使用基于MLV的假病毒鉴定SARS-CoV-2进入抑制剂作为潜在抗病毒药物的实验方案

我们的研究重点是利用假病毒系统筛选能够阻断SARS-CoV-2进入细胞的抑制剂。研究SARS-CoV-2的进入过程通常需要高等级生物安全防护实验室，一般是BSL-3实验室。本方案可在标准的BSL-2实验室中安全地开展基于假病毒的抗病毒筛选。

首先，将一个六孔组织培养板放入生物安全柜中，每孔接种 7.5 × 10⁵ 个 HEK 293 衍生细胞，加入 2 mL 完全培养基。将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育过夜。次日，确认细胞融合度达到约 50% 至 60%。

第二天，取5微升浓度为1毫克/毫升的PEI储备液，加入到1.5毫升微量离心管中的50微升低血清培养基内，配制聚乙烯亚胺（PEI）溶液。另取一支1.5毫升微量离心管，加入2.5微克表达GFP的质粒至50微升相同培养基中，配制DNA溶液。每管短暂涡旋混匀后，离心5秒，室温孵育。

在10分钟孵育期间，小心地从六孔板的每个孔中移除培养基，注意不要破坏细胞单层，然后向每个孔中加入1毫升不含抗生素的完全转染培养基。孵育结束后，将50微升DNA溶液加入含有PEI溶液的离心管中。用移液器快速吹打混合6次，室温下准确孵育3分钟。

然后迅速将PEI-DNA复合物逐滴加入对应的孔中。现在，用封口膜密封培养板边缘，使用摆动转子和板桶在室温下以1000 ×g离心30分钟，离心过程中不刹车。离心结束后，轻轻移除封口膜，将培养板置于37°C、5% CO₂条件下孵育3小时。

然后，将每孔中的转染培养基轻轻替换为2毫升预热的完全DMEM培养基。将转染后的细胞在37°C、5% CO₂条件下培养48小时，并通过荧光显微镜观察GFP表达情况来评估转染效率。按照之前的方法，将HEK 293T来源的细胞接种至两块6孔板中。

将一个培养板用于SARS-CoV-2刺突蛋白假病毒的制备，另一个培养板用于VSVG假病毒的制备。在实验当天配制转染混合物及PEI-DNA复合物，并于室温孵育10分钟。孵育期间，小心地从六孔板各孔中移除培养基，注意不要破坏细胞单层。

将一毫升预热的不含抗生素的完全转染培养基缓慢加入每个孔中，使培养基沿孔壁流下。将已制备的转染复合物加入细胞中，以完成转染，操作方法如前所述。转染后培养48小时，收集各孔的上清液至50毫升无菌锥形离心管中，在4°C条件下以290 ×g离心7分钟。

收集无细胞上清液，并通过无菌的0.45微米聚偏二氟乙烯顶置式滤器过滤单元进行过滤。将过滤后的上清液分装为每份1毫升，于-80摄氏度保存。在96孔组织培养板中，每孔加入50微升完全DMEM培养基，接种2.5×10⁴个HSI细胞，该细胞系对SARS-CoV-2高度易感。为每种待测条件准备并标记三个复孔，包括无火花假病毒感染组和未感染对照组。

将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜。在转导当天，将每批假病毒的一份等分试样在冰上解冻，并轻轻颠倒混匀，包括一份无刺突蛋白对照样品。将所需体积的假病毒制备液直接加入指定的孔中。

用完全DMEM调整每孔体积至150 µL。然后用封口膜密封培养板，在室温下以2,500 ×g离心45分钟，不启用刹车。移除封口膜，将培养板在37°C、5% CO₂条件下孵育72小时。

孵育后，根据制造商说明书准备荧光素酶检测试剂。将荧光素酶底物和5X荧光素酶检测裂解缓冲液在室温下解冻10至15分钟。用无菌水将5X荧光素酶检测裂解缓冲液稀释至1X。

小心吸出并弃去上清液。随后，向每个孔中加入30 µL 1×裂解缓冲液。将板置于板式摇床上，在室温下以150 rpm振荡10分钟。

在倒置显微镜下确认细胞完全裂解，以确保细胞已完全裂解且无法分辨。然后将裂解液转移至不透明白色96孔板中。向每孔加入50 µL荧光素酶底物。

轻轻晃动培养板使其内容物混合均匀，然后将培养板放入发光检测仪中测定发光信号。按照之前所述方法，在96孔板中每孔加入50微升完全DMEM培养基，接种2.5 × 10⁴个HSI细胞。在37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。

第二天，将待测化合物（如阿比多尔）在含有0.5%二甲基亚砜的完全DMEM培养基中进行一至三倍的系列稀释。使用多通道移液器，轻轻吸出每孔中的培养基。向每个孔中加入50微升相应的化合物稀释液，同时向第12列对照孔中仅加入完全DMEM培养基。

在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。不移除化合物，直接向每孔加入50微升用含相同化合物浓度的完全培养基稀释的SARS-CoV-2刺突假病毒。用封口膜密封培养板。

在室温下以 2,500 ×g 离心 45 分钟，不刹车。去除 Parafilm 后，将培养板置于 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 72 小时。最后，采用先前所述的荧光素酶检测法定量感染性。

使用支化PEI转染HEK 293T来源的细胞，可获得较高的转染效率，在转染48小时后，约有70%的细胞呈GFP阳性。以不同浓度的SARS-CoV-2刺突蛋白假病毒或VSVG假病毒感染易感的HSI细胞，结果显示随着假病毒输入量的增加，发光信号呈剂量依赖性增强。

无刺突蛋白的假病毒和未感染细胞的发光水平极低。测试了化合物阿比多尔抑制假病毒进入的能力，结果显示其对刺突蛋白假病毒引起的荧光素酶活性具有明显的剂量依赖性抑制作用，而对VSVG假病毒的抑制作用较弱。该检测的Z'因子为0.54，表明适用于筛选目的。

与仅使用0.5%二甲基亚砜溶剂处理的细胞相比，使用30微摩尔浓度起始的阿比多尔处理对细胞活力无显著影响。本方案通过优化条件实现了高滴度假病毒的制备。这使得研究人员能够检测假病毒进入过程，并鉴定可抑制SARS-CoV-2刺突蛋白介导感染的化合物。

高转染效率对于产生高滴度的假病毒并在下游实验中获得可靠的感染信号至关重要。该系统支持针对新出现的 SARS-CoV-2 变异株进行高通量抗病毒筛选和进入抑制剂评价，且可轻松改造用于生成携带其他病毒包膜蛋白的假病毒。