Name: 本地化的RNAi和药用水蛭异位基因表达 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-17T22:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 19 s
Description: 了解利用气动毛细管枪向药用水蛭活体胚胎进行生物弹道递送的新方法，实现Netrin基因表达的局部敲低。该技术可在不损伤组织的情况下精准靶向深层细胞，为神经发育研究提供有力工具。

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我们感谢 Michael Baker 博士在构建基因敲入载体以及提供感觉投射生长的延时电影方面给予的帮助。我们还要感谢 Virginia Vandelinder 在气动枪实验中的技术支持。

颗粒可以用不同的试剂进行包被，例如双链RNA分子、DNA质粒或染料。颗粒的类型和直径需根据所用试剂以及组织中靶细胞的深度来选择：较大的颗粒穿透更深，但可能会对组织造成一定损伤。
1. 制备包被dsRNA的微粒
<ol>
<li>将100%异丙醇置于冰上。</li>
<li>用100 µl结合缓冲液重悬5 mg金颗粒（S1600ri，Seashell Technology, LLC；平均直径1.6 µm）。溶液准备好后，继续下一步操作。</li>
<li>加入100 µl结合缓冲液稀释颗粒溶液，短暂涡旋，并超声处理1–2分钟以避免结块。</li>
<li>加入5–10 µg dsRNA/siRNA（dsRNA/siRNA应溶于水，浓度约为1 µg/µl）。</li>
<li>涡旋混匀，在室温下静置2分钟。此浓度和孵育时间可使siRNA充分结合金颗粒。</li>
<li>在台式离心机中以约2,500 rpm离心约15秒，沉淀siRNA/金颗粒复合物。</li>
<li>弃去上清液，轻轻加入750 µl冷的异丙醇，尽量避免扰动沉淀。短暂离心后弃去上清液。</li>
<li>用100 µl冷的100%异丙醇重悬金颗粒，然后在水浴超声仪中短暂超声（2–3次脉冲）以分散颗粒团聚。最后，将悬浮液倒入玻璃载片上，室温下自然干燥。</li>
</ol>
2. 为特定检测准备实验装置
<ol>
<li>每种基因枪的喷嘴孔径直径各不相同，范围从最小约50µm到最大约3mm。因此，应根据靶向组织区域的大小选择合适的基因枪。</li>
<li>氦气压力需根据靶细胞在组织中的深度进行调节，通常适用于深度达约100µm的细胞（较高的压力可使微粒穿透更深）。胚胎与喷嘴尖端之间的距离也会影响微粒的穿透深度，因为金微粒在空气中会损失动量。</li>
</ol>
3. 用预包被的微粒装载基因枪
应将颗粒以干燥粉末形式装入连接至多通阀的特氟龙颗粒注射管路中。该管路在不使用时应保存在4°C的干燥环境中，且可在使用相同试剂的后续实验中重复使用。我们的实验装置可通过多通阀中的不同端口，在每次检测中输送最多两种不同的试剂。
<ol>
<li>在将干燥的包被颗粒装入Tygon管路之前，使用玻璃盖玻片边缘或刀片从载玻片上刮取颗粒。该Tygon管路仅专用于此试剂，以避免交叉污染。</li>
<li>装入颗粒时，将管路靠近连接器处弯成U形，以防止颗粒分散至整段管路，使其集中于连接器附近。使用小刮勺或折叠的称量纸取样，每批胚胎装入约一半的颗粒。在装样过程中轻敲管路，使颗粒均匀分布。</li>
</ol>
4. 动物准备
在金颗粒递送前后，胚胎均需保存在室温下的无菌人工池水中。
<ol>
<li>将胚胎腹侧朝上放置于一块平整的、5毫米厚的硅橡胶（Sylgard 184，Dow Corning，Midland，MI）上刻出的沟槽中，并用含8%乙醇的无菌人工池水溶液进行麻醉（E6-E8阶段的较年轻胚胎可在整个实验过程中保持在不含乙醇的人工池水中）。</li>
<li>在射击微粒前，立即通过移除部分溶液降低浴液液面，以暴露胚胎的腹面。在其上方覆盖一张中间剪有小孔的滤纸，以固定胚胎并防止其表面干燥。</li>
</ol>
5. 将包被颗粒递送至目标组织
通常，一批颗粒可用于最多十次轰击，单次轰击一般可递送数百个颗粒。
<ol>
<li>打开其中一个阀门 0.3 秒以产生一次射击，使相应管路中的一团颗粒注入基因枪内。</li>
<li>在每次射击之间轻轻敲击管路，使附着在管壁上的颗粒脱落，从而促进其进入基因枪的氦气流中。</li>
<li>为了覆盖目标组织区域，可能需要进行多次射击。</li>
<li>颗粒递送完成后，将胚胎放回人工池水中，最好将每个胚胎单独放置于多孔板中的一个孔内。</li>
</ol>
6. 免疫染色与神经元标记
在颗粒递送后，将胚胎置于室温及避光条件下培养1至3天，直至实现RNA干扰（或异位表达）。随后，对实验组样本和对照组进行以下任一操作：
<ol>
<li>原位杂交检测Netrin mRNA的存在与否。将地高辛标记的蛭类netrin核糖探针与完整的蛭类胚胎进行杂交。</li>
<li>免疫细胞化学染色检测Netrin蛋白以及其他神经组织特异性蛋白（如抗乙酰化微管蛋白）。该操作同样在整体胚胎上进行。</li>
<li>脂溶性染料的显微注射（DiI和DiO）至单个神经元内，通过染料填充标记处理组和对照组节段中目标神经元（本研究中为机械感受性压觉神经元）的完整分支结构。该检测在活体胚胎（完整或解剖后）上进行。</li>
</ol>

<ol><li>Baker, M. W., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+of+the+receptor+tyrosine+phosphatase+HmLAR2+in+a+single+cell+of+an+intact+leech+embryo+leads+to+growth-cone+collapse%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse.</a> Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).</li>
<li>Baker, M. W., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Hirudo+medicinalis+DNA+Promoters+for+Targeted+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of Hirudo medicinalis DNA Promoters for Targeted Gene Expression.</a> Journal of Neuroscience Methods. 156, 145-153 (2006).</li>
<li>Gan, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+expression+of+a+leech+netrin+suggests+roles+in+the+formation+of+longitudinal+nerve+tracts+and+in+regional+innervation+of+peripheral+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Cellular expression of a leech netrin suggests roles in the formation of longitudinal nerve tracts and in regional innervation of peripheral targets.</a> Journal of Neurobiology. 40, 103-115 (1999).</li>
<li>Juven-Gershon, T., Cheng, S., Kadonaga, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+a+super+core+promoter+that+enhances+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rational design of a super core promoter that enhances gene expression.</a> Nature Methods. 3, 917-922 (2006).</li>
<li>Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumatic+capillary+gun+for+ballistic+delivery+of+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles.</a> Applied Physics Letters. 87, 014103(2005).</li>
<li>Shefi, O., Simonnet, C., Baker, M. W., Glass, J. R., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtargeted+gene+silencing+and+ectopic+expression+in+live+embryos+using+biolistic+delivery+with+a+pneumatic+capillary+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun.</a> Journal of Neuroscience. 26, 6119-6123 (2006).</li>
</ol>

在本实验中，我们使用气动毛细管枪将金颗粒递送至活体医用水蛭胚胎的局部微小区域，以实现基因的敲入和敲除。靶向区域的直径通常约为 150 µm，颗粒分布于平均穿透深度周围约 15 µm 范围内，穿透深度可在 0 至 50 µm 范围内调节。当金颗粒表面包被轴突导向因子 netrin 的双链 RNA（dsRNA）分子时，可导致 netrin 表达显著下调，且该效应仅出现在含有颗粒的细胞中。当颗粒包被编码绿色荧光蛋白（GFP）的质粒时，一旦颗粒进入神经元细胞核，即可诱导细胞产生荧光信号。
我们向您展示了气动毛细管枪如何为基因枪递送技术赋予新的能力，即能够在三维空间内精确定位组织中的微观区域，实现高精度靶向，且不会对组织造成可检测到的损伤。

<table><tbody><tr><td>金颗粒</td><td>其他</td><td>Seashell Technology, LLC</td><td>S1600ri</td><td></td></tr><tr><td>结合缓冲液</td><td>试剂</td><td>Seashell Technology, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硅橡胶</td><td>试剂</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr></tbody></table>

医用水蛭中的局部rna干扰与异位基因表达

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

在本视频中，我们展示了使用气动毛细管枪将试剂精确地通过基因枪法递送至活体组织中的方法。我们利用该方法干扰蛭类胚胎特定节段的基因表达模式，而未处理的节段则作为内部对照。
气动毛细管枪可用于在不打开样本的情况下，到达发育早期阶段的内部细胞层。作为一种将物质局部导入活体组织的方法，该枪具有的基因枪递送技术具有多个优势：操作快速、无需接触且无损。此外，同一支毛细管枪可用于独立递送不同物质。递送区域的横向尺寸约为50–150 µm，沿平均穿透深度周围延伸约15 µm，平均穿透深度可在0至50 µm范围内调节。该递送技术的优势在于，能够在选定位置实现有限数量细胞的靶向处理，其范围介于通过显微注射实现的单细胞敲低与通过细胞外注射或遗传学方法实现的系统性敲低之间。
为了敲低或敲入轴突导向分子Netrin的表达（该分子天然表达于某些中枢神经元和腹侧体壁，但在背侧区域不表达），我们将dsRNA或质粒DNA分子递送至体壁和中枢神经节。该操作程序包括以下步骤：（i）针对特定实验准备实验装置（调节加速压力），（ii）用dsRNA或DNA分子包被微粒，（iii）将包被的微粒装入基因枪中，每次实验最多可装载两种试剂，（iv）准备用于微粒递送的动物样本，（v）将包被的微粒递送至靶组织（体壁或神经节），以及（vi）对胚胎进行后续处理（免疫染色、免疫组织化学和神经元标记），以观察实验结果，通常在递送后2至3天进行。
当颗粒包被 netrin dsRNA 时，会导致 netrin 表达出现明显可见的敲低，且仅发生在含有颗粒的细胞中（通常每个细胞含有 1-2 个颗粒）。当包被编码 EGFP 质粒的颗粒停留在神经元细胞核内时，可诱导细胞产生荧光。

在本视频中，我们展示了一种利用新型微型基因枪将试剂精确递送至活体组织的生物弹道递送方法。我们通过将双链RNA分子递送至单个节段的腹侧体壁和神经节，实现对水蛭胚胎中轴突导向分子Netrin表达的敲低。

医用水蛭中的局部RNA干扰与异位基因表达

在本视频中，我们展示了使用气动毛细管枪将试剂精确地通过基因枪法递送至活体组织的方法。我们采用该方法来……

医用水蛭是一种用于神经生物学研究的有用模型系统，因其结构简单、易于操作，并且能够从早期胚胎发生到老年阶段，利用多种实验工具对特定神经元进行静态鉴定。胚胎水蛭的一个特别令人兴奋的应用是在活体完整动物中进行神经元突起生长的延时成像研究，从而在目标神经元或其靶基因的基因表达发生精确调控后，追踪其动态变化。在本视频中，我们展示了一种新型技术，该技术利用由 Alex Grossman 实验室与我们实验室合作开发的气动毛细管枪，实现对水蛭活体胚胎内部层次快速、准确且高度定位的试剂递送。尽管该技术可应用于将DNA、双链RNA或任何其他可装载到微米级金颗粒上的分子递送至细胞，但我们将使用该方法对轴突导向分子Rin进行基因敲低和基因敲入。你好，我来自加州大学圣地亚哥分校生物科学部Eduardo Ano实验室。今天我们将向您展示一种针对轴突导向分子networking进行表达敲低或敲入的操作流程。该分子在lech幼虫所有体节的腹侧体壁中天然表达，但在背侧区域不表达。我们将在发育早期将双链RNA或质粒DNA分子递送至选定体节的体壁和神经节中。通过气动毛细管枪进行整体递送尤为重要，因为这种方法能够干扰亚体节特定区域的基因表达模式，同时保留未经处理的体节作为内部对照。此外，该方法可在不损伤组织且无需解剖标本的情况下，用于在发育早期到达细胞的内部层次。最后，整体递送的优势在于能够靶向特定位置的有限数量细胞，介于通过显微注射实现的单细胞敲低和通过遗传方法实现的系统性敲低之间。那么，让我们开始吧。由于其中枢神经系统结构简单，约有200对双侧神经元和少量巨大胶质细胞组成，药用蚂蟥（LE）长期以来被用于研究神经细胞特性及与行为相关的神经回路。从早期胚胎到成体，每个身体节段的21个节段神经节以及水蛭的每个神经元都可以在不同标本之间反复识别和研究。自法老时代以来，水蛭一直被用于放血治疗，其在医学上的持续应用使其可从商业动物供应商处轻易获得。然而，由于我们研究神经系统发育，我们在实验室中维持着一个包含数百只水蛭的活体种群，从而为我们的实验持续提供胚胎材料。水蛭是雌雄同体动物，具有雌性和雄性两种结构，并通过异体受精进行繁殖。因此，所有个体均能产卵。它们会将卵产入一种称为茧的结构中，这种茧由其自身特化的腺体分泌出的特殊聚合物构成，这些腺体位于身体的一个特定区域，称为C区腹板（C clay tellum）。当蛭类准备产卵时，会钻入我们于养殖箱中提供的苔藓中，并在其体表开始形成这种卵形的茧；当分泌物积累到足够量且分子开始聚合后，蛭类便将卵以及营养卵黄一并置入茧内，随后从中缓缓退出。使用剃刀刀片，我们可通过在茧的一端切开一个小窗来取出胚胎。通常，从开始分化约第6天起，每个卵茧内含有10到20个胚胎。可将胚胎从卵茧中取出，并在池塘水中进行培养。这些阶段正是我们通常开始进行神经发育实验研究的时期。该实验的第一步是制备包被颗粒。在本演示中，我们将展示如何将包被有轴突导向分子rin的lech同源基因双链RNA分子的金颗粒递送至lech胚胎中。靶细胞为体壁中的腹侧纵行肌细胞，已知这些细胞在Agenesis早期阶段即开始表达并释放Rin。我们的目标是在发育早期尽可能早地敲低单个体节中的天然表达，并观察这一操作如何影响对这一重要发育因子敏感的神经元分类。在此步骤中，需要使用超声波清洗仪、涡旋振荡器、台式离心机和冰桶。还需要100%异丙醇，使用前应将其置于冰上冷却。取100微升结合缓冲液，其中含有每毫升50毫克的vault颗粒。这些颗粒专为RNA干扰（RNAi）设计，由chell公司生产。接下来，加入100微升结合缓冲液稀释颗粒溶液，短暂涡旋混匀，并超声处理1至2分钟，以分离可能聚集在一起的颗粒。孵育两分钟后，向颗粒中加入5至10微克的双链RNA，涡旋混匀，并在室温下静置两分钟。现在两分钟已到，将双链RNA与颗粒的复合物在微型离心机中以至少2,500 RPM离心约15秒。为了获得沉淀物，去除上清液，并加入750 µL异丙醇，尽量避免扰动沉淀。在微量离心机中短暂离心，离心后去除上清液，然后通过超声处理将金颗粒重悬于100%冷异丙醇中。超声处理时短暂给予2至3次脉冲，以分散颗粒。滴加到玻璃载玻片上，并让溶剂完全蒸发。当颗粒在递送至组织前立即进行包被时，可获得最佳效果，下一步我们将向您展示如何操作。在进行体内转染之前，让我们先查看实验装置及其准备方法。气动毛细管枪安装在显微操作器上，用于将颗粒精确递送至胚胎内部。使用视频显微镜对胚胎表面进行成像。半导体激光器产生一束光，通过枪的内层毛细管导向，并用于对准目标组织。连接到枪头三个入口的独立钛管管线提供来自单一气源的加压氦气。其中一条管线始终打开，使氦气持续流经喷枪。另外两条管线通常由电磁阀关闭，管内含有负载在管路中的、具有两种不同涂层的金颗粒。以干燥粉末形式存在。枪的外层毛细管连接至真空系统，其表压为负12.5 PSI。通过调节hi的头部压力在10至15 PSI之间，以达到所需的颗粒穿透深度。氦气头部压力会显著影响微粒的穿透深度，胚胎与基因枪之间的距离也会产生类似影响。喷嘴直径因不同型号的基因枪而异，在选择时需考虑靶区面积。现在我们已经展示了实验装置，接下来让我们装载基因枪，并对一些拟南芥胚胎进行轰击。在装载Titan管之前，必须确保包被的金颗粒完全干燥。首先使用盖玻片或刀片将包被的金颗粒从玻片上刮下，并准备将其装入折叠好的乳清纸中。装样时，应将管子靠近连接头处弯成U形，以便金颗粒在装入时不会分散到整段管中，而是集中在连接头附近。使用小刮勺或V形称量纸取颗粒，并将其装入导管中。在装管过程中，用手指轻弹导管，使颗粒均匀分布。装管完成后，即可使用Jing枪递送双链RNA，但在操作前需先准备好我们的水蛭。在此可以看到我们的水蛭胚胎，其发育时间约为10天。它们目前处于无菌培养基中，在双链RNA递送前后均将保持在此环境中。准备用于双链RNA递送的实验胚胎的第一步，是在一块带有V形凹槽的柔软硅胶片上，加入含有8%乙醇的无菌培养基溶液。加入一个胚胎，并在射击颗粒前立即将其腹面朝上放置。腔室中的培养基液面略低于胚胎的上表面，取一片中间剪有小孔的滤纸覆盖其上，以稳定胚胎并防止其表面干燥，同时仅暴露今日实验所用胚胎阶段的靶向区域。在E10阶段，纵行肌细胞位于表皮、真皮和环形肌层内侧，距外表面约10至20微米处。与肌肉细胞不同，胚胎发育阶段（我们所用的 E7 至 E12 阶段）胚胎腹侧的中枢神经节位于体表腹面下方约 50 微米处。我们将调整氦气压力，以便靶向位于较浅深度的纵行肌，因为纵行肌的位置比神经节更靠近表面。现在，我们已准备好用金颗粒轰击纵行肌。通常，约半毫克的金颗粒可用于最多10次射击，每次射击一般可递送数百个颗粒。通过短暂打开其中一个阀门0.3秒产生一次射击，从而使相应管路中的颗粒团注入枪管内。为了覆盖目标组织区域，通常需要多次射击。每次射击之间需轻轻敲击管壁，以震落部分颗粒，并促进其注入枪膛内的连续氦气流中。若希望在同一实验中递送第二种试剂，可在金颗粒递送完成后，立即将不同的颗粒装入第二根管中。将胚胎放回人工池水中，最好每个培养皿放置一个胚胎，在人工池水中培养一至三天，直至认为RNA干扰或异位表达已达到足够水平。在此期间，胚胎置于室温下的避光环境中。以下是针对神经元中 Mr.NA 敲低的 ceto 杂交实验结果。可以看出，在处理后的胚胎中，少数肌细胞不表达 terrin。这些肌肉中含有颗粒。可以看出，当颗粒包被了terrind双链RNA后，会导致narin表达明显下调，且这种下调仅出现在含有颗粒的细胞中，通常每个细胞含有一到两个颗粒。当用编码GFP的质粒对颗粒进行包被时，使用我们所用的气动毛细管枪将颗粒射入神经元细胞后，可在细胞核中观察到荧光。在本演示中，我们能够在不引起靶向区域细胞可检测损伤的情况下，将两种颗粒递送至活体胚胎的微小局部区域内。我们还向您展示了游动毛细管枪如何实现整体递送技术，并具备在三维限定的组织微区中高精度靶向敲入和敲低基因的新能力，且不会对组织造成可检测的损伤。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

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