脲佐菌素（STZ）处理的啮齿类动物的糖尿病12，但该手术具有较高的侵入性且操作复杂，限制了其在各实验室间的推广应用13。此外，由于尺寸和血管化程度的限制，该方法难以转化为临床应用，无法用于治疗1型糖尿病患者14。已有研究报道了其他替代性移植部位，如肌肉内、皮下及脂肪组织，这些途径侵入性较低，更具临床应用潜力。尽管与肾包膜下移植相比，肌肉内移植在实现β细胞最佳成熟和胰岛素分泌方面可能存在一定挑战12，但仍可实现有效的胰岛素分泌并维持葡萄糖稳态，同时具有手术操作更简便、更易接近的优势15,16。
因此，在本实验方案中，我们介绍了一种肌肉内移植方法，可克服其他移植方案的多项局限性。该方法具有微创性，且结果可靠 体内 用于成熟SC-胰岛及研究与β细胞功能障碍相关的遗传变异的策略。

<table><tbody><tr><td>2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49752</td><td></td></tr><tr><td>激活素A（Activin A）</td><td>Qkine</td><td>Qk001</td><td></td></tr><tr><td>AggreWell 400 24孔板（微孔板）</td><td>Stemcell</td><td>34415</td><td></td></tr><tr><td>贝塔细胞素（Betacellulin）</td><td>GenScript</td><td>Z03102</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，第五组分，无脂肪酸</td><td>Goldbio</td><td>A-421</td><td></td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>LC labs</td><td>C-6556&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Chroman-1</td><td>Medchem Express</td><td>HY-15392</td><td>CEPT鸡尾酒</td></tr><tr><td>CMRL-1066</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-84600</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>二苯并氮杂䓬（DBZ）</td><td>Syncom</td><td>定制产品</td><td>γ-分泌酶抑制剂</td></tr><tr><td>DMEM/F12培养基（Dulbecco改良Eagle培养基与Ham&amp;rsquo;s F12混合）</td><td>Corning</td><td>15383541</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Qkine</td><td>Qk011</td><td></td></tr><tr><td>艾米卡桑</td><td>Medchem Express</td><td>HY-10396</td><td>CEPT鸡尾酒</td></tr><tr><td>乙醇胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>FGF2-G3</td><td>GenScript</td><td>定制产品</td><td></td></tr><tr><td>FGF7</td><td>GenScript</td><td>Z03047</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Gibco</td><td>30284510</td><td></td></tr><tr><td>L-丙氨酰-L-谷氨酰胺</td><td>Linus</td><td>X0551-100</td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-202686</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SML0559</td><td></td></tr><tr><td>脂质浓缩液</td><td>Gibco</td><td>11548846</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel（基底膜来源的细胞外基质）</td><td>Falcon</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131</td><td>Corning</td><td>15-100-CV</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Thermo Scientific</td><td>10521221</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>10553325</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>NRG-1</td><td>Qkine</td><td>Qk045</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127（抗黏附溶液）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>82184</td><td>使用浓度为5%（w/v）</td></tr><tr><td>多胺补充剂（1000&amp;times;）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8483</td><td>CEPT鸡尾酒</td></tr><tr><td>RepSox</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-13012</td><td>Alk5抑制剂</td></tr><tr><td>维甲酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>SANT-1</td><td>Selleckchem</td><td>S7092</td><td></td></tr><tr><td>索贝替罗（GC1）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SML1900-5MG</td><td>细胞通透性T3类似物</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>亚硒酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>T3（3,3&amp;prime;,5-三碘-L-甲状腺原氨酸钠盐）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&amp;beta;1&amp;nbsp;</td><td>Qkine</td><td>Qk010</td><td></td></tr><tr><td>TPB</td><td>Tocris</td><td>5343</td><td></td></tr><tr><td>微量元素A</td><td>Corning</td><td>15333641</td><td></td></tr><tr><td>微量元素B</td><td>Corning</td><td>15343641</td><td></td></tr><tr><td>Trans-ISRIB</td><td>Medchem Express</td><td>HY-12495</td><td>CEPT鸡尾酒</td></tr><tr><td>转铁蛋白</td><td>InVitria</td><td>777TRF029</td><td></td></tr><tr><td>曲拉通X-100（非离子型表面活性剂）</td><td>Thermo Scientific</td><td>11488696</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>11538856</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>LC Laboratories</td><td>Y-5301</td><td>ROCK抑制剂</td></tr><tr><td>ZM-447439&amp;nbsp;</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10128</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z0251</td><td></td></tr><tr><td>抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗人C肽（胰岛素）</td><td>DSHB</td><td>GN-ID4-s</td><td>使用浓度为150 ng/mL</td></tr><tr><td>小鼠抗胰高血糖素抗体</td><td>Proteintech</td><td>67286-1-Ig</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>兔抗生长抑素抗体</td><td>Millipore</td><td>AB5494</td><td>1:500</td></tr><tr><td>山羊抗大鼠AF488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11006</td><td>1:500</td></tr><tr><td>驴抗小鼠AF488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21202</td><td>1:500</td></tr><tr><td>驴抗兔AF488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>1:500</td></tr></tbody></table>

小鼠肌肉内移植人多能干细胞衍生的胰腺内分泌细胞

Intramuscular Transplantation of Human Pluripotent Stem Cell-derived Pancreatic Endocrine Cells in Mice

人多能干细胞（hPSC）来源的胰腺内分泌细胞是糖尿病细胞治疗和疾病建模的有前景的细胞来源。尽管已有多种分化方案被建立， 体内 植入通常是研究细胞在生理环境下成熟与功能的必要手段。大多数移植方法依赖于肾包膜下或皮下等移植位点，这些位点可能存在技术或生理上的局限性。本文介绍了一种将人多能干细胞（hPSC）来源的胰腺类胰岛细胞团移植至免疫缺陷小鼠骨骼肌内的详细实验方案。该移植位点具有手术操作简便、侵入性低以及移植物易于回收以进行后续分析等优势。本方法可实现干细胞来源胰岛细胞团的骨骼肌内植入，并支持其在口服葡萄糖刺激后胰岛素分泌功能的下游检测。本方案包括细胞团的制备与压缩、移植手术操作、 体内 葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）及用于组织学分析的移植物取出，为临床前小鼠模型中的肌内移植提供了可重复的实验框架。

结果显示的是将第7阶段的SC-胰岛移植到免疫缺陷小鼠肌肉内，并在移植后6周进行分析的结果。本研究仅分析了少量携带代表性移植物的动物，以证明该操作的可行性。在本研究中，成功的标准定义为能够肉眼回收肌肉内移植物，并通过组织学确认移植的SC-胰岛存活且具有内分泌细胞特征。图1展示了整体分化流程，从人多能干细胞（hPSC）的维持，到定向分化为胰腺谱系，最终成熟为适合移植的SC-胰岛。
为了生成尺寸可控的三维细胞聚集体，将第4阶段胰腺前体细胞的单细胞悬液接种到微孔板中（图2A）。在24–48小时内，形成了致密的球形细胞簇（图2B）。通过荧光显微镜观察报告基因标记的人多能干细胞系（如H1 PDX1C-termEGFP/WT 和 MEL1 I...

我们提供一种微创方案，用于将人干细胞来源的胰腺干细胞胰岛移植到免疫缺陷小鼠的肌肉内 体内 植入及后续分析。

人多能干细胞（hPSC）分化的胰腺内分泌细胞是糖尿病细胞治疗和疾病建模的有前景的细胞来源。

我们利用干细胞衍生的胰岛样细胞团研究人类内分泌胰腺的发育，以揭示糖尿病的遗传基础。传统的肾包膜下移植方法具有高度侵入性。肌肉内移植方案则提供了一种更简单、可重复且侵入性更小的替代方法。首先，加入 0.5 毫升 5% 抗黏附溶液，以覆盖含有倒置金字塔形微孔的 24 孔微孔板的底部。在室温下以 1,300 ×g 离心 10 分钟。然后在显微镜下检查微孔中是否存在气泡。重新离心培养板以去除任何残留气泡后，吸除抗黏附溶液。随后每孔加入 0.5 毫升 PBS 洗涤一次，并重复洗涤步骤一次。接着，用含 0.5 毫摩尔 EDTA 的 1 毫升 PBS 洗涤由 hPSCs 分化而来的培养胰腺前体细胞。吸去含 0.5 毫摩尔/升 EDTA 的 PBS，加入胰蛋白酶覆盖孔壁。然后在 37°C 下孵育 8 至 12 分钟。用两倍体积的 DMEM/F12 或 PBS 稀释胰蛋白酶，并用移液器轻柔地重悬细胞。将悬液转移至锥形管中，并立即进行下一步操作。在室温下以200 g离心3分钟。小心吸除上清液，并用预热的S4培养基轻轻重悬沉淀。接下来，吸除微量培养板孔中的 PBS。轻柔地将 1.25 毫升悬浮细胞加入微量培养板的每个孔中。在室温下以 100 ×g 离心 3 分钟，使细胞均匀分布于微孔中。将微孔板小心转移至加湿的培养箱中。使用分化培养基进行换液时，应沿孔壁轻柔地吸出和加入培养基，以防止产生湍流及使细胞团从微孔中移位。将适量生成的细胞团转移至1.5毫升微量离心管后，将注射器连接至针管组件，并用S7培养基充满注射器。从微量离心管中直接将细胞团块吸入导管内。将导管对折，并将对折部分插入200微升移液器吸头中。然后将吸头-导管-针头组件插入15毫升锥形管中，并用胶带将导管两端固定在管口边缘。在4摄氏度下以100 × g离心2分钟，使类器官聚集体沉淀，随后立即将离心管置于冰上。为将类器官聚集体移植至麻醉的NOD scid gamma小鼠，需剃除右后腿膝下内侧的毛发，并用70%乙醇消毒。然后将管路从移液器吸头脱离，并连接至注射器。将管路剪至靠近致密细胞团的位置，并将其连接到针头的钝端。推动生理盐水，直至第一个细胞团到达针尖。然后将小鼠置于俯卧位，身体向右侧倾斜，并伸展右腿。将针头插入右大腿内侧内收肌与缝匠肌之间的内侧区域，深度为四到五毫米。然后在回撤针头约三毫米的同时注射细胞簇。旋转注射器，拔出针头，让小鼠恢复。移植后六周移植物恢复并进行组织切片后，进行免疫染色以进行后续成像分析。将四阶段胰腺前体细胞的单细胞悬液接种至微孔板中，以生成尺寸可控的三维聚集体。在24至48小时内，形成致密的球形细胞簇。荧光显微镜证实了报告基因标记的hPSC系中存在PDX1和胰岛素表达细胞。六周后，肉眼可见移植部位出现类似孔环状的团块，位于肌肉内。切除后，在体视显微镜下可识别出呈浅色球形带状结构的外植体。在移植动物中观察到C肽阳性细胞的强效检测信号。胰岛素染色证实移植物内存在人源β样细胞。检测到胰高血糖素和生长抑素阳性细胞，表明α细胞和δ细胞群体得以保留。本方案有助于开展体内功能检测，并评估移植的人源移植物的存活与成熟情况。最重要的注意事项是确保高质量的干细胞分化，以及在细胞簇形成过程中轻柔操作细胞，以最大限度地提高细胞活力并保证良好的细胞存活率。这些模型有助于研究单基因糖尿病和β细胞功能障碍背后的遗传机制。

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科研

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Developmental Biology

发育生物学

小鼠体内人类多能干细胞衍生胰腺内分泌细胞的肌肉内移植

本方案旨在小鼠肾包膜下清晰、简便地移植胰岛或细胞。细胞在最终用于移植的导管中被浓缩成团。该技术操作简便，可减少对细胞和小鼠造成的应激损伤。...

将胰岛移植到糖尿病小鼠的肾包膜下

本视频介绍了将人胰岛移植到小鼠眼球前房以监测人胰岛移植物再血管化的实验方案...

胰岛移植：一种将胰岛植入小鼠眼前房用于活体成像的方法

本方案演示了小鼠胰岛的分离及其在脱细胞支架上的接种。将支架支持的胰岛移植到链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠的附睾脂肪垫中。胰岛在移植部位存活，并逆转了高血糖状态。...

支架支持的胰岛移植至糖尿病小鼠附睾脂肪垫

介绍了一种在小鼠体内进行网膜移植胰岛的方法。分离的胰岛与水凝胶混合后，将混合物植入糖尿病小鼠的网膜囊内。随后监测血糖水平，并进行免疫组织化学分析。...

一种将胰岛移植至小鼠大网膜的方法

胰岛移植是一种实现1型糖尿病患者血糖正常化的方法。本文重点介绍通过门静脉途径进行移植的技术，以维持糖尿病小鼠的正常血糖水平。...

小鼠模型中胰岛的门静脉移植

我们描述了一种在超声引导下将小鼠来源的胰腺导管腺癌细胞系直接植入原位肿瘤部位的实验方案。该方法在注射后2至4周内即可通过超声扫描检测到胰腺肿瘤，且与手术原位植入相比，显著减少了肿瘤细胞在腹膜壁上的种植比例。...

超声引导下小鼠胰腺导管腺癌原位移植

我们提出了一种通过超声引导下注射人胰腺癌细胞建立微创原位胰腺癌模型并随后监测肿瘤生长的实验方案。 体内...

通过超声引导注射建立胰腺癌细胞原位异种移植模型

本方案描述了一种改进的方法，可提高人多能干细胞（hPSCs）在平面单层培养中衍生的胰腺前体细胞共表达PDX1和NKX6.1转录因子的效率。该方法通过更换新鲜基质、调控细胞密度以及解离内胚层细胞来实现。...

人多能干细胞在二维培养系统中向胰腺β细胞前体的分化

胰腺导管腺癌（PDAC）的同系小鼠原位异种移植模型能够重现疾病亚型的生物学特性、表型特征及治疗反应。由于其肿瘤进展迅速且可重复性高，这类模型被广泛应用于临床前研究。本文介绍了构建此类模型的常用方法，即将同系小鼠来源的PDAC细胞系接种至胰腺中。...

同基因小鼠原位异体移植模型构建胰腺癌模型

干细胞向胰岛细胞的分化为传统的糖尿病治疗和疾病建模提供了替代方案。本文介绍了一种详细的干细胞培养方案，该方案结合商用分化试剂盒与先前已验证的方法，有助于在体外生成可分泌胰岛素的干细胞来源胰岛细胞。...

人多能干细胞向胰岛素分泌型胰岛样细胞团的分化

本文介绍了一种定向分化及功能分析类β细胞的方法。我们描述了在生成胰岛素分泌型胰腺细胞前，人多能干细胞所需的最佳培养条件和传代方法。该六阶段分化过程从定型内胚层形成开始，最终获得能够响应葡萄糖刺激而分泌胰岛素的功能性类β细胞。...

从人多能干细胞生成功能性胰岛素分泌胰腺细胞的优化方案

了解将人多能干细胞衍生的胰腺内分泌细胞肌肉内移植到免疫缺陷小鼠体内的实验方法。该技术通过体内葡萄糖刺激胰岛素分泌评估胰岛功能，为糖尿病细胞治疗研究提供可重复的临床前模型。

小鼠肌肉内移植人多能干细胞衍生的胰腺内分泌细胞

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