Name: 基于养殖者的 体内 昆虫病原线虫繁殖 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-09T13:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 学习利用聚丙烯酰胺凝胶基质和棉绒双层系统，在Tenebrio molitor幼虫体内大规模繁殖昆虫病原线虫的方法。该技术为农民提供了简单、可扩展的田间害虫生物防治解决方案，实现可持续的农场自主生产。

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我们感谢 Stacy Byrd 提供的技术支持。本出版物中提及的商标或商业产品仅用于提供具体信息，并不意味着美国农业部的推荐或认可。

1. 获得初始接种物及基本操作步骤
注意：基于饲养者的方法的大规模生产依赖于被感染的昆虫宿主。在第一种方法中，一旦初始接种物被制备，就不再需要线虫的水悬浮液来感染新的宿主。
<ol>
	<li>为制备初始接种物，获取所需的昆虫病原线虫（EPN）物种，使用其感染期幼虫（IJ）阶段 斯氏线虫（Steinernema carpocapsae） （所有品系）和 Heterorhabditis bacteriophora （VS品系）</li>
	<li>使用IJs感染末龄幼虫 G. mellonella 使用白氏诱捕法采集幼虫7.</li>
	<li>接种活体50 G. mellonella 感染了IJs（每只昆虫100个IJs）的幼虫 S. carpocapsae 或 H. bacteriophora 在铺有滤纸的培养皿（90 mm）中，将接种的昆虫置于25 °C直至感染性幼虫即将逸出（5–7天） S. carpocapsae，7至10天 H. bacteriophora).</li>
	<li>继续基于连续培养器的生产流程9.
	<ol>
		<li>用于大规模接种时，放置一个被感染的尸体（例如，感染有 S. carpocapsae 或 H. bacteriophora) 与 50 个活体 G. mellonella 将幼虫置于内衬湿润纸巾的塑料容器（5.7–14.2 L）中，并在25 °C条件下培养。</li>
		<li>72 小时后，移除未显示适当颜色变化（呈浅褐色/棕色）的尸体 斯氏线虫属；红色/橙色表示 异小杆线虫属) 从容器中取出以避免污染。</li>
		<li>将尸体移至装有聚丙烯酰胺凝胶粉末的透明塑料容器中，并加水润湿（每克干凝胶加20 mL水）。将尸体置于尼龙筛网（孔径2 mm × 2 mm）上方，使其与凝胶分离。7.</li>
		<li>从感染的宿主中收集侵染性线虫（IJs）（这些线虫停留在凝胶表面的筛网上）。继续从凝胶中收集线虫，直至IJs开始逸出后约5–7天；移除并丢弃已耗尽的虫尸（IJs的收集应持续进行，直到IJs数量显著减少，通常约为5–7天）。 
		注意：收获到凝胶中的感染性线虫（IJs）可用于启动下一轮 EPN 生产的接种物，可直接用于施用，或在冷藏条件下保存数周至数月，活力不会下降，甚至可保存 3–6 个月用于重新接种。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为后续生产轮次制备接种物，需将健康的 G. mellonella 将幼虫在培养皿（90 mm）的凝胶中转化为感染性幼虫（IJs）。然后，利用这些新感染的宿主去接种下一组 G. mellonella 幼虫（如上文步骤1.2和1.3所述）。</li>
	<li>对于EPN应用，使用自来水或筛网（孔径大小）将已进入凝胶的IJs冲洗出来 &#60; 0.3 cm）。或者，也可将含有EPNs的凝胶直接应用于小型实验区域，无需冲洗。 
	注意：昆虫病原线虫（EPNs）可用于水悬浮液，并可通过标准种植实践（如喷雾器、灌溉等）进行施用。7凝胶在冷藏条件下可保存数周，期间EPN的存活率仅有轻微下降；而在室温下保存不得超过2周。冷藏条件下，凝胶可保存数月（具体时间因EPN物种而异）。</li>
</ol>
2. Steinernema carpocapsae 实验
注意：本研究的目的是通过改变实验区域的大小，以养殖者为基础的方法相对于标准的White诱捕器方法来验证IJ的产生。
<ol>
	<li>设置实验，包含五种不同尸体密度的处理组，每实验单元中尸体数量从5到50个不等。
	<ol>
		<li>T1：对照组：在白色陷阱中使用培养皿（10.0 cm × 1.5 cm；直径 [D] × 高度 [H]）放置5具尸体，即0.06具尸体/cm2。</li>
		<li>T2：在较大的白色陷阱（15.0 cm × 1.5 cm；D × H）中，于14.2 L透明塑料容器（43.2 cm × 28.3 cm × 16.5 cm；长 × 宽 × 高）内放置30具尸体，即0.025具尸体/cm2。</li>
		<li>T3：在5.7 L透明塑料容器（36.2 cm × 21 cm × 12.4 cm；长 × 宽 × 高）中的聚丙烯酰胺凝胶（15 g凝胶粉末 + 300 mL自来水）内放置25具尸体，即0.033具尸体/cm2。</li>
		<li>T4：在14.2 L透明塑料容器中的聚丙烯酰胺凝胶（35 g干凝胶 + 700 mL自来水）内放置30具尸体，即0.025具尸体/cm2。</li>
		<li>T5：在14.2 L透明塑料容器中的聚丙烯酰胺凝胶（35 g干凝胶粉末 + 700 mL自来水）内放置50具尸体，即0.041具尸体/cm2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用标准的白色陷阱方法（T1）作为对照组（见步骤2.1）。</li>
	<li>确保每种处理设置四个重复，并将整个实验重复两次。</li>
	<li>将含凝胶处理的尸体放置在2 mm × 2 mm的尼龙筛网上方。</li>
	<li>用松紧适度的带孔盖子覆盖所有容器，并置于25 °C环境中。</li>
	<li>每日观察白色陷阱中感染性线虫（IJ）的逸出情况，并在首次IJ逸出后第7天终止实验。</li>
	<li>实验结束时，根据标准稀释程序6评估每头昆虫的总IJ产量。</li>
	<li>在凝胶处理组中，需充分混匀凝胶后计数IJ，记录凝胶总体积，取10 mL凝胶按1:100比例稀释于水中，并搅拌约20分钟后再进行计数。</li>
</ol>
3. Heterorhabditis bacteriophora 实验
注意：本实验旨在测试一种基于培养者的 H. bacteriophora 生产流程（该流程基于&#160;S. carpocapsae 实验的结果）。
<ol>
	<li>设置处理组：将5具尸体放入直径100 mm、高15 mm的培养皿中的White诱捕器内，另将50具尸体放入14.2 L透明塑料容器中的聚丙烯酰胺凝胶（35 g干凝胶粉 + 700 mL自来水）中。</li>
	<li>采用White诱捕法（见步骤3.1）作为对照。</li>
	<li>整个实验重复两次，每种处理设五个重复。</li>
	<li>按照先前实验的方法进行实验，并评估感染性幼虫（IJ）的产量（见第2节）。</li>
</ol>
4. Oscheius onirici 和 Heterorhabditis georgiana 的扩增
注意：本研究的目的是验证使用第二种基于养殖者的方法生产感染性幼虫（IJs），该方法依赖于 commercially available 的聚合物涂层棉絮（马用纱布）作为培养基质。在此操作中，马用纱布作为感染性幼虫（IJs）发育的基质，因其物理特性既可保证通气，又能高效收获感染性幼虫（IJs）。本研究将马用纱布法与标准线虫培养基质（普通棉絮）进行了比较。
<ol>
	<li>采用完全交叉的双因素双向因子设计，考察两个因素：线虫种类（O. onirici 或 H. georgiana）× 培养基质（马用纱布或脱脂棉）。该实验设计（2 × 2）将产生四种独特的处理组合，每种处理重复7次，并按完全随机设计排列。</li>
	<li>对每个重复，在一个浅塑料托盘（35.6 cm × 25.4 cm × 2 cm）中放置一块马用纱布或脱脂棉片，作为昆虫寄主的培养基质。将200只 T. molitor 幼虫（冷冻致死）均匀铺在基质上。再覆盖一层相同尺寸的纱布或棉片，形成三层结构（底层棉片、中间粉虫层、顶层棉片）。针对两种线虫，分别准备7个使用马用纱布和7个使用脱脂棉的托盘。</li>
	<li>通过以 T. molitor（粉虫）为寄主、在湿润棉垫上进行的活体（in vivo）线虫培养，获得 O. onirici 和 H. georgiana 的感染性幼虫（IJ）接种物。
	<ol>
		<li>在培养皿内放置两小片脱脂棉，并用自来水浸润（10–15 mL）。</li>
		<li>将4–6只 T. molitor 幼虫（活体或冷冻致死）非重叠地置于两片棉垫之间。</li>
		<li>向顶部棉垫加入10 mL线虫悬液（400–500 IJs/mL），使感染性幼虫能够搜寻并侵染粉虫。 
		注：在21–22 ˚C条件下，感染后2–4周开始有感染性幼虫 emergence（出现）。</li>
		<li>通过向顶部棉垫倾倒20–25 mL自来水（重复两次），收集穿过滤棉的液体，从而从培养皿中收获感染性幼虫。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将约400 mL线虫悬液（80,000–90,000 条线虫/L）充分浇灌于大号浅盘中的棉片上，使昆虫寄主感染线虫。让线虫侵染昆虫幼虫，并在21–22 ˚C下培养4周。</li>
	<li>4周后，用自来水对每个托盘进行两次浇灌（每次500 mL），收集共计1 L的线虫悬液，以收获线虫。</li>
	<li>在解剖显微镜下计数每毫升线虫密度，并统计每个重复托盘的计数结果。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究发现，以种植者为导向的方法（使用聚丙烯酰胺凝胶和/或聚合物涂层纱布双层结构）能够稳定地大量生产用于害虫防治项目的线虫。重要的是，上述工艺的基本参数可进一步优化以满足种植者的需求（例如寄主密度、培养区域大小以及所用基质）。这两种方法可能适用于不同的作物系统；对这些方法进行比较并进一步优化将是未来研究的主要课题。
与基于White陷阱的方法相比，聚丙烯酰胺凝胶基质能产生更多的感染性幼虫（IJs）。这些发现中的一个关键因素是，IJs可以直接进入凝胶，而在White陷阱中，它们必须从培养皿内部移动到收集皿中，因此部分IJs可能无法到达收集皿。直接从凝胶中收集IJs具有优势，因为IJs倾向于向周围环境扩散，而在凝胶中则能有效实现自我浓缩，便于储存和/或收集15。
类似地，将感染性幼虫（IJs）在双层纱布内的黄粉虫中进行培养时，这些幼虫也能离开虫尸，并依靠重力向下移动，聚集在湿润的纱布纤维上或内部。聚合物涂层双层结构提供了较大的表面积，有利于线虫的富集。由于该方法在培养和收获IJs方面操作简便，适合希望自行生产线虫的种植者采用。研究发现，马布纱布的产量与脱脂棉相当，这一点非常重要，表明使用马布纱布（即提高线虫收获效率）的优势可以在不降低生产效率的前提下得以维持。相较于脱脂棉，马布纱布可能具有更好的通气性，因为其纱布纤维不会塌陷成致密且饱含水分的垫状结构。尤为重要的是，直接从被感染宿主中 emerged 的线虫（依据我们的体内（in vivo）方法）作为一个群体，已表现出寻找、制服并杀死昆虫宿主的能力，从而表明其具有较高的感染能力（侵入能力）、更强的扩散能力、更高的毒力以及对环境（非生物因素）更强的耐受性，相比之下，通过体外（in vitro）方法生产的线虫则不具备这些优势21,22。
本文提出的面向种植者的生产系统可轻松适用于其他昆虫病原线虫（EPN）物种，因为昆虫寄主Galleria mellonella对大多数Steinernema和Heterorhabditis物种高度敏感6。也可使用其他昆虫寄主，例如T. molitor6,7,18,19。Leite 等人（2018）23已证实凝胶制剂的价值；若在凝胶体系中于适宜温度下保存，可储存数月后再使用。基于凝胶的制剂非常适合大多数施用系统；含聚丙烯酰胺的凝胶作为标准的EPN制剂已被成功使用数十年6,7,24。此外，凝胶具有较高的储存容量，且通过筛分和冲洗从凝胶中收获线虫非常简便24，耗时可少于5分钟（Shapiro-Ilan 个人观察），相较于White陷阱法，凝胶系统方法可获得更高的产量。凝胶制剂能将感染性幼虫（IJs）保留在制剂内部，而其他制剂（如泥炭、蛭石、盆栽混合物、硅藻土及蘑菇堆肥）中有更高比例的IJs会逃逸出介质23。进一步开展关于可完全溶解于喷雾罐水中的线虫储存基质的研究（例如Leite 等人（2023）25所采用的酚醛海绵）将对种植者具有重要价值。
以种植者为导向的方法可能存在一个缺点——反复继代培养可能导致线虫毒力下降，这是所有生产体系都可能面临的问题。如果种植者使用近交系作为初始接种物，则可避免这一问题。26 并在此后限制感染事件中的线虫密度，从而降低发病频率 &#34;作弊者&#34; （依赖其他线虫杀死宿主的非致病性线虫）在线虫培养物中27.
我们基于种植者的新型生产方法代表了一种可持续、易获取、高产、长寿命且低成本（但劳动密集型）的昆虫病原线虫生产途径。实现连续生产的关键在于使用可靠的初始接种物，该接种物可来源于已被感染的寄主或储存的凝胶。因此，该生产过程能够响应种植者的持续使用需求，这与其他依赖外部提供接种源的方法形成对比。提供多种面向种植者的线虫扩繁方法，将使种植者能够根据自身的农业实践对系统进行个性化调整。
种植者自行生产线虫的动机因人而异，但考虑到通过以下方式生产的线虫 体内 方法通常表现出更强的搜索能力、适应性和毒力21,22，其本身具有内在价值 体内 线虫的饲养。相反，通过以下方式生产的EPNs 体外 这些方法在发育过程中不会接触到活体昆虫，这实际上剥夺了线虫维持高个体致死率（作为生物防治剂的重要评估指标）的机会7,21,22. 我们的方法的成本效益应相对于其他方法进行评估 体内 技术以及商业用EPNs的成本效益。田间效果和成本是任何生物防治项目的重要决定因素。

昆虫病原线虫（EPN）通常以斯氏线虫属（Steinernema）和异小杆线虫属（Heterorhabditis）的物种为代表，多年来一直被用作防治土栖昆虫害虫的有效生物防治制剂1。EPN在土壤中寻找昆虫寄主，当线虫发现合适的寄主后，便会侵入昆虫体内，并释放共生细菌以杀死昆虫2。这些共生细菌分解寄主组织，在虫尸内大量繁殖，并成为线虫的主要食物来源3。最终，在寄主虫尸内完成多代繁殖后，感染期幼虫线虫（IJs）从虫尸中逸出，开始寻找新的昆虫寄主。正是在这一阶段，可收集这些线虫并将其作为生物杀虫剂用于作物保护。农民（及其他农业相关从业者）可以购买此类有益线虫的制剂产品，但很少有农民能够自行繁育线虫并用于害虫管理项目中。
通过常规生产方法培养和收获线虫可能相当困难。昆虫病原线虫（EPNs）的小规模生产通常基于 体内 方法，而在更大尺度上， 体外 生产被使用4。大多数 体外 方法采用动物副产品的匀浆作为线虫的食物，从而避免了对昆虫的直接操作。这并不令人意外， 在体内 生产可能具有挑战性且成本较高，因为它涉及对活体昆虫宿主进行接种，通常采用White trap方法5 或 大蜡螟 L.（“蜡虫”）或 Tenebrio molitor L.（“黄粉虫”）。在昆虫宿主内培养线虫不仅增加了活体昆虫的高昂成本，还带来了处理这些昆虫所需的人工劳动。
当昆虫病原线虫（EPNs）在其昆虫宿主体内发育时，虫尸会表现出与感染的EPN属相对应的特征性感染症状6将尸体置于盛放于较大水盘内的培养皿中的湿润表面上7当线虫在寄主尸体内部完成其生活史后，感染性幼虫（IJs）会从尸体中逸出，通常采用清水轻柔冲洗的方式进行收集，随后可储存于多种培养基中，包括凝胶等惰性基质图1）、锯末或蛭石8. 在体 产量通常由于劳动力和昆虫成本而表现出较低的规模经济7,9.
体外生产基于在人工培养基上培养EPNs，该培养基含有EPNs及其共生细菌Photorhabdus（用于Heterorhabditis）&#160;和Xenorhabdus（用于Steinernema）的单克隆培养物4,10。该方法需要具备高级专业技术，以及在高通量发酵所需的材料和仪器设备方面投入大量资金11。因此，可靠的体外EPN生产对于许多农业生产而言可能成本过高。
对于农民及其他农业相关从业者而言，可以通过改进in vivo（活体）技术来规避与in vitro（体外）技术相关的技术难题，特别是结合强化昆虫饲养12以及自动化线虫接种与采收技术7,13。in vivo方法在优化昆虫病原线虫（EPN）的接种、生产及储存流程后，可实现显著的效率提升7,14,15,16。此外，通过支持农民自主生产EPN，in vivo生产方式还可根据最终用户的需求进行定制化调整17。该方法的一个基本缺陷在于，每次生产周期均需从商业机构或公共资助机构重新获取线虫接种物，导致种植者始终依赖外部提供的接种源9。因此，种植者亟需一种可持续、长期的EPN生产方法。本文即为此目的而提出相应的可持续生产方案。
为了探索这些方法，我们建立了两种不同的体内生产方式。在第一种方法中，我们将标准的White陷阱法与新型的以种植者为导向的方法进行了体内生产的比较。结果是一种相对简单、低成本的昆虫病原线虫（EPN）生产方法，具有可持续性，并可轻松适用于多种EPN物种9。该方法的一个关键优势在于，任何一批次所产生的EPN中，只需一小部分即可用于接种昆虫宿主，以进行后续批次的生产。因此，一旦种植者获得了初始的EPN接种物，便不再需要外部来源材料。该过程能够响应种植者的持续使用需求。
一种成本和投入均较低的线虫扩繁方法已并行开发，主要聚焦于美国威斯康星州蔓越莓害虫的生物防治。最近，该物种的两个线虫品系， Oscheius onirici （线虫动物门：小杆目科）和 Heterorhabditis georgiana （线虫动物门：小杆目科）是在美国威斯康星州中部的酸性泥炭地发现的18 并在野外研究中反复测试18,19这些物种为本地物种，且已被证明对历史上具有破坏性的害虫具有高度毒力18,19,20因此，许多农民对利用这些线虫作为作物害虫（如斯帕甘诺西斯果虫和红头跳甲）的生物防治剂产生了兴趣。这些线虫可进行大规模繁殖。 体内 使用甲虫幼虫（黄粉虫)嵌入湿润且通气良好的聚合物涂层棉纤维（即“马布纱布”）层中。重要的是，这些纤维具有亲水性，同时足够坚韧，可在加水后维持纱布的原有厚度。因此，双层纱布在湿润状态下不会发生压缩，有利于更好的空气流通和线虫存活。该双层纱布系统能更真实地模拟潮湿土壤中的孔隙结构，适用于感染性幼虫（IJs）逸出后的线虫储存。通过系统性地冲洗纱布并收集富含线虫的悬液，可便捷地从双层纱布中收获感染性幼虫（IJs）。

<table><tbody><tr><td>透明塑料容器</td><td>Sterile Crop，马萨诸塞州汤森德</td><td>https://www.sterilite.com/</td><td></td></tr><tr><td>透明塑料容器</td><td>Iris USA, Inc，威斯康星州普莱森特草原</td><td>https://www.irisusainc.com/</td><td></td></tr><tr><td>脱脂棉</td><td>MedLine 脱脂棉卷，1 &amp;times; 8.5 英尺卷</td><td>https://athome.medline.com/en/medline-sterile-cotton-roll-1in-x-8-5ft-1lb-10ct-non6028</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Heterorhabditis georgiana&lt;/em&gt;</td><td>美国农业部农业研究局蔬菜作物研究组，威斯康星州麦迪逊</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Ocheius onirici&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td>美国农业部农业研究局蔬菜作物研究组，威斯康星州麦迪逊</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯酰胺凝胶粉末</td><td>Soil Moist，JRM Chemical，俄亥俄州克利夫兰</td><td>https://www.soilmoist.com/</td><td></td></tr><tr><td>聚合物涂层脱脂棉（马用纱布）</td><td>Leggett &amp;amp; Platt</td><td>BB Satin Star 12'S，30 &amp;times; 36 英寸卷</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Steinernema carpocapsae&lt;/em&gt;（All 菌株）&amp;nbsp; &lt;em&gt;Heterorhabditis bacteriophora&lt;/em&gt;（VS 菌株）</td><td>美国农业部农业研究局东南部水果与坚果研究实验室，佐治亚州拜伦</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

基于种植者的 在体 内 昆虫病原线虫的繁殖

Grower-Based In Vivo Propagation of Entomopathogenic Nematodes

通过体外（in vitro）或体内（in vivo）方法生产的昆虫病原线虫（EPNs）是害虫生物防治中高效且有效的生防制剂。in vivo大规模繁殖系统可产生高质量的线虫，但通常比商业化的in vitro方法更费劳力和/或成本效益更低。迄今为止所描述的面向种植者的线虫繁殖系统通常不可靠，因其依赖外部来源（工业或学术实验室）来校准接种物。我们设计了新型的基于种植者的系统，使农民在从已建立的EPN生产实验室/公司获得接种物后，能够持续自行生产线虫。
本文介绍了农民大规模繁殖昆虫病原线虫（EPNs）作为生物杀虫剂的两种方法。第一种方法中，我们比较了使用标准怀特氏诱集法（White trap）进行活体（in vivo）线虫培养与一种面向种植者的培养方法，后者采用聚丙烯酰胺凝胶作为线虫生长基质。在培养两种常见昆虫病原线虫物种（Steinernema carpocapsae 和 Heterorhabditis bacteriophora）时，面向种植者的方法比标准方法产生了更多的线虫。
在第二种方法中，两种本土线虫物种（Oscheius onirici 和 Heterorhabditis georgiana）在活体甲虫幼虫（Tenebrio molitor）体内大量繁殖，这些幼虫被夹在两层聚合物涂层的棉絮之间。通过系统性地喷淋托盘，从双层棉絮中收集逸出的线虫，形成可直接用于田间应用的线虫悬液。这些面向种植者的技术体系有望被农业相关方广泛采用，因为该方法在技术上简单且可扩展，适合寻求便捷、可靠线虫生产方式的用户。通过为种植者提供自主制备害虫管理工具的途径，这些方法有望提升美国农场的独立性和盈利能力。

S. carpocapsae 实验 
根据每个虫尸中感染性线虫（IJs）的平均数量，处理间的差异具有显著性（单因素方差分析： F4,39 = 2.95，P = 0.0362）。仅有 T2 与 T4 之间差异显著，其中 T4 每虫尸产生的 IJs 数量（244,029 ± 16,241）高于 T2（159,114 ± 9,669）（图 2）。
H. bacteriophora 实验 
本实验中，不同处理对每具虫尸平均产感染期幼虫（IJs）数量的影响显著（单因素方差分析：F1,19 = 5.0，P = 0.040）。与怀特氏诱集法处理组（124,470 ± 19,129 条 IJs/虫尸）相比，基于种植户导向方法的处理组每虫尸产生的 IJs 数量显著更高（186,389 ± 28,645 条）（图3）。
Oscheius onirici 和 Heterorhabditis georgiana的扩增 
双层马布在为 O. onirici 和 H. georgiana 线虫提供培养基质方面与脱脂棉效果相当（双因素方差分析：线虫种类的主效应：F1,23 = 0.146；P = 0.706；基质类型的主效应：F1,23 = 0.104；P = 0.751；线虫种类与基质类型之间的交互作用：F1,23 = 0.346；P = 0.563）。使用脱脂棉和马布的培养盘中，每升产生的 O. onirici 平均数量（单位：百万）分别为 101.11 ± 13.73 和 95.93 ± 20.19。使用脱脂棉和马布的培养盘中，每升产生的 H. georgiana 平均数量（单位：百万）分别为 82.23 ± 18.69 和 99.93 ± 18.40。
<img alt="昆虫生命周期阶段；实验流程图；幼虫孵育、收集和储存过程" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69678/69678fig1.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图 1"> 
图 1：基于饲养基方法的示意图。 步骤 1：接种；步骤 2：大规模孵育；步骤 3：转移至含筛网的聚丙烯酰胺凝胶。缩写：IJs = 感染性幼年线虫。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69678/69678fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="柱状图比较不同处理组T1-T5中每具蜡螟尸体的平均侵染性幼虫数量；含统计误差线。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69678/69678fig2.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图2"> 
图2：五种处理条件下每只Galleria mellonella尸体中Steinernema carpocapsae（All品系）侵染性幼虫（IJ）的平均产量。缩写：IJs = 侵染性幼虫线虫。本图经Oliveira-Hofman等9许可使用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69678/69678fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="白瓶诱捕法与聚丙烯酰胺凝胶处理法比较，每具蜡螟尸体中平均感染性幼虫数（含误差线）。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69678/69678fig3.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图3"> 
图3：采用白瓶诱捕法和聚丙烯酰胺凝胶处理法从每具Galleria mellonella尸体中获得的Heterorhabditis bacteriophora（VS菌株）平均感染性幼虫产量。 本图经Oliveira-Hofman等9许可使用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69678/69678fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们向农民介绍两种大规模繁殖昆虫病原线虫作为生物杀虫剂的方法。第一种方法采用聚丙烯酰胺凝胶作为线虫培养基质，第二种方法则使用聚合物包被的脱脂棉作为培养基质。两种方法均依赖于 体内 在昆虫尸体中线虫的繁殖。

通过体外或体内方法生产的昆虫病原线虫（EPNs）是害虫生物防治中高效的生物控制剂。体内……

我们的研究开发了一种可持续且便于种植者操作的方法，用于生产昆虫病原线虫，以克服成本和技术障碍，实现农场层面的害虫防控解决方案。这种低成本、低投入的昆虫病原线虫培养方法可实现可持续生产，并易于适用于多种线虫物种。开始制备初始接种物时，需获取目标昆虫病原线虫物种。使用斯氏线虫（Steinernema carpocapsae）ALL品系和异小杆线虫（Heterorhabditis bacteriophora）VS品系的感染期幼虫。进行单个感染实验时，用50只活的蜡螟幼虫（Galleria mellonella），每只昆虫接种100个感染期幼虫。将接种后的昆虫置于25°C条件下培养，直至感染期幼虫即将逸出。进行大规模接种时，将一只被感染的尸体与50只活的美洲大蜡螟（Galleria mellonella）幼虫放入容积为5.7至14.2升的塑料容器中，容器内衬湿润的纸巾，并将容器置于25°C条件下培养。72小时后，移除未出现适当颜色变化的尸体，以避免污染。若尸体呈黄褐色或棕色，表明为斯氏线虫（Steinernema）感染；若呈红色或橙色，则表明为异小杆线虫（Heterorhabditis）感染。接下来，按每克干胶加入20毫升水的比例，用水润湿聚丙烯酰胺凝胶。将尸体置于孔径为2毫米×2毫米的尼龙筛网上，并将颜色适当的尸体转移至装有聚丙烯酰胺凝胶的透明塑料容器中。当感染性幼虫的产量显著减少时，取出并丢弃已耗尽的尸体。从凝胶上方筛网上保留的感染宿主中收集感染性幼虫。在感染性幼虫开始出现后，继续在凝胶中收集五至七天。为了制备后续生产轮次的接种物，将健康的大蜡螟（Galleria mellonella）幼虫置于含有感染性幼虫的凝胶中，置于90毫米的培养皿内进行暴露感染。利用这些新感染的寄主接种下一组大蜡螟（Galleria mellonella）幼虫。对于昆虫病原线虫的应用，使用自来水和孔径小于0.3厘米的筛网冲洗已进入凝胶的感染性幼虫。或者，也可在不冲洗的情况下，直接将线虫连同凝胶施用于小型实验区域。为了从以黄粉虫（Tenebrio molitor）为宿主的活体线虫培养物中获得拟丽尾线虫（Oscheius onirici）和乔治亚异小杆线虫（Heterorhabditis georgiana）的感染期幼虫，需用水轻轻润湿圆形棉垫。将四到六只黄粉虫幼虫（活体或冻死后）以不重叠的方式置于两层棉垫之间，并加入10至15毫升水。在上层棉垫上加入10毫升浓度为每毫升400至500条感染期幼虫的线虫悬液，使感染期幼虫侵染黄粉虫。通过向顶层棉垫倾倒20至25毫升水，从培养皿中收集感染性幼虫，然后收集透过棉垫渗出的悬液。为了在大型浅盘中感染昆虫宿主，需将羊毛双层剪裁并放置于盘内，随后将黄粉虫（Tenebrio molitor）宿主均匀分布在羊毛层之间。用约400毫升浓度为每升80,000至90,000条线虫的线虫悬浮液充分浸透羊毛片后，将托盘置于21至22摄氏度下培养四周。四周后，通过向每个托盘加入500毫升自来水冲洗并收集洗出液，以收获线虫。再次进行一次冲洗，共收集一升线虫悬液。最后，在解剖显微镜下计数每毫升中的线虫数量，并统计每个重复培养皿的计数值。在斯氏线虫（Steinernema carpocapsae）实验中，将30个虫体置于14.2升透明塑料容器中的聚丙烯酰胺凝胶内，每虫体产生的感染期幼虫数量显著高于大型白色诱捕器中的产量。在嗜菌异小杆线虫实验中，与白色诱捕法相比，面向种植者的凝胶处理方法每具虫尸产生的感染性幼虫线虫数量显著更多。面向种植者的昆虫病原线虫生产方法具有成本低、易推广、可持续性强、使用寿命长以及产量高等优势，适用于害虫防控项目。昆虫病原线虫适用于多种多样的作物种植系统。与先前的方法不同，我们的基于培养物的方法一旦启动，便可完全实现自我维持。培养基凝胶在冷藏条件下可长期储存数月，以备后续使用，具有较高的成本效益。本研究为农民及相关利益方提供了在小面积区域繁殖昆虫病原线虫的明确路径，且无需过多技术难度。未来可进一步探索优化方法并提高效率。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

基于养殖者的 体内 昆虫病原线虫繁殖

介绍了两种不同的根结线虫植物筛选方法。所述方法包括以非破坏性方式对线虫进行高通量筛选，从而便于将这些植物用于育种项目。...

高通量与低通量根结线虫筛选 Meloidogyne spp.

为了研究Xenorhabdus细菌与Steinernema线虫之间的共生关系，研究人员开发了用于监测细菌在线虫体内存在情况及定位的方法。该实验方法可应用于其他系统，其核心步骤是通过基因工程使细菌表达绿色荧光蛋白，并利用荧光显微镜观察透明线虫体内的荧光标记细菌。...

使用荧光显微镜观察线虫中的细菌

本实验方案展示了两种接种方法，用于将虫生真菌Beauveria bassiana作为内生菌引入普通菜豆（Phaseolus...

将真菌昆虫病原菌定殖为内生菌：迈向内生生物防治

昆虫病原线虫是一类栖息于土壤中的线形蠕虫，可寄生多种昆虫。本文展示了利用两种技术从土壤中分离这些线虫的采样方法：昆虫诱捕法用于从土壤样品中回收线虫，改良White诱捕器法则用于从受感染的昆虫尸体中回收线虫。...

土壤采样及昆虫病原线虫（Steinernematidae, Heterorhabditidae）的分离

本演示的目的是展示 体内 和 体外 昆虫病原线虫的饲养技术 在体 方法考虑了利用昆虫宿主饲养这些线虫，而 体外...

体内与体外培养昆虫病原线虫（Steinernematidae和Heterorhabditidae）

本文介绍了一种基于 黄粉虫（Tenebrio...

从土壤样品中分离与筛选昆虫病原真菌及其对害虫的致病力评估

昆虫病原真菌作为农业害虫的生物防治制剂，其重要性日益凸显。本研究利用农业谷物产品，成功实现了对两种南非分离的Metarhizium robertsii和M.

昆虫病原真菌 Metarhizium robertsii 和 Metarhizium pinghaense 的大规模生产及其在防治害虫中的商业应用

昆虫病原线虫与细菌共生，二者共同作用，通过破坏昆虫的先天免疫系统成功感染宿主。为了促进对线虫感染遗传基础的研究，本文描述了昆虫病原线虫的保种及遗传操作方法。...

培养与遗传操作昆虫病原线虫

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in vivo 与 in vitro 条件下马铃薯根部感染植物寄生性线虫以评估诱导的结构变化

本文展示了在雌雄同体斯氏线虫（Steinernema...

基于CRISPR-Cas9的昆虫病原线虫Steinernema hermaphroditum诱变及突变株系的保种

学习利用聚丙烯酰胺凝胶基质和棉绒双层系统，在Tenebrio molitor幼虫体内大规模繁殖昆虫病原线虫的方法。该技术为农民提供了简单、可扩展的田间害虫生物防治解决方案，实现可持续的农场自主生产。

基于种植者的在体内昆虫病原线虫的繁殖

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