医用水蛭中的局部RNA干扰与异位基因表达

医用水蛭是一种用于神经生物学研究的有用模型系统，因其结构简单、易于操作，并且能够从早期胚胎发生到老年阶段，利用多种实验工具对特定神经元进行静态鉴定。胚胎水蛭的一个特别令人兴奋的应用是在活体完整动物中进行神经元突起生长的延时成像研究，从而在目标神经元或其靶基因的基因表达发生精确调控后，追踪其动态变化。在本视频中，我们展示了一种新型技术，该技术利用由 Alex Grossman 实验室与我们实验室合作开发的气动毛细管枪，实现对水蛭活体胚胎内部层次快速、准确且高度定位的试剂递送。

尽管该技术可应用于将DNA、双链RNA或任何其他可装载到微米级金颗粒上的分子递送至细胞，但我们将使用该方法对轴突导向分子Rin进行基因敲低和基因敲入。你好，我来自加州大学圣地亚哥分校生物科学部Eduardo Ano实验室。今天我们将向您展示一种针对轴突导向分子networking进行表达敲低或敲入的操作流程。该分子在lech幼虫所有体节的腹侧体壁中天然表达，但在背侧区域不表达。

我们将在发育早期将双链RNA或质粒DNA分子递送至选定体节的体壁和神经节中。通过气动毛细管枪进行整体递送尤为重要，因为这种方法能够干扰亚体节特定区域的基因表达模式，同时保留未经处理的体节作为内部对照。此外，该方法可在不损伤组织且无需解剖标本的情况下，用于在发育早期到达细胞的内部层次。

最后，整体递送的优势在于能够靶向特定位置的有限数量细胞，介于通过显微注射实现的单细胞敲低和通过遗传方法实现的系统性敲低之间。那么，让我们开始吧。由于其中枢神经系统结构简单，约有200对双侧神经元和少量巨大胶质细胞组成，药用蚂蟥（LE）长期以来被用于研究神经细胞特性及与行为相关的神经回路。

从早期胚胎到成体，每个身体节段的21个节段神经节以及水蛭的每个神经元都可以在不同标本之间反复识别和研究。自法老时代以来，水蛭一直被用于放血治疗，其在医学上的持续应用使其可从商业动物供应商处轻易获得。然而，由于我们研究神经系统发育，我们在实验室中维持着一个包含数百只水蛭的活体种群，从而为我们的实验持续提供胚胎材料。

水蛭是雌雄同体动物，具有雌性和雄性两种结构，并通过异体受精进行繁殖。因此，所有个体均能产卵。

它们会将卵产入一种称为茧的结构中，这种茧由其自身特化的腺体分泌出的特殊聚合物构成，这些腺体位于身体的一个特定区域，称为C区腹板（C clay tellum）。当蛭类准备产卵时，会钻入我们于养殖箱中提供的苔藓中，并在其体表开始形成这种卵形的茧；当分泌物积累到足够量且分子开始聚合后，蛭类便将卵以及营养卵黄一并置入茧内，随后从中缓缓退出。使用剃刀刀片，我们可通过在茧的一端切开一个小窗来取出胚胎。

通常，从开始分化约第6天起，每个卵茧内含有10到20个胚胎。可将胚胎从卵茧中取出，并在池塘水中进行培养。这些阶段正是我们通常开始进行神经发育实验研究的时期。

该实验的第一步是制备包被颗粒。在本演示中，我们将展示如何将包被有轴突导向分子rin的lech同源基因双链RNA分子的金颗粒递送至lech胚胎中。靶细胞为体壁中的腹侧纵行肌细胞，已知这些细胞在Agenesis早期阶段即开始表达并释放Rin。

我们的目标是在发育早期尽可能早地敲低单个体节中的天然表达，并观察这一操作如何影响对这一重要发育因子敏感的神经元分类。在此步骤中，需要使用超声波清洗仪、涡旋振荡器、台式离心机和冰桶。还需要100%异丙醇，使用前应将其置于冰上冷却。

取100微升结合缓冲液，其中含有每毫升50毫克的vault颗粒。这些颗粒专为RNA干扰（RNAi）设计，由chell公司生产。接下来，加入100微升结合缓冲液稀释颗粒溶液，短暂涡旋混匀，并超声处理1至2分钟，以分离可能聚集在一起的颗粒。

孵育两分钟后，向颗粒中加入5至10微克的双链RNA，涡旋混匀，并在室温下静置两分钟。现在两分钟已到，将双链RNA与颗粒的复合物在微型离心机中以至少2,500 RPM离心约15秒。

为了获得沉淀物，去除上清液，并加入750 µL异丙醇，尽量避免扰动沉淀。在微量离心机中短暂离心，离心后去除上清液，然后通过超声处理将金颗粒重悬于100%冷异丙醇中。超声处理时短暂给予2至3次脉冲，以分散颗粒。

滴加到玻璃载玻片上，并让溶剂完全蒸发。当颗粒在递送至组织前立即进行包被时，可获得最佳效果，下一步我们将向您展示如何操作。在进行体内转染之前，让我们先查看实验装置及其准备方法。

气动毛细管枪安装在显微操作器上，用于将颗粒精确递送至胚胎内部。使用视频显微镜对胚胎表面进行成像。半导体激光器产生一束光，通过枪的内层毛细管导向，并用于对准目标组织。

连接到枪头三个入口的独立钛管管线提供来自单一气源的加压氦气。其中一条管线始终打开，使氦气持续流经喷枪。另外两条管线通常由电磁阀关闭，管内含有负载在管路中的、具有两种不同涂层的金颗粒。

以干燥粉末形式存在。枪的外层毛细管连接至真空系统，其表压为负12.5 PSI。通过调节hi的头部压力在10至15 PSI之间，以达到所需的颗粒穿透深度。

氦气头部压力会显著影响微粒的穿透深度，胚胎与基因枪之间的距离也会产生类似影响。喷嘴直径因不同型号的基因枪而异，在选择时需考虑靶区面积。现在我们已经展示了实验装置，接下来让我们装载基因枪，并对一些拟南芥胚胎进行轰击。

在装载Titan管之前，必须确保包被的金颗粒完全干燥。首先使用盖玻片或刀片将包被的金颗粒从玻片上刮下，并准备将其装入折叠好的乳清纸中。装样时，应将管子靠近连接头处弯成U形，以便金颗粒在装入时不会分散到整段管中，而是集中在连接头附近。

使用小刮勺或V形称量纸取颗粒，并将其装入导管中。在装管过程中，用手指轻弹导管，使颗粒均匀分布。装管完成后，即可使用Jing枪递送双链RNA，但在操作前需先准备好我们的水蛭。

在此可以看到我们的水蛭胚胎，其发育时间约为10天。它们目前处于无菌培养基中，在双链RNA递送前后均将保持在此环境中。准备用于双链RNA递送的实验胚胎的第一步，是在一块带有V形凹槽的柔软硅胶片上，加入含有8%乙醇的无菌培养基溶液。

加入一个胚胎，并在射击颗粒前立即将其腹面朝上放置。腔室中的培养基液面略低于胚胎的上表面，取一片中间剪有小孔的滤纸覆盖其上，以稳定胚胎并防止其表面干燥，同时仅暴露今日实验所用胚胎阶段的靶向区域。在E10阶段，纵行肌细胞位于表皮、真皮和环形肌层内侧，距外表面约10至20微米处。

与肌肉细胞不同，胚胎发育阶段（我们所用的 E7 至 E12 阶段）胚胎腹侧的中枢神经节位于体表腹面下方约 50 微米处。我们将调整氦气压力，以便靶向位于较浅深度的纵行肌，因为纵行肌的位置比神经节更靠近表面。现在，我们已准备好用金颗粒轰击纵行肌。

通常，约半毫克的金颗粒可用于最多10次射击，每次射击一般可递送数百个颗粒。通过短暂打开其中一个阀门0.3秒产生一次射击，从而使相应管路中的颗粒团注入枪管内。为了覆盖目标组织区域，通常需要多次射击。

每次射击之间需轻轻敲击管壁，以震落部分颗粒，并促进其注入枪膛内的连续氦气流中。若希望在同一实验中递送第二种试剂，可在金颗粒递送完成后，立即将不同的颗粒装入第二根管中。将胚胎放回人工池水中，最好每个培养皿放置一个胚胎，在人工池水中培养一至三天，直至认为RNA干扰或异位表达已达到足够水平。

在此期间，胚胎置于室温下的避光环境中。以下是针对神经元中 Mr.NA 敲低的 ceto 杂交实验结果。可以看出，在处理后的胚胎中，少数肌细胞不表达 terrin。

这些肌肉中含有颗粒。可以看出，当颗粒包被了terrind双链RNA后，会导致narin表达明显下调，且这种下调仅出现在含有颗粒的细胞中，通常每个细胞含有一到两个颗粒。当用编码GFP的质粒对颗粒进行包被时，使用我们所用的气动毛细管枪将颗粒射入神经元细胞后，可在细胞核中观察到荧光。

在本演示中，我们能够在不引起靶向区域细胞可检测损伤的情况下，将两种颗粒递送至活体胚胎的微小局部区域内。我们还向您展示了游动毛细管枪如何实现整体递送技术，并具备在三维限定的组织微区中高精度靶向敲入和敲低基因的新能力，且不会对组织造成可检测的损伤。以上就是全部内容。

感谢观看，祝您的实验顺利。