Name: 利用基于MLV的假病毒识别SARS-CoV-2入侵抑制剂作为潜在抗病毒药物的程序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-27T14:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: 学习利用基于MLV的假病毒系统筛选SARS-CoV-2入侵抑制剂的方法。该方案可在BSL-2实验室安全条件下进行高通量抗病毒药物筛选，通过荧光素酶报告基因检测病毒进入效率，为抗新冠病毒药物研发提供可靠平台。

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感谢国家研究系统（SNI）和国家科学技术创新秘书处（SENACYT，巴拿马）在合同编号SENACYT No.031-2022和SNI合同No.050-2023项下提供的资金支持。我们还非常感谢Gary Whittaker博士捐赠质粒pCMV-MLVgagpol和pTG-Luc。

1. 使用支化聚乙烯亚胺（PEI）高效转染衍生自HEK293T的细胞
注意：所有步骤均须在生物安全柜中进行，并采用标准无菌技术和 BSL-2 操作规程。使用 HEK293T 衍生细胞进行转染及假病毒的制备。本方法中，细胞转染在经细胞培养处理的 6 孔板中进行。PEI 储存液的配制方法参照 Yang 及其同事（2017）先前所述12。在进行三质粒共转染以生成假病毒之前，建议优化 PEI 与质粒 DNA 的最佳比例，以确保高转染效率（超过 70–80%）。该优化可通过转染表达绿色荧光蛋白（GFP）的质粒，随后使用荧光显微镜观察荧光细胞的比例来完成。在优化过程中，每孔质粒 DNA 保持恒定为 2.5 µg，测试不同体积的 PEI（范围为 1–20 µL）。以下为本批次细胞和 PEI 的最佳条件：每孔加入 5 µL PEI 储存液（1 mg/mL）和 2.5 µg GFP 表达质粒，使用 6 孔板进行转染。
<ol>
	<li>转染前24小时，在6孔组织培养板中每孔接种7.5 × 105个HEK293来源的细胞，每孔总体积为2 mL完全培养基（DMEM-C：添加10%热灭活胎牛血清（FBS）、20 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、100 IU/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的DMEM培养基）。 
	注意：接种细胞时，避免以环形方式移动组织培养板，以免导致细胞在孔中央聚集，造成细胞分布不均，从而降低转染效率。一次实验使用一块6孔板即可，其中一孔设为细胞对照（非转染组），其余各孔用于测试不同比例的PEI-质粒DNA组合。</li>
	<li>将细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜。次日，确保细胞融合度约为50–60%。</li>
	<li>在转染当天，于无菌的1.5 mL微量离心管中制备PEI-质粒DNA复合物。
	<ol>
		<li>针对每个孔，准备一个PEI溶液管，其中含5 µL PEI储备液（1 mg/mL）溶于50 µL低血清培养基中；另准备一个DNA溶液管，其中含2.5 µg表达GFP的质粒DNA，溶于50 µL相同培养基中。</li>
		<li>若需转染多个孔，可按比例扩大溶液配制量。每管短暂涡旋混匀后离心5秒。室温（RT）孵育10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在此孵育期间，小心从6孔板各孔中移除培养基，注意避免破坏细胞单层。随后每孔缓慢加入1 mL完全转染培养基（DMEM-T，成分与DMEM-C相同，但不含抗生素）。</li>
	<li>制备转染复合物。10分钟孵育结束后，将50 µL DNA溶液加入PEI溶液管中。用移液器上下吹打6次迅速混匀，并在室温下准确孵育3分钟。立即逐滴将复合物加入对应孔中的细胞中。</li>
	<li>用封口膜密封板边缘，使用摆动转子和板桶在室温下以1,000 × g离心30分钟，离心过程中不启用刹车。</li>
	<li>离心结束后，轻柔移除封口膜，将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育3小时。</li>
	<li>孵育结束后，轻柔吸去各孔中的转染培养基，并缓慢替换为每孔2 mL预热的DMEM-C培养基。</li>
	<li>将转染后的细胞在37 °C、5% CO₂条件下继续孵育48小时。</li>
	<li>通过荧光显微镜观察GFP表达情况以评估转染效率。荧光阳性细胞比例应高于70–80%（图1）。此步骤对后续第2节方法的效率至关重要。</li>
</ol>
2. 生成携带SARS-CoV-2刺突蛋白和VSV-G的假病毒颗粒
注意：本方法采用与第1节相同的实验流程，不同之处在于不使用GFP质粒，而是使用最佳转染条件将细胞共转染三种生成假病毒所必需的质粒，以确保高转染效率。该方案使用6孔板中的HEK293T衍生细胞，足以满足以下三个必要条件：a）未转染的细胞（1孔）；b）仅转染MLV包装质粒和荧光素酶报告基因转移载体的细胞（1孔；无刺突蛋白假病毒）；c）同时转染上述两种质粒及表达刺突蛋白质粒以生成SARS-CoV-2假病毒的细胞（4孔）。此处使用的表达刺突蛋白的质粒编码SARS-CoV-2武汉株的刺突蛋白，并包含序列修饰，以促进该蛋白在假病毒中的高效表达。后续感染实验中需使用无刺突蛋白的假病毒作为对照，以验证假病毒在易感细胞中的刺突蛋白依赖性进入。同样，采用相同的实验设计生成VSV-G假病毒，用于后续潜在抑制化合物的反向筛选。若需要更多体积的假病毒，可将实验规模扩大至两个6孔板，这在后续的板离心步骤中也可能更为便利。
<ol>
	<li>转染前一天，按照第1节所述方法，将HEK293T来源的细胞接种至两块6孔板中。其中一块用于制备刺突蛋白假病毒（spike-PVs），另一块用于制备VSV-G假病毒（VSV-G-PVs）。</li>
	<li>转染当天，按照步骤1.3所示配制转染混合物，具体见表1。 
	注意：PEI溶液的配制方法如先前文献所述12。质粒pCMV-MLVgagpol和pTG-Luc由Millet和Whittaker提供8。质粒pVSV-G来自Gee等2020年的研究13。所有质粒均应提前制备为高质量的无内毒素质粒制剂。建议使用市售的质粒大提试剂盒，并在最后一步通过低吸附性0.2 µm针头滤器进行无菌过滤。</li>
	<li>按照第1节所述方法混匀各管，室温孵育10分钟。</li>
	<li>在孵育期间，小心移除6孔板中每孔的培养基，避免破坏细胞单层。缓慢向每孔加入1 mL预热的DMEM-T培养基，注意将培养基沿孔壁加入，避免直接冲击细胞。</li>
	<li>按照第1节所述方法制备转染复合物，并使用前述方案对细胞进行转染。</li>
	<li>转染后48小时孵育结束，收集上清液，转移至50 mL无菌锥形离心管中，在4 °C条件下以290 × g离心7分钟。收集无细胞的上清液，使用聚偏二氟乙烯（PVDF）材质、0.45 µm孔径的无菌瓶顶滤器进行过滤。将滤后液体分装为每管1 mL，保存于-80 °C。 
	​注意：假病毒颗粒在-80 °C条件下可稳定保存数月。为保持其感染活性，应避免反复冻融。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>用于SARS-CoV-2刺突蛋白假病毒（每孔）</td>
			<td>用于VSV-G假病毒（每孔）</td>
			<td>用于无刺突蛋白假病毒（每孔）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI溶液：</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI (1 mg/ml)1</td>
			<td>5 µL</td>
			<td>5 µL</td>
			<td>5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>低血清培养基</td>
			<td>45 µL</td>
			<td>45 µL</td>
			<td>45 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>质粒DNA溶液：2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-MLVgagpol</td>
			<td>0.79 µg</td>
			<td>0.79 µg</td>
			<td>0.79 µg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTG-luc</td>
			<td>0.92 µg</td>
			<td>0.92 µg</td>
			<td>0.92 µg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUNO1-spike</td>
			<td>0.79 µg</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pVSV-G</td>
			<td>-</td>
			<td>0.79 µg</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>低血清培养基</td>
			<td>加至50 µL</td>
			<td>加至50 µL</td>
			<td>加至50 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：制备转染混合物以生成PVs。
3. SARS-CoV-2 和 VSV-G 假病毒颗粒的滴定
注意：此步骤对于确认所制备的假病毒颗粒具有感染性以及确定后续应用（如化合物筛选）所需的最小有效体积至关重要。每次制备新的假病毒批次均应进行滴定。为此，使用对 SARS-CoV-2 高度易感的细胞（HSI 细胞），以递减量的假病毒进行感染。72 小时后，通过发光检测法检测荧光素酶活性，以监测由刺突蛋白-人 ACE2 相互作用或 VSV-G 与其他细胞受体相互作用介导的假病毒进入细胞情况。
<ol>
	<li>转导前一天，在96孔组织培养板中每孔接种2.5 × 104个HSI细胞，每孔加入50 µL完全培养基（DMEM-C）。每种待测假病毒剂量设置三个复孔，并设置感染对照孔（使用无刺突蛋白的假病毒）以及未感染细胞对照孔。将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下过夜培养。</li>
	<li>转导当天，将每种待测假病毒批次的冻存 aliquot 置于冰上解冻，并轻轻颠倒混匀。同时包括一管无刺突蛋白的对照假病毒。直接向各孔中加入不同体积的假病毒液（100、50、25、12.5、6.2、3.1、1.5 和 0.8 µL）。用DMEM-C补液至每孔总体积为150 µL。</li>
	<li>用封口膜密封培养板，在室温下以2,500 × g离心45分钟，不启用刹车。</li>
	<li>移除封口膜，将培养板在37 °C、5% CO₂条件下继续培养72小时。</li>
	<li>培养结束后，按照试剂盒说明书准备荧光素酶检测。将储存于-80 °C的荧光素酶底物和储存于-20 °C的5倍浓度荧光素酶检测裂解缓冲液解冻，并在室温下平衡10–15分钟。</li>
	<li>用无菌水将5×荧光素酶检测裂解缓冲液稀释至1×工作液，至少配制3 mL。</li>
	<li>使用多通道移液器缓慢而小心地吸出并弃去每孔中的上清液。</li>
	<li>使用多通道移液器向每孔加入30 µL 1×裂解缓冲液。将培养板置于板式振荡器上，在室温下以150 rpm振荡10分钟。在倒置显微镜下检查裂解是否完全（所有细胞应已裂解，肉眼无法分辨单个细胞）。 
	注意：应提前准备好微孔板读数仪，以便在加入底物后立即进行发光检测，确保数据一致性并避免信号衰减。</li>
	<li>将裂解液转移至不透明的白色96孔板中。</li>
	<li>向每孔加入50 µL荧光素酶底物，通过轻轻旋转培养板短暂混匀。将板放入化学发光检测仪中测定发光值。</li>
	<li>分析所得数据。
	<ol>
		<li>确认各对照组的发光值符合预期。未感染细胞的背景发光值应极低。 
		注意：感染无刺突蛋白假病毒的细胞发光值应与未感染细胞相近，而感染含刺突蛋白假病毒且剂量递减的细胞应表现出高且呈剂量依赖性的发光信号（图2）。VSV-G假病毒（VSV-G-PVs）产生的发光信号通常显著高于刺突蛋白假病毒（spike-PVs），约高出一个至两个数量级。</li>
		<li>在后续筛选实验中，应选择能够产生至少比未感染细胞高100至1000倍信号的假病毒用量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 使用刺突蛋白假病毒筛选抑制假病毒进入的化合物
<ol>
	<li>在96孔板中，每孔接种2.5 × 104个HSI细胞，每孔加入50 µL完全培养基（DMEM-C），具体操作如第3节所述。于37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜。
	<ol>
		<li>设计板图时，可将第1至第11列用于待测化合物加假病毒，第12列为对照组。在第12列中，分配4个孔作为病毒对照（仅假病毒），4个孔作为未感染且未处理的细胞对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>次日，在含0.5% DMSO的DMEM-C中对拟测试的化合物进行3倍系列稀释，起始浓度为50 µM（感染期间的终浓度分别为：50、16.6、5.5、1.8、0.6、0.2和0.06 µM）。
	<ol>
		<li>为方便操作，可在另一块96孔“稀释板”中进行稀释，先在该板中完成系列稀释，再将50 µL稀释液转移至含细胞的板中。</li>
		<li>若待测化合物数量极大（达数百种或更多），可将初始稀释系列减少至约4个浓度点，每个浓度点使用单个孔，并考虑进行初筛。随后，对潜在阳性化合物以相同的起始浓度（50 µM）重新测试，采用7个浓度点的3倍系列稀释，每个浓度设三个重复。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>待化合物稀释液准备好后，使用多通道移液器轻轻吸除细胞培养基，向各对应孔中加入50 µL化合物稀释液。于37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时。第12列的对照组仅加入DMEM-C。</li>
	<li>不移除化合物，向每孔加入预定量的SARS-CoV-2假病毒（以50 µL完全培养基配制），同时保持化合物浓度不变。用封口膜密封培养板。</li>
	<li>将培养板在室温下以2,500 × g离心45分钟（无刹车），随后去除封口膜，于37 °C、5% CO2条件下继续孵育72小时。</li>
	<li>按照第3节所述方法进行基于荧光素酶的感染性定量分析。</li>
	<li>进行数据分析。
	<ol>
		<li>将发光值导出至电子表格中，整理数据以便后续导入数据分析与绘图软件。</li>
		<li>绘制柱状图，显示各浓度点的平均值，并包含标准误（SEM）误差线。同时绘制阳性对照（仅假病毒）和阴性对照（未感染细胞）的数值。 
		注：若满足以下条件，则认为实验结果有效：1）未感染细胞的信号值极低；2）假病毒对照组信号值较高；3）阳性抑制对照（如阿比朵尔或hACE2-Fc）表现出剂量依赖性的感染抑制作用（图3A、B）。</li>
		<li>随后观察未知化合物产生的数值，判断是否存在抑制作用以及是否呈现剂量依赖性效应。若存在，则将这些化合物纳入进一步确证分析。 
		注：为确证潜在阳性化合物，请按以下步骤操作。首先，按照步骤4.2建议重新测试潜在阳性化合物。若确认存在剂量反应效应，则使用相同的稀释系列进行反向筛选，以VSV-G假病毒进行感染。该测试用于判断进入抑制是否特异性地针对刺突蛋白-ACE2相互作用，而非干扰感染细胞中荧光素酶生成过程中的其他后续步骤（图3A、B）。在此测试中，阳性化合物应对VSV-G假病毒无抑制活性。若结果符合预期，则应使用细胞活力检测（如第5节所示MTT法）测试相同浓度系列的细胞毒性。综上，一个潜在阳性化合物应表现为：抑制SARS-CoV-2刺突蛋白假病毒进入，对VSV-G假病毒无抑制或抑制较弱，且对细胞活力无影响或仅有明显更弱的抑制作用。利用发光数据拟合剂量反应曲线，可估算假病毒进入的半数最大抑制浓度（IC50），以及来自活力实验的半数细胞毒性浓度（CC50）。CC50 / IC50比值用于计算选择性指数（SI），该指数是评估阳性化合物潜在应用价值的重要指标。有关剂量反应曲线分析及IC50和CC50估算的详细操作流程已有文献详细描述14。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
基于 MTT 的细胞活力检测
<ol>
	<li>在96孔板中，每孔接种2.5 × 104个HSI细胞，加入50 µL DMEM-C培养基。于37 °C、5% CO₂条件下过夜培养。确保次日细胞融合度约为50%。根据待评估化合物的不同浓度、未处理细胞组以及仅含培养基的空白孔，设置三复孔，准备足够数量的孔。待测潜在阳性化合物的浓度应与PV进入抑制实验中所用浓度一致。</li>
	<li>培养后，小心吸去培养基，每孔加入含不同浓度待测化合物、0.5% DMSO的完全培养基100 µL。</li>
	<li>将培养板在室温下以2,500 ×g离心45分钟（无刹车），随后于37 °C、5% CO₂条件下继续培养72小时。此步骤的操作方式与前一部分完全相同，唯一区别是不添加PV颗粒。</li>
	<li>使用DMEM配制0.5 mg/mL的MTT溶液。经0.2 µm滤膜过滤除菌后避光保存。 
	注意：3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四氮唑溴盐（MTT）对光敏感，应冷冻保存并避免光照。</li>
	<li>小心吸去每孔中的培养基，每孔加入100 µL MTT溶液。于37 °C、5% CO2条件下孵育2小时。</li>
	<li>在孵育期间，配制含有40 mM HCl的异丙醇溶解液。</li>
	<li>使用多通道移液器小心吸去MTT溶液，注意不要扰动各孔底部的甲臜结晶。</li>
	<li>向每孔加入100 µL溶解液。用铝箔纸包裹培养板，置于摇床上以150 rpm振荡15分钟。</li>
	<li>在570 nm和630 nm波长下测定吸光度。</li>
	<li>进行数据分析。
	<ol>
		<li>根据原始光密度值，用每孔在570 nm处测得的数值减去630 nm处的数值。然后计算未处理细胞孔校正值的平均值，并将这些未处理细胞定义为100%存活率。</li>
		<li>使用以下公式将处理组细胞的数值相对于未处理组进行归一化： 
		存活率 (%) = <img alt="微孔板实验中计算吸光度百分比的公式，处理组与未处理组比较。" src="/files/ftp_upload/69628/69628eq1.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1780372819000" data-alt="公式1"></li>
	</ol>
	</li>
	<li>以柱状图形式绘制存活率百分比，表示为重复实验的均值 ± 标准误。使用数据分析与绘图软件中的统计方法进行进一步统计分析，将不同浓度下的存活率与未处理细胞对照组进行比较。</li>
	<li>采用非参数Kruskal-Wallis检验结合Dunn多重比较校正法，将各浓度点的均值与仅含DMSO处理的细胞组进行比较（当p值&lt; 0.05时认为差异具有统计学意义）。若需根据光密度值绘制剂量-反应曲线并估算CC50，可参考 elsewhere14中报道的方法。</li>
</ol>

<ol><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+and+emerging+variants%3A+Unmasking+structure%2C+function%2C+infection%2C+and+immune+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 and emerging variants: Unmasking structure, function, infection, and immune escape mechanisms.</a> Front Cell Infect Microbiol. 12, 869832(2022).</li>
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<li>Cao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+design+of+picomolar+SARS-CoV-2+miniprotein+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">De novo design of picomolar SARS-CoV-2 miniprotein inhibitors.</a> Science. 370 (6515), 426-431 (2020).</li>
<li>Monteil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+SARS-CoV-2+infections+in+engineered+human+tissues+using+clinical-grade+soluble+human+ACE2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of SARS-CoV-2 infections in engineered human tissues using clinical-grade soluble human ACE2.</a> Cell. 181 (4), 905-913.e7 (2020).</li>
<li>Ahmad, I., Pawara, R., Surana, S., Patel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+repurposed+ACE2+inhibitors%3ASARS-CoV-2+entry+blockers+of+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Top+Curr+Chem%22%5BJournal%5D)">The repurposed ACE2 inhibitors:SARS-CoV-2 entry blockers of COVID-19.</a> Top Curr Chem. 379 (6), 40(2021).</li>
<li>Alqaaf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+natural+products+as+potential+inhibitors+of+SARS-CoV-2+spike+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Discovering natural products as potential inhibitors of SARS-CoV-2 spike proteins.</a> Sci Rep. 15 (1), 200(2025).</li>
<li>Chan, C. C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+small-molecule+inhibitors+of+SARS-CoV-2+by+chemical+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharm+Sin+B%22%5BJournal%5D)">Identification of novel small-molecule inhibitors of SARS-CoV-2 by chemical genetics.</a> Acta Pharm Sin B. 14 (9), 4028-4044 (2024).</li>
<li>Lei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralization+of+SARS-CoV-2+spike+pseudotyped+virus+by+recombinant+ACE2-Ig%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Neutralization of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus by recombinant ACE2-Ig.</a> Nat Commun. 11 (1), 2070(2020).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-influenza+virus+drug%2C+arbidol+is+an+efficient+inhibitor+of+SARS-CoV-2+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discov%22%5BJournal%5D)">The anti-influenza virus drug, arbidol is an efficient inhibitor of SARS-CoV-2 in vitro.</a> Cell Discov. 6 (1), 28(2020).</li>
<li>Kang, Y., Shi, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arbidol%3AThe+current+demand%2C+strategies%2C+and+antiviral+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Immun+Inflamm+Dis%22%5BJournal%5D)">Arbidol:The current demand, strategies, and antiviral mechanisms.</a> Immun Inflamm Dis. 11 (8), e984(2023).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

已有文献报道，MLV系统在构建其他病毒假型方面的多功能性，适用于多种重要病毒，例如埃博拉病毒18、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）8、严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）19、拉克罗斯病毒（La Crosse virus）20、汉坦病毒（Hantavirus）20、维斯na病毒（Visna virus）21、沙粒病毒（Arenavirus）22、流感病毒（Influenza virus）23等。这些假型病毒在多种应用中具有重要价值，包括研究病毒嗜性19、在基因治疗中的潜在应用24、中和抗体的检测与定量25</s...

2019年末，严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的出现引发了一场全球大流行，导致全球数百万人死亡，且随着传染性更强、免疫逃逸潜力更高的新变异株不断出现，该病毒仍持续构成威胁1。作为一种冠状病毒科的有包膜RNA病毒，SARS-CoV-2通过其三聚体刺突（S）糖蛋白与宿主细胞的血管紧张素转换酶2（ACE2）受体结合，并经由TMPRSS2及其他宿主蛋白酶进行蛋白水解激活，从而介导病毒进入宿主细胞2,3。尽管目前已开发出多种治疗手段以缓解COVID-19症状，但病毒持续进化及新变异株的快速出现，凸显了建立安全且可扩展的研究系统以探索病毒进入机制并评估靶向感染早期阶段的新型抗病毒化合物的迫切需求4。
由于SARS-CoV-2病毒具有较高的传播潜力，在一些地区仍被归类为生物安全等级3级（biosafety level 3）的病原体5。因此，任何涉及病毒复制的实验操作都必须在高等级防护的BSL-3实验室中进行，这限制了大多数研究机构开展相关科学研究的能力。基于假病毒（pseudotyped virus）的系统，也称为伪病毒（PVs），提供了一种实用的替代方案，可在生物安全等级2级（BSL-2）实验室中进行病毒入侵研究，从而提升全球科研工作的可及性6。携带SARS-CoV-2刺突蛋白的假病毒颗粒不具备复制能力，因此可作为安全的替代工具用于评估病毒进入细胞的过程，并筛选小分子抑制剂7。这些颗粒可被设计为携带荧光素酶或荧光报告基因，通过检测感染细胞中的报告信号，实现对感染情况的快速、定量分析。基于小鼠白血病病毒（murine leukemia virus, MLV）或慢病毒骨架的假病毒系统已被广泛应用于SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、埃博拉病毒等多种病毒的入侵机制研究8,9,10,11。
在这些实验方案中，我们描述了基于Millet和Whittaker报道的研究8，使用三质粒系统生成基于MLV的假病毒（PVs）。所用质粒包括编码MLV核心基因gag-pol的包装质粒（pCMV-MLVgagpol）、编码报告基因荧光素酶的转移载体（pTG-Luc），以及表达对应于原始Wuhan-Hu-1变异株的SARS-CoV-2刺突糖蛋白的质粒。此外，还利用水疱性口炎病毒（VSV-G）的G糖蛋白生成假病毒，用于后续对潜在阳性化合物的反向筛选。假病毒在HEK293来源的细胞中产生，并用于感染稳定表达hACE2和TMPRSS2的高敏感性细胞。首先使用表达绿色荧光蛋白（GFP）的质粒评估转染效率。随后，在优化的转染条件下，通过共转染上述三种质粒生成假病毒，并对产生的病毒进行滴度测定。利用适当浓度的假病毒，在96孔板中开展检测，以筛选能够抑制病毒进入细胞的化合物。本方案采用支化聚乙烯亚胺（PEI）作为经济高效的转染试剂，便于实验操作的实施。

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m 低蛋白吸附注射器滤器&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>720-1320</td><td>注射器滤器（0.2 &amp;mu;m，13 mm，PES，无菌）</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA 1X 溶液</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红</td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m PVDF 瓶顶过滤装置&amp;nbsp;</td><td>Avantor</td><td>514-1045</td><td>真空瓶顶过滤系统（PVDF，250 ml，50 mm，0.45 &amp;micro;m）</td></tr><tr><td>1.5 mL 无菌微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>30123611</td><td>安全锁&amp;nbsp;管</td></tr><tr><td>100 X 青霉素-链霉素溶液</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩</td></tr><tr><td>5 X 荧光素酶检测裂解缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>E2650</td><td>属于 Promega Bright-Glo 荧光素酶检测试剂盒的一部分</td></tr><tr><td>50 mL 无菌锥形离心管</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>352070</td><td>50 mL 高透明度聚丙烯离心管，锥底，无菌</td></tr><tr><td>6 孔组织培养板</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>细胞培养处理多孔板</td></tr><tr><td>96 孔组织培养板</td><td>Thermo Scientific</td><td>168055</td><td>Nunc&amp;trade; MicroWell&amp;trade; 96 孔，Nunclon Delta 处理，平底微孔板</td></tr><tr><td>盐酸阿比朵尔</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0860</td><td></td></tr><tr><td>支化聚乙烯亚胺，25 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜&amp;nbsp;（FV 3000）</td><td>Olympus Co.</td><td>SKU: FV3000</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基），含：高糖、L-谷氨酰胺、酚红、丙酮酸钠</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td>经热灭活处理（56&amp;deg;C，30 分钟）</td></tr><tr><td>HEK293T 来源细胞（Lenti-X 293T 细胞系）</td><td>Takara Bio</td><td>632180</td><td>高转染效率的 HEK293 细胞亚克隆，支持高水平病毒蛋白表达</td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>高易感性感染细胞（293T-ACE2.TMPRSS2 (mCherry) 细胞系）</td><td>BEI Resources</td><td>NR-55293</td><td>经基因改造稳定表达 ACE2 和 TMPRSS2 的 HEK293T 细胞系</td></tr><tr><td>盐酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758-500ML</td><td></td></tr><tr><td>倒置相差显微镜&amp;nbsp;</td><td>Olympus Co.&amp;nbsp;</td><td>SKU: 2404040005</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>荧光素酶底物</td><td>Promega</td><td>E2650</td><td>属于 Bright-Glo 荧光素酶检测试剂盒的一部分</td></tr><tr><td>带发光检测功能的微孔板读数仪</td><td>Agilent BioTek</td><td>BTH1MG</td><td></td></tr><tr><td>MTT [3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td></td></tr><tr><td>不透明白色 96 孔板</td><td>Corning</td><td>3917</td><td>96 孔实心白色平底聚苯乙烯组织培养处理微孔板</td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Bemis</td><td>PM999</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3-EGFP 质粒</td><td>Addgene</td><td>13031</td><td>pcDNA3-EGFP 由 Doug Golenbock 惠赠（Addgene 质粒 # 13031；http://n2t.net/addgene:13031；RRID:Addgene_13031）</td></tr><tr><td>pCMV-MLVgagpol 质粒</td><td>-</td><td>-</td><td>由 Gary Whittaker 博士惠赠&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>磷酸盐缓冲液，1X，不含钙和镁</td></tr><tr><td>Promega PureYield 质粒大提系统</td><td>Promega</td><td>A2393</td><td></td></tr><tr><td>pTG-Luc 质粒</td><td>-</td><td>-</td><td>由 Gary Whittaker 博士惠赠&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>pUNO1-SARS-CoV-2 刺突蛋白（武汉株）质粒</td><td>Invivogen</td><td>p1-spike</td><td></td></tr><tr><td>pVSV-G 质粒</td><td>Addgene</td><td>138479</td><td>pVSV-G 由 Akitsu Hotta 惠赠（Addgene 质粒 # 138479；http://n2t.net/addgene:138479；RRID:Addgene_138479）</td></tr><tr><td>重组人 ACE2-Fc 融合蛋白</td><td>Invivogen</td><td>fc-hace2</td><td></td></tr><tr><td>低血清培养基（Opti-MEM）</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Opti-MEM 低血清培养基</td></tr></tbody></table>

使用基于mlv的假病毒鉴定sars-cov-2进入抑制剂作为潜在抗病毒药物的实验方案

Procedures for the Identification of SARS-CoV-2 Entry Inhibitors as Potential Antivirals using MLV-Based Pseudoviruses

SARS-CoV-2 病毒是一种新出现的动物源性病原体，自2019年出现以来，在全球范围内造成了巨大的疾病负担和死亡率。安全且易于获取的平台对于评估病毒进入机制及潜在抗病毒化合物至关重要，有助于持续针对新出现的变异株开展药物研发。本文介绍了一种高度优化的实验方案，用于制备表达 SARS-CoV-2 刺突蛋白并携带荧光素酶报告基因的鼠类白血病病毒（MLV）基础的假病毒颗粒，从而可在生物安全二级（BSL-2）条件下研究病毒进入过程。文中详述了优化细胞系的使用、利用低成本试剂实现高效转染、高效假病毒的生产，以及通过滴定感染性以确定筛选实验所需的最低病毒输入量。代表性结果表明，与未感染对照组相比，感染细胞中可检测到显著的荧光素酶活性；而无刺突蛋白对照组及 VSV-G 假病毒对照组则验证了该实验的特异性。此外，该系统支持化合物筛选，可通过量化其对病毒进入的抑制作用，并结合 MTT 活性检测评估细胞毒性，实现综合评价。总体而言，该可重复且可扩展的实验方案为中高通量筛选新型病毒进入抑制剂提供了一个可靠的平台，有助于发现抗病毒候选分子，并推动对 SARS-CoV-2 病毒进入机制的研究。

已有多种转染方法被报道可用于生成假型病毒（PVs），包括磷酸钙法15、基于脂质的方法16以及线性和支化聚乙烯亚胺（PEI）法。本文表明，使用支化PEI转染HEK293T来源的细胞可实现高效转染（图1），其效率通常与使用商业化的脂质体转染试剂的方法相当（数据未显示）。此处展示的是在本实验条件下确定的PEI最优用量的代表性结果，即在第1节所述条件下，每2.5 µg表达GFP的质粒使用5 µL PEI储存液。然而，建议在每次使用新的质粒批次或PEI时，在此步骤中进行优化实验，测试多种表达GFP的质粒与PEI的比例，保持质粒用量恒定，而PEI用量则在1至20 µL之间梯度变化（PEI储存液浓度为1 mg/mL）。随后选择最佳比例，再进行假型病毒的制备。
需要注意的是，转染效率高达70-80%以上对于获得高滴度病毒至关重要。该效率可通过其他方法（如流式细胞术）进行更严格的定量；然而，荧光显微镜可作为一种快速、定性且便捷的方法，在转染48小...

本文介绍了利用荧光素酶报告系统制备SARS-CoV-2假病毒颗粒的方法及其在筛选病毒进入抑制剂中的应用。本方案以两种不同的进入抑制剂为例进行演示：重组人ACE2-Fc融合蛋白和小分子化合物阿比多尔。

使用基于MLV的假病毒鉴定SARS-CoV-2进入抑制剂作为潜在抗病毒药物的实验方案

SARS-CoV-2 病毒是一种新发的动物源性病原体，自出现以来已在全球范围内导致大量疾病负担和死亡病例。

我们的研究重点是利用假病毒系统筛选能够阻断SARS-CoV-2进入细胞的抑制剂。研究SARS-CoV-2的进入过程通常需要高等级生物安全防护实验室，一般是BSL-3实验室。本方案可在标准的BSL-2实验室中安全地开展基于假病毒的抗病毒筛选。首先，将一个六孔组织培养板放入生物安全柜中，每孔接种 7.5 × 10⁵ 个 HEK 293 衍生细胞，加入 2 mL 完全培养基。将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育过夜。次日，确认细胞融合度达到约 50% 至 60%。第二天，取5微升浓度为1毫克/毫升的PEI储备液，加入到1.5毫升微量离心管中的50微升低血清培养基内，配制聚乙烯亚胺（PEI）溶液。另取一支1.5毫升微量离心管，加入2.5微克表达GFP的质粒至50微升相同培养基中，配制DNA溶液。每管短暂涡旋混匀后，离心5秒，室温孵育。在10分钟孵育期间，小心地从六孔板的每个孔中移除培养基，注意不要破坏细胞单层，然后向每个孔中加入1毫升不含抗生素的完全转染培养基。孵育结束后，将50微升DNA溶液加入含有PEI溶液的离心管中。用移液器快速吹打混合6次，室温下准确孵育3分钟。然后迅速将PEI-DNA复合物逐滴加入对应的孔中。现在，用封口膜密封培养板边缘，使用摆动转子和板桶在室温下以1000 ×g离心30分钟，离心过程中不刹车。离心结束后，轻轻移除封口膜，将培养板置于37°C、5% CO₂条件下孵育3小时。然后，将每孔中的转染培养基轻轻替换为2毫升预热的完全DMEM培养基。将转染后的细胞在37°C、5% CO₂条件下培养48小时，并通过荧光显微镜观察GFP表达情况来评估转染效率。按照之前的方法，将HEK 293T来源的细胞接种至两块6孔板中。将一个培养板用于SARS-CoV-2刺突蛋白假病毒的制备，另一个培养板用于VSVG假病毒的制备。在实验当天配制转染混合物及PEI-DNA复合物，并于室温孵育10分钟。孵育期间，小心地从六孔板各孔中移除培养基，注意不要破坏细胞单层。将一毫升预热的不含抗生素的完全转染培养基缓慢加入每个孔中，使培养基沿孔壁流下。将已制备的转染复合物加入细胞中，以完成转染，操作方法如前所述。转染后培养48小时，收集各孔的上清液至50毫升无菌锥形离心管中，在4°C条件下以290 ×g离心7分钟。收集无细胞上清液，并通过无菌的0.45微米聚偏二氟乙烯顶置式滤器过滤单元进行过滤。将过滤后的上清液分装为每份1毫升，于-80摄氏度保存。在96孔组织培养板中，每孔加入50微升完全DMEM培养基，接种2.5×10⁴个HSI细胞，该细胞系对SARS-CoV-2高度易感。为每种待测条件准备并标记三个复孔，包括无火花假病毒感染组和未感染对照组。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜。在转导当天，将每批假病毒的一份等分试样在冰上解冻，并轻轻颠倒混匀，包括一份无刺突蛋白对照样品。将所需体积的假病毒制备液直接加入指定的孔中。用完全DMEM调整每孔体积至150 µL。然后用封口膜密封培养板，在室温下以2,500 ×g离心45分钟，不启用刹车。移除封口膜，将培养板在37°C、5% CO₂条件下孵育72小时。孵育后，根据制造商说明书准备荧光素酶检测试剂。将荧光素酶底物和5X荧光素酶检测裂解缓冲液在室温下解冻10至15分钟。用无菌水将5X荧光素酶检测裂解缓冲液稀释至1X。小心吸出并弃去上清液。随后，向每个孔中加入30 µL 1×裂解缓冲液。将板置于板式摇床上，在室温下以150 rpm振荡10分钟。在倒置显微镜下确认细胞完全裂解，以确保细胞已完全裂解且无法分辨。然后将裂解液转移至不透明白色96孔板中。向每孔加入50 µL荧光素酶底物。轻轻晃动培养板使其内容物混合均匀，然后将培养板放入发光检测仪中测定发光信号。按照之前所述方法，在96孔板中每孔加入50微升完全DMEM培养基，接种2.5 × 10⁴个HSI细胞。在37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。第二天，将待测化合物（如阿比多尔）在含有0.5%二甲基亚砜的完全DMEM培养基中进行一至三倍的系列稀释。使用多通道移液器，轻轻吸出每孔中的培养基。向每个孔中加入50微升相应的化合物稀释液，同时向第12列对照孔中仅加入完全DMEM培养基。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。不移除化合物，直接向每孔加入50微升用含相同化合物浓度的完全培养基稀释的SARS-CoV-2刺突假病毒。用封口膜密封培养板。在室温下以 2,500 ×g 离心 45 分钟，不刹车。去除 Parafilm 后，将培养板置于 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 72 小时。最后，采用先前所述的荧光素酶检测法定量感染性。使用支化PEI转染HEK 293T来源的细胞，可获得较高的转染效率，在转染48小时后，约有70%的细胞呈GFP阳性。以不同浓度的SARS-CoV-2刺突蛋白假病毒或VSVG假病毒感染易感的HSI细胞，结果显示随着假病毒输入量的增加，发光信号呈剂量依赖性增强。无刺突蛋白的假病毒和未感染细胞的发光水平极低。测试了化合物阿比多尔抑制假病毒进入的能力，结果显示其对刺突蛋白假病毒引起的荧光素酶活性具有明显的剂量依赖性抑制作用，而对VSVG假病毒的抑制作用较弱。该检测的Z'因子为0.54，表明适用于筛选目的。与仅使用0.5%二甲基亚砜溶剂处理的细胞相比，使用30微摩尔浓度起始的阿比多尔处理对细胞活力无显著影响。本方案通过优化条件实现了高滴度假病毒的制备。这使得研究人员能够检测假病毒进入过程，并鉴定可抑制SARS-CoV-2刺突蛋白介导感染的化合物。高转染效率对于产生高滴度的假病毒并在下游实验中获得可靠的感染信号至关重要。该系统支持针对新出现的 SARS-CoV-2 变异株进行高通量抗病毒筛选和进入抑制剂评价，且可轻松改造用于生成携带其他病毒包膜蛋白的假病毒。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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