使用CUT&RUN技术对神经内分泌小细胞肺癌细胞系进行全基因组组蛋白修饰和转录因子结合位点作图

因此，我们研究的目标是鉴定在不同类型的小细胞肺癌中，谱系决定性转录因子与染色质重塑蛋白之间的相互作用，及其在调控转录图谱中的功能，以及这些相互作用如何参与疾病过程，包括癌症的发生和进展。我们希望通过开展诸如 CUT&RUN 等实验来实现这一目标，CUT&RUN 是一种下一代测序技术，能够在全基因组范围内分析或鉴定出不同修饰的组蛋白以及DNA结合转录因子的基因组定位。最终，我们希望发现由表观遗传机制调控的新信号通路，这些通路可能成为治疗靶点，从而为这种极具侵袭性的小细胞肺癌患者开发新的治疗方法提供依据。

首先，将培养的小细胞肺癌神经内分泌细胞从37摄氏度的培养箱中取出，在显微镜下观察以确保细胞质量。然后将细胞悬液转移至50毫升锥形管中，在室温下以1,200 ×g离心5分钟。使用生物安全柜中的真空装置吸除锥形管中的培养基，并用20毫升磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗所得的细胞沉淀。

将离心管再次以 1,200 g 离心五分钟，吸除 PBS。根据细胞沉淀的大小加入适量 Accutase，于 37 摄氏度孵育三至五分钟，以消化细胞沉淀。接着，加入含有 10% FBS 的五毫升 PBS 混匀，终止消化反应，获得单细胞悬液。

按照之前的方法再次离心细胞后，将沉淀重悬于 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中。使用自动细胞计数仪对起始细胞进行计数，并确认其活力与完整性。计算所需的细胞总数，并额外增加 20% 以弥补移液误差。

将计算好的细胞总数转移至1.5毫升离心管中，在室温下以600 g离心3分钟。将细胞重悬于洗涤缓冲液中，调整细胞密度为每反应5 × 10⁵个细胞，共进行6个反应。每个反应使用100 µL缓冲液，轻轻但充分地吹打混匀，确保形成均匀的细胞悬液。

再次离心细胞，弃去上清液，并重复洗涤步骤。将洗涤后的细胞每100微升分装至含有10微升活化刀豆蛋白A珠的八联管中。轻轻吹打混匀管内物质。

将珠子细胞悬液在室温下孵育10分钟，以使细胞结合到珠子上，然后在小型离心机中快速离心，收集悬液，避免珠子沉降。将离心管置于0.2毫升管磁力架上。待悬液澄清后，用移液器吸除上清液。

然后将离心管从磁力架上取下，立即向每个反应体系中加入50 µL预冷的抗体缓冲液，轻轻吹打以重悬磁珠。正确标记8个排管。

向每个反应管中分别加入0.5微克的H3K4me3、H3K4me1和免疫球蛋白G抗体，以及0.6微克来自不同来源的E2F7多克隆抗体。轻轻吹打混匀各反应管内容物，并在4摄氏度下于旋转摇床中避光孵育过夜。从旋转摇床上取下八联管，短暂离心以使液体聚集于各管底部。

现在将离心管置于磁力架上，直至裂解液变澄清。然后小心地用移液器吸除并弃去上清液。保持离心管在磁力架上，每管用 200 µL 冷的细胞通透缓冲液洗涤两次，每次洗涤后使用多通道移液器吸除上清液。

接下来，将离心管从磁力架上取下。立即向每个反应体系中加入 50 µL 冷的细胞通透缓冲液，轻轻吹打以重悬细胞和磁珠。然后向每个反应体系中加入 2.5 µL 蛋白 A/G-微球菌核酸酶，通过轻轻吹打充分混匀。

室温孵育10分钟后，对离心管进行短暂离心。将离心管放回磁力架上，直至裂解液澄清，然后吸去上清液。用冷的细胞通透缓冲液洗涤磁珠两次后，轻轻将磁珠重悬于50 µL细胞通透缓冲液中。

将八联管置于冰上，向每管反应体系中加入1微升100毫摩尔/升的氯化钙。轻轻吹打混匀，充分重悬磁珠，以促进高效消化。将各管置于4摄氏度的旋转混合仪上孵育2小时，孵育过程中始终保持管盖朝上。

现在，在一个新的1.5毫升离心管中，通过将33微升终止缓冲液与1微升浓度为每反应0.5纳克的大肠杆菌 spike-in DNA混合，制备终止缓冲液混合液。轻轻涡旋以混匀溶液。在2小时孵育结束后，向每个反应管中加入33微升已制备的终止缓冲液混合液，并充分混匀。

将反应管放入PCR仪中，在37摄氏度下孵育10分钟。短暂离心后，将反应管置于磁力架上，直至溶液变澄清。小心转移约85微升含有CUT&RUN释放DNA的上清液至新的1.5毫升离心管中。

纯化回收的DNA，测定其浓度，并进行片段大小分布分析以进行质量控制。随后进行CUT&RUN文库制备、定量、加索引文库混合以及双端下一代测序。achaete-scute同源物-1高表达细胞系DMS79和H146，以及neurogenic分化因子1高表达细胞系H82，在悬浮培养中以非贴壁聚集体或致密球状体形式生长，而H446则呈现混合形态，约80%细胞为贴壁生长，20%处于悬浮状态。

CUT&RUN DNA片段分析显示，在所有细胞系中，增强子组蛋白标记H3K4me1产生的DNA量最高，其次是H3K4me3，而E2F7和IgG产生的DNA量最低。对于提取的CUT&RUN DNA，H3K4me1和H3K4me3的片段大小分布显示出明显的单核小体和双核小体峰，同时伴有基因组DNA。相比之下，E2F7和IgG对照均未检测到明显的峰。

尽管DNA投入量较低，仍成功构建了所有CUT&RUN靶标（包括E2F7和IgG）的下一代测序文库。在DMS79野生型和H146杂合突变细胞中的热图分析显示，H3K4me3和E2F7信号在转录起始位点附近富集，而H3K4me1信号的分布则更为广泛。在随机选择的染色质区域进行基因组浏览器可视化分析，显示出H3K4me3、H3K4me1和E2F7各自独特的峰信号，而IgG则未显示富集。

因此，传统上，科学家和研究人员通常采用染色质免疫沉淀结合测序（ChIP-seq）来回答我们所提出的这类问题。然而，ChIP-seq 需要相对大量的起始材料，这在某些实验模型中并不总是可行。相比之下，CUT&RUN 所需的起始材料显著更少，仅需低至 50,000 个细胞，且需要的高通量测序读数更少，这意味着成本更低，并在数据生成过程中产生远低于 ChIP-seq 的背景噪音。

CUT&RUN 技术不仅适用于二维培养的细胞，还可针对其他临床前模型进行优化，例如患者来源的类器官和异种移植模型。该技术还可用于分析组织中的染色质图谱，包括正常组织和病变组织。因此，这一技术对于癌症研究人员而言极具价值，同时对于致力于研究各类人类疾病的非癌症领域科研人员也具有重要应用意义。

该方案可实现对细胞基因组中组蛋白修饰及多种蛋白质原位分布特征的定位分析。揭示小细胞肺癌（SCLC）不同亚型中的组蛋白翻译后修饰（PTMs）及转录因子（TF）结合情况，有助于发现亚型特异性的可靶向基因和调控元件，例如增强子和超级增强子。