Name: 利用细胞外通量分析研究原级小胶质细胞的糖解作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-10T12:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 学习利用细胞外通量分析仪测定原代小胶质细胞的糖酵解活性，通过实时监测细胞外酸化率评估炎症刺激下的代谢变化。该方法为神经免疫学研究提供了可靠的技术平台。

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本工作由DKK获得的CIHR项目基金资助。特此感谢Craig Moore博士为Seahorse XFe24分析仪提供的RTI支持。

所有动物实验均按照加拿大动物护理委员会的指南进行，并已获得纽芬兰纪念大学动物护理委员会在协议编号22-01-DK下的批准。
1. 实验开始前的准备工作
<ol>
	<li>通过向不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 1x HBSS 中加入 10 mM HEPES 来配制解离溶液。</li>
	<li>通过混合 1 mL 2.5% 胰蛋白酶（10x 储存液，未稀释）、2 mL 解离溶液和 200 µL DNase I（1 mg/mL）来配制消化溶液（每 2–3 个脑组织使用）。</li>
	<li>通过在 DMEM 中添加 10% FBS、1x Glutamax 和 1x 抗生素/抗真菌剂来配制混合胶质细胞培养基。</li>
	<li>通过在 DMEM 中添加 10% FBS、1x Glutamax、1x MEM NEAA、1x 丙酮酸钠和 1x 青霉素/链霉素来配制小胶质细胞培养基。</li>
</ol>
2. 混合神经胶质细胞培养的接种（图2A）
<ol>
	<li>第1天：
	<ol>
		<li>从C57BL/6C小鼠中收集出生后第0至第2天（P0–P2）的幼崽，使用体视显微镜分离大脑皮层并去除软脑膜。随后将皮层组织置于解剖液中剪碎成小块，转移至15 mL锥形管中，静置使组织沉降至管底。</li>
		<li>倾析去除消化液，每2–3个脑组织加入3 mL消化溶液。使用2 mL血清移液管轻轻吹打，以解离组织。</li>
		<li>将试管置于37 °C培养箱内的旋转仪上，每8分钟用2 mL移液管吹打混匀一次，共约24分钟。</li>
		<li>组织消化完成后，以 300 x g 室温（RT）孵育5分钟。然后，弃去上清液，将沉淀物重悬于5 mL混合胶质细胞培养基中。</li>
		<li>使用5 mL注射器连接18号针头重悬细胞，随后通过70 µm尼龙细胞滤网过滤。将收集的细胞再次以300 x g 室温下孵育5分钟。</li>
		<li>将沉淀重悬于1 mL混合胶质细胞培养基中，反复吹打以去除细胞团块，随后再用较大体积的培养基重悬，每瓶T75培养瓶补至12 mL（建议每瓶接种2–3个脑皮层组织） 
		注意：无需使用多聚-D-赖氨酸或其他试剂包被培养瓶。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天，更换全部培养基，并加入新鲜的混合胶质细胞培养基。</li>
	<li>第3天，更换约2/3rd 更换为新鲜的混合胶质细胞培养基，继续培养细胞7天，总计培养10天。 
	注意：此时可观察到星形胶质细胞层。</li>
	<li>第6天，更换2/3的培养基为新鲜的混合胶质细胞培养基。确认存在融合的星形胶质细胞层。</li>
</ol>
3. 获取纯化的原代小胶质细胞（图2A）
注意：大约第10天，在星形胶质细胞层表面可见漂浮的小而圆形的细胞；这些细胞主要是小胶质细胞（图2B）。
<ol>
	<li>在37 °C、250 rpm条件下振荡培养2小时。将含有悬浮细胞的全部培养基转移至15 mL锥形管中，于300 x g 10 分钟。</li>
	<li>将沉淀重悬于小胶质细胞培养基中，并将约250,000个细胞接种至细胞外通量分析仪所用细胞培养微孔板的每孔中。 
	注意：从三个T75培养瓶可获得约3–4×10⁶个细胞/mL；细胞培养板无需使用多聚-D-赖氨酸或其他试剂进行包被。</li>
	<li>在5% CO₂条件下孵育微孔板2 30–45 分钟。之后再次更换培养基，以获得纯化的小胶质细胞培养物，并去除可能仍悬浮的少突胶质细胞。细胞在次日即可用于处理。图 2C).</li>
	<li>排除指定为“背景”对照的四个孔，不进行细胞接种：每行一个 (图3C)这些孔中加入检测培养基。 
	注意：将未使用的孔中加入无菌水或PBS，以防止培养基蒸发；细胞接种时应采用随机分布模式，而非固定行或列，以尽量减少基于孔板的变异。</li>
</ol>
4. 使用促炎刺激物处理原代小胶质细胞
<ol>
	<li>第11天，用100 ng/mL脂多糖（LPS）处理细胞24小时。将对照组和LPS处理组的孔进行随机化，以排除任何位置效应的影响。 
	注意：处理时间可能因实验条件而异，需预先优化。</li>
</ol>
5. 实验运行前一天进行细胞外通量检测的准备工作
<ol>
	<li>第11天，在校准板（24孔板格式；细胞外通量分析试剂盒）的所有孔中加入1 mL校准缓冲液。将该板在37 °C条件下孵育过夜，无需CO2。 
	注意：校准板包含4个加样孔。在糖酵解应激测试中，葡萄糖加入A孔，寡霉素加入B孔，2DG注入C孔（参见图4A）。</li>
	<li>配制葡萄糖和2DG储备液
	<ol>
		<li>葡萄糖——将90 mg葡萄糖溶解于2 mL细胞外通量分析培养基中（材料表）。初始溶解时使用约1.9 mL培养基，以便第二天用1 N NaOH调节pH时，最终体积不超过2 mL，这对维持摩尔浓度至关重要。</li>
		<li>2DG——将328 mg溶解于2 mL细胞外通量分析培养基中。 
		&#8203;注意：将葡萄糖和2DG溶液在4 °C下保存过夜</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取30–40 mL分析培养基分装至50 mL锥形管中，于4 °C保存，用于次日进行检测。</li>
</ol>
6. 细胞外通量检测（第12天）
<ol>
	<li>第12天，将预先配制的葡萄糖、2DG以及分装的检测培养基在37 °C下预热。通过逐次加入1N NaOH（例如，先加5 µL，再加10 µL），将葡萄糖和2DG以及分装检测培养基的pH值调节至7.4。</li>
	<li>短暂涡旋混匀，直至pH值升至7以上。 
	注意：建议使用pH指示试纸以确保pH监测的一致性。</li>
	<li>在2 mL已调节pH值的检测培养基中加入2 µL浓度为10 mM的寡霉素储备液。
	<ol>
		<li>10 mM寡霉素储备液的配制：将10 mg寡霉素溶于1 mL无菌DMSO中，配制成10 mg/mL的溶液，分装后于-80 °C保存备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从培养箱中取出细胞（来自步骤4），收集培养基至1.5 mL微量离心管中，在300 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>收集上清液（弃去沉淀以去除细胞或碎片），并将上清液于-80 °C保存，用于步骤8中所述的乳酸测定。</li>
	<li>用1 mL已调节pH值的检测培养基轻轻洗涤细胞，避免细胞脱落。</li>
	<li>弃去检测培养基，加入500 µL已调节pH值的检测培养基，在37 °C（无CO2）条件下孵育45分钟至1小时。</li>
	<li>在此期间，将所有必需的抑制剂加入细胞外通量分析仪的校准板对应加样孔中：在所有孔的左上角A孔加入55 µL葡萄糖，右上角B孔加入60 µL寡霉素，左下角C孔加入65 µL 2DG（包括背景孔）（参见图4A）。 
	注意：由于前一步已加入葡萄糖和寡霉素导致总体积增加，因此每一步的加样体积需相应增加，以维持摩尔浓度。</li>
	<li>加入抑制剂后，使用Agilent Seahorse Wave软件设置糖酵解应激测试（参见&#160;图3），并在提示时运行校准板。 
	注意：将校准板放入仪器前，需取下板的顶部盖子以及板之间的粉红色隔板。此步骤将对pH和O2传感器进行测试并完成质量控制检查。</li>
	<li>校准完成后，仪器将提示卸载校准板并加载细胞培养板。
	<ol>
		<li>步骤I：选择检测模板（图3A）
		<ol>
			<li>打开Wave软件，在模板部分选择适用于本实验的检测模板。</li>
			<li>本实验中，在细胞外通量分析仪上选择“XF糖酵解应激测试”。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>步骤II：定义分组和加样策略（图3B）
		<ol>
			<li>进入分组定义选项卡，创建实验分组（例如，背景组、对照组和LPS组）。</li>
			<li>通过选择各加样孔中注入的化合物来定义加样策略（例如，糖酵解应激测试中A孔加葡萄糖、B孔加寡霉素、C孔加2DG；这些设置通常由软件默认预设，请相应核对）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>步骤III：分配分组至板图（图3C）
		<ol>
			<li>打开板图视图，通过拖动分组名称（例如，背景组=黑色，对照组=绿色，LPS组=红色）至板布局中，为各孔分配所属分组。</li>
			<li>确保设置空白/背景孔，以实现准确归一化。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>步骤IV：设置实验方案（图3D）
		<ol>
			<li>在方案选项卡下，设定测量循环和加样程序。糖酵解应激测试的典型顺序包括：非糖酵解性酸化、葡萄糖加样（A孔）→测量糖酵解活性，寡霉素加样（B孔）→测量糖酵解能力，2-DG加样（C孔）→测量糖酵解储备。</li>
			<li>定义每次加样后的测量循环次数，并调整时间参数（例如，3次循环，每次3分钟混合、2分钟等待、3分钟测量）。 
			注意：在本实验中，我们采用软件的默认设置。</li>
			<li>在运行检测前，检查总检测时间。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>步骤V：数据归一化（图3E）
		<ol>
			<li>在Wave软件中使用内置的归一化功能，根据双辛可宁酸（BCA）法测得的蛋白浓度值对数据进行归一化（例如，按蛋白含量、细胞数量或其他可用方法）。蛋白浓度测定结果见表1。 
			注意：在ECAR测定后用于BCA检测的蛋白提取方案详见下一步骤7。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 用于数据量化与归一化的细胞收集
<ol>
	<li>细胞外通量检测完成后，取出培养板，立即进行蛋白提取，或在 -80 °C 下保存，待需要时再进行蛋白提取。 
	注意：蛋白检测可用于对不同处理条件下的数据进行归一化处理（这是数据归一化的方法之一，但并非唯一方法）。</li>
	<li>如需立即进行蛋白提取，从孔中移除检测培养基，并用 500 µL 的室温 PBS（1x）轻轻洗涤一次（建议仅进行一次温和洗涤，以尽量减少对细胞单层的破坏）。</li>
	<li>为收集在此过程中可能脱落的细胞，将培养板在 300 × g 条件下离心 5 分钟，弃去 PBS，将所得沉淀重悬于 RIPA 裂解缓冲液中，以确保总蛋白测量的准确性。</li>
	<li>向每个孔中加入约 75–100 µL RIPA 缓冲液，将培养板置于摇床上（低至中等转速）室温孵育 30 分钟，随后将内容物转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。 
	注意：在将 RIPA 缓冲液转移至 1.5 mL 微量离心管前，应在孔内充分吹打混匀。</li>
	<li>将微量离心管置于旋转器上，室温孵育约 30 分钟，以充分裂解细胞。在此期间，将离心机预冷至 4 °C。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 16,000 × g 离心 15 分钟，弃去沉淀（其中含有细胞碎片）。</li>
	<li>收集上清液，使用 BCA 法（或任何其他首选方法）进行蛋白定量。可立即进行后续实验，或在完全去除检测培养基后，将裂解液于 -20 °C（短期保存）或 -80 °C（长期保存）保存。</li>
	<li>若样品曾于 -20 °C 或 -80 °C 保存，恢复实验时需在冰上解冻约 20–30 分钟，短暂涡旋/离心后，继续按照标准 BCA 操作流程进行。</li>
	<li>或者，也可使用血细胞计数板或流式细胞仪对每孔细胞进行计数，并将其纳入归一化策略。在此情况下，检测结束后立即移除检测培养基，向每孔加入约 100–200 µL 预热至 37 °C 的胰蛋白酶，37 °C 孵育 5 分钟，随后加入 100–200 µL 10% FBS 以中和胰蛋白酶活性，收集细胞。
	<ol>
		<li>以 300 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于约 1 mL 10% FBS 中，再使用血细胞计数板进行计数。或者，也可在进行基于流式细胞术的细胞计数前，用 4% 多聚甲醛（PFA）固定 15 分钟。 
		注意：若立即进行细胞计数，则无需进行基于 PFA 的固定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 Wave 软件（操作同第 6.10.5.1 步）将每个孔的 ECAR 值与第 7.8 步获得的蛋白浓度或第 7.9.1 步获得的细胞计数进行归一化处理。所得数值即为糖酵解应激检测实验的归一化结果。</li>
	<li>通过选择“导出”功能，继而选择“Graph Pad Prism”和“Excel 表格”选项，生成结果并绘制图表，以获取每个数据点的定量值。 
	注意：在细胞培养板中，四个指定空白孔的选择具有灵活性，可由实验人员自行设定。默认的空白孔布局如 图 3C 所示。</li>
</ol>
8. 培养上清液中乳酸含量的测定
<ol>
	<li>将第12天收集并于步骤6.5中在−80 °C保存的上清液等分试样在冰上缓慢解冻。</li>
	<li>按照制造商的说明书，使用L-乳酸检测试剂盒在荧光检测模式下测定L-乳酸浓度。 
	注意：荧光检测模式比比色法检测灵敏得多。</li>
	<li>通过将提供的乳酸标准品进行系列稀释，制备标准品，以生成范围为0至0.1 nmol/孔的校准曲线。</li>
	<li>将样品和标准品以复孔形式加入透明的96孔微孔板中，然后向每孔加入含有乳酸酶混合物和荧光探针的反应混合液。</li>
	<li>避光于室温孵育30分钟。使用荧光酶标仪在激发/发射波长535/587 nm条件下测定荧光强度。</li>
	<li>根据标准曲线计算样品中的乳酸浓度，并以pM表示。未处理（对照）和LPS处理的原代小胶质细胞上清液中的乳酸水平见表2。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

神经炎症过程中，小胶质细胞的反应伴随着显著的代谢重编程，这种重编程使这些细胞能够满足其功能状态下的能量和生物合成需求。基于细胞外通量的糖酵解应激检测提供了一种灵敏且实时的方法来测量糖酵解通量，使我们能够解析原代小胶质细胞在促炎条件下如何调整其代谢。在本研究中，我们采用了原代小鼠小胶质细胞，并在暴露于经典炎症刺激物LPS后评估其糖酵解活性，从而揭示与小胶质细胞代谢相关的代谢转变。
我们的研究结果强调了ECAR作为原代小胶质细胞糖酵解功能可靠指标的实用性。经LPS处理后，ECAR升高，表明代谢向糖酵解方向转变。这与先前报道的促炎型小胶质细胞的代谢重编程一致，在炎症过程中倾向于增强糖酵解14。此类代谢转换有助于增加TNF-α和IL-6等炎症介质的产生，并支持吞噬作用和迁移所必需的细胞骨架重塑。
本方法的一个独特之处在于对检测所需的试剂（包括葡萄糖、2DG 和寡霉素15）进行人工配制并调整 pH 值。这不仅降低了实验间的变异性，还确保了试剂...

中枢神经系统中的细胞在正常和疾病状态下会改变其能量产生方式1,2。在主要的代谢通路中，糖酵解和氧化磷酸化（OXPHOS）是调控免疫细胞功能的关键通路——它们分别在促炎和抗炎条件下发生改变，以执行迅速而强烈的反应3,4。因此，免疫细胞能够根据炎症信号和功能状态在不同代谢通路之间切换5。小胶质细胞与其骨髓系同类细胞相似，其代谢与其功能密切相关，并能快速适应不同的代谢途径作为替代能源，表现出代谢灵活性6,7。在炎症过程中，小胶质细胞会发生快速的代谢重编程，其中糖酵解增强是促炎状态的关键代谢特征8。因此，识别细胞对特定代谢表型依赖性的检测方法使我们能够在不同条件下研究其功能状态。在本实验方案中，我们旨在确定原代小胶质细胞在促炎条件下是否依赖增强的糖酵解。为此，我们常规进行糖酵解应激测试。尽管Seahorse XFe24分析仪（细胞外通量分析仪）已被广泛用于永生化细胞系和转化细胞中ECAR的测量，但原代小胶质细胞存在独特的技术挑战，包括细胞产量有限、贴壁特性不稳定以及对培养条件高度敏感，这些因素可能干扰代谢测量结果。此外，该方法可实时测量ECAR，从而精确评估多个时间点的乳酸驱动型糖酵解，这是终点乳酸检测无法单独实现的。基于细胞外通量的代谢谱分析已在代谢研究中被广泛采用，用于表征细胞生物能量状态，因此本方案非常适合用于研究细胞活化、疾病建模或药物测试过程中的代谢转变。读者可根据自身对原代细胞内动态、高分辨率糖酵解测量的需求来判断本方法的适用性。
葡萄糖通过糖酵解代谢为丙酮酸，随后在细胞质中转化为乳酸，或在线粒体中转化为CO₂和水。葡萄糖转化为乳酸的过程导致质子释放到细胞外空间，引起培养基酸化。细胞外通量分析仪将这种酸化量化为ECAR9。在糖酵解应激试验中，细胞首先在无葡萄糖和无丙酮酸的培养基中孵育，并记录其基础ECAR值。第一次注射加入饱和浓度的葡萄糖，细胞通过糖酵解将其代谢为丙酮酸，生成ATP、NADH、水和质子。质子释放增加使ECAR升高，反映“糖酵解”活性。随后加入寡霉素以抑制线粒体ATP合成，迫使细胞完全依赖糖酵解供能。这一变化进一步增强质子梯度，导致ECAR进一步上升，该值被测定为细胞的最大糖酵解能力。最后引入2-脱氧葡萄糖（2DG），这是一种葡萄糖类似物，可竞争性抑制己糖激酶，阻断糖酵解过程，从而使ECAR下降。此下降证实此前的ECAR升高依赖于糖酵解。最大糖酵解能力与基础糖酵解水平之间的差值定义为糖酵解储备。在加入葡萄糖之前测得的初始ECAR代表由其他细胞过程引起的非糖酵解性酸化（图1）。
我们使用细胞外通量分析仪进行了糖酵解应激测试。将原始的ECAR值导出至Excel进行分析。对于每种条件，我们确定了对应于基础ECAR（葡萄糖添加前）、糖酵解（葡萄糖注射后）和糖酵解能力（寡霉素处理后）的时间点。对每个阶段内各时间点以及四次技术重复中的ECAR值进行平均，糖酵解水平通过葡萄糖添加后ECAR的升高值来计算。糖酵解能力通过寡霉素添加后ECAR的升高值来计算。糖酵解储备则通过2-DG注射后ECAR的降低值来计算。随后利用这些平均值比较不同组之间的代谢反应差异。
另一方面，为了评估耗氧率（OCR）并检测线粒体功能，通常采用线粒体应激测试（Agilent）作为标准方法，该方法可测量基础呼吸、ATP偶联呼吸、质子泄漏、最大呼吸、备用呼吸能力以及非线粒体呼吸等参数。这些参数通过依次加入特定的线粒体抑制剂获得：寡霉素（ATP合酶抑制剂）、FCCP（羰基氰化物-4-（三氟甲氧基）苯腙，一种诱导最大呼吸的解偶联剂）以及鱼藤酮/抗霉素A（复合物I/III抑制剂），从而实现对线粒体健康状态和生物能量学的定量评估10,11,12,13。因此，ECAR检测与OCR检测需在不同条件下进行。

<table><tbody><tr><td>1M HEPES 溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>1X HBSS</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;14175-079</td><td></td></tr><tr><td>2.5% 胰蛋白酶</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;15090-046</td><td></td></tr><tr><td>2DG</td><td>Millipore sigma&amp;nbsp;</td><td>D6134</td><td></td></tr><tr><td>抗生素/抗真菌剂&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>D &amp;ndash;(+)葡萄糖，无水&amp;nbsp;</td><td>Thermoscientific&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>A16828.36</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>&amp;nbsp;11965-092</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore sigma&amp;nbsp;</td><td>11284932001- Roche</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisherbrand</td><td>FB12999102</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;35050-061</td><td></td></tr><tr><td>L-乳酸检测试剂盒</td><td>Abcam</td><td>ab65330</td><td></td></tr><tr><td>LPS&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&amp;nbsp;L4391</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;11140-050</td><td></td></tr><tr><td>寡霉素 A</td><td>Millipore sigma&amp;nbsp;</td><td>495455</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;15240-062</td><td></td></tr><tr><td>pH 指示试纸</td><td>Fisherbrand</td><td>13-640-516</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe24</td><td>Agilent Technologies</td><td>N/A</td><td>通用名称：细胞外通量分析仪</td></tr><tr><td>Seahorse 24 V7 PS 细胞培养微孔板</td><td>Agilent Seahorse</td><td>100777-004</td><td>通用名称：细胞外通量细胞培养微孔板</td></tr><tr><td>Seahorse 检测用 XF 校准缓冲液（pH 7.4）</td><td>Agilent Seahorse&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;100840-000</td><td>通用名称：细胞外通量校准缓冲液</td></tr><tr><td>Seahorse 检测用 XF DMEM 培养基（pH 7.4）</td><td>Agilent Seahorse&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp; 103575-100</td><td>通用名称：细胞外通量检测培养基</td></tr><tr><td>Seahorse 细胞外通量检测试剂盒</td><td>Agilent Seahorse&amp;nbsp;</td><td>102342-100</td><td>通用名称：细胞外通量校准板&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>丙酮酸钠&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;11360-070</td><td></td></tr></tbody></table>

利用细胞外通量分析法研究原代小胶质细胞中的糖酵解

Investigating Glycolysis in Primary Microglia Using Extracellular Flux Assay

小胶质细胞是中枢神经系统中的常驻巨噬细胞，能够根据生理和病理信号动态调整其代谢程序。理解这些代谢变化对于阐明其在炎症过程中的作用至关重要。本文介绍了一种详细方案，利用细胞外通量分析仪通过糖酵解应激试验，评估从小鼠新生脑皮层分离得到的原代小胶质细胞的糖酵解特征。该检测方法可实时测量细胞外酸化率（ECAR），ECAR是糖酵解活性的指标，与低pH环境（如乳酸产生）相关。本方法包括在不同条件下处理培养的小胶质细胞，以研究各种刺激（包括促炎性刺激）如何改变其代谢通路。本实验室的独特之处在于，自行配制多种试剂（包括葡萄糖、寡霉素和2-脱氧葡萄糖（2DG））的新鲜储备液，以靶向调控糖酵解通路的不同环节，并对每种试剂的pH进行精确调整，以确保实验的准确性和可重复性。该方法为研究原代小胶质细胞的糖酵解提供了可靠的平台，并有助于揭示其在炎症或疾病相关条件下的功能状态。

基于细胞外通量的糖酵解应激实验成功测定了原代小胶质细胞的糖酵解特征。该检测方法可测量基础糖酵解（即葡萄糖注射后的糖酵解）、寡霉素注射后的糖酵解能力，以及2DG注射后糖酵解的抑制情况。在本实验中，我们比较了对照组（未处理）和脂多糖（LPS）处理的原代小胶质细胞。我们观察到，在处理24小时后，对照组与LPS处理组的小胶质细胞在形态上仅有轻微变化（图2D-E）。研究发现，与未处理的对照组相比，LPS处理的小胶质细胞的糖酵解（图4D、H）和糖酵解能力（图4E、I）显著增强，表现为细胞外酸化率（ECAR）水平升高（图4C、G）。所有时间点的平均值绘制于（图4D–F）中。将ECAR值根据...

本方案描述了一种经济高效的方法，用于进行糖酵解应激测试，以量化原代小鼠小胶质细胞中的代谢重编程。在细胞分离并接受炎症刺激后，使用 freshly prepared、pH 调整的试剂测定细胞外酸化率（ECAR），随后进行蛋白标准化，从而实现对糖酵解变化的准确且可重复的评估。

小胶质细胞是中枢神经系统中的常驻巨噬细胞，会根据生理和病理刺激动态调整其代谢程序。

本研究重点利用实验室自制的代谢抑制剂，通过细胞外通量分析，探究炎症过程中原代小胶质细胞的糖酵解。现有方法依赖昂贵的试剂盒，且缺乏足够的细节。本方案则提供了全面、分步的操作指南，以实现经济、可重复的实验结果。首先，获取来自出生后第0至第2天的C57黑6C小鼠幼鼠大脑皮层的10日龄混合胶质细胞培养物。在37摄氏度下，以每分钟250转的速度振荡培养瓶2小时。将含有悬浮细胞的全部培养基收集至15毫升锥形管中。在300 ×g条件下离心10分钟，然后将沉淀重悬于小胶质细胞培养基中。在细胞外通量分析仪的细胞培养微孔板中，每行标记一个孔，共标记四个孔。作为背景对照，在背景对照孔中加入检测培养基。在其余孔中每孔接种约 250,000 个细胞。将微孔板置于 5% 二氧化碳环境中孵育 30 至 45 分钟，然后更换为新鲜的小胶质细胞培养基，并继续孵育。在第11天处理细胞时，首先将对照组和脂多糖（LPS）孔随机分配，以排除位置效应。随后用100纳克/毫升的LPS处理细胞24小时。在检测前一天，向24孔校准板的所有孔中各加入1毫升校准缓冲液。将培养板在37摄氏度无二氧化碳条件下孵育过夜。配制葡萄糖和2-DG储备液，并将两种溶液在4摄氏度下保存过夜。次日，取30至40毫升检测培养基分装至50毫升锥形管中用于检测。将储备溶液和分装的检测培养基在 37 摄氏度下预热。逐滴加入 1 N 氢氧化钠，并短暂涡旋，以调节每种溶液的 pH 至约 7.4。将寡霉素储备溶液加入 2 毫升 pH 已调节的检测培养基中。然后将细胞从培养箱中取出，吸除培养基，并用1毫升pH值已调节的检测培养基轻轻洗涤，以防止细胞脱落。弃去洗涤用培养基，加入500微升pH值已调节的检测培养基。在37°C条件下孵育45分钟至1小时，不添加二氧化碳。将所有必需的抑制剂分别加入细胞外通量分析仪校准板的对应端口中。加载所有孔，包括背景对照孔，然后移去板的顶部盖子以及板之间的粉红色盖子。将校准板放入实时细胞外通量分析仪中。使用 Wave 桌面平台启动运行以校准仪器。当仪器提示时，卸下校准板并加载培养板。打开 Wave 软件，从模板部分选择合适的检测模板。在细胞外通量分析仪上选择 XF 糖酵解压力测试。打开分组定义选项卡，创建实验分组，如背景组、对照组和 LPS 组。通过将葡萄糖、寡霉素和 2-DG 分配至相应的加样孔来设定注射策略。现在，打开孔板图谱视图，通过将各组名称拖拽至孔板布局中来为每组分配孔位。指定空白或背景孔，以实现准确的归一化。打开方案标签页，设置测量循环以及用于非糖酵解性酸化的加样程序，随后依次进行葡萄糖、寡霉素和2-DG的注射。定义每次注射后测量循环的次数，并调整时间设置或使用软件的默认设置。在运行检测前，检查总检测时间。使用内置的归一化选项对数据进行归一化处理。与未经处理的对照组相比，LPS处理的原代小胶质细胞在24小时后表现出轻微的形态学变化。在糖酵解应激测试曲线以及蛋白标准化的细胞外酸化率曲线中，LPS处理的原代小胶质细胞随时间推移显示出较对照组小胶质细胞更高的细胞外酸化速率。与未处理的对照组相比，LPS处理的小胶质细胞表现出显著增强的糖酵解活性和糖酵解能力，表现为ECAR水平升高。将ECAR值归一化至其蛋白含量后，呈现出相似的趋势。此外，在归一化前后，对照组与经LPS处理的小胶质细胞之间的糖酵解储备均未观察到显著差异。本方案通过检测细胞外酸化率来定量评估培养的小胶质细胞中的基础糖酵解、糖酵解能力以及实时代谢变化，精确的pH控制、最佳的细胞密度、轻柔的操作以及数据归一化对于避免结果变异性和不准确的细胞外酸化率测量至关重要。本方案重点在于糖酵解的测定，同时可在检测后进行蛋白质含量或细胞密度分析，用于数据归一化。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

利用细胞外通量分析研究原级小胶质细胞的糖解作用

从大脑复杂的细胞异质性中分离原代小胶质细胞，对于研究其在生理和病理条件下的作用至关重要。本方案描述了一种机械分离与混合细胞培养技术，可获得高产量、高纯度且具有活性的原代小胶质细胞 体外...

从新生大鼠脑组织的混合胶质细胞培养物中分离原代小胶质细胞

本方案提供了一种利用细胞外通量分析法测定原代白血病细胞胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR）的生化方法。对这些细胞代谢特征的评估有助于明确其代谢需求，从而实现个体化治疗。...

细胞外通量测定：一种用于测量细胞代谢特征的方法

代谢重编程是M1和M2型巨噬细胞极化的特征及先决条件。本文描述了一种用于检测小鼠骨髓来源巨噬细胞糖酵解和线粒体功能基本参数的实验方法。该工具可用于研究特定因素如何影响巨噬细胞的代谢及其表型。...

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分析 离体 脾脏和心脏巨噬细胞及骨髓单核细胞中的代谢流

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小胶质细胞线粒体提取用于糖链分析

学习利用细胞外通量分析仪测定原代小胶质细胞的糖酵解活性，通过实时监测细胞外酸化率评估炎症刺激下的代谢变化。该方法为神经免疫学研究提供了可靠的技术平台。

利用细胞外通量分析法研究原代小胶质细胞中的糖酵解

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