Name: 利用优化的胞质洗收集方法从拟南芥叶片中分离和纯化植物胞外囊泡 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-24T12:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 学习从拟南芥叶片中分离和纯化植物胞外囊泡的标准化方法。该优化方案采用温和的注射器渗透和先进的密度梯度离心技术，可最大程度减少细胞质污染，获得高纯度囊泡样品，适用于植物微生物互作及囊泡货物分析等下游研究。

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B.D. 获得德克萨斯农工大学博士之路奖学金的资助&amp;#38;M大学。B.H.由德克萨斯A&amp;#38;M 大学及美国农业部 HATCH 7009138 项目编号：TEX08074。

注意：为保持细胞外囊泡（EV）的完整性，所有离心步骤均须在4 °C的冷藏离心机中进行。应使用无菌离心管。所有样本操作步骤应快速高效地完成，理想情况下由多名人员并行操作，以尽量减少组织损伤，并防止可能影响EV质量的污染。
1. 叶片准备与浸润
<ol>
	<li>配制1 L囊泡分离缓冲液（VIB），其中包含20 mM MES水合物、2 mM CaCl2、0.1 M NaCl，pH为6。</li>
	<li>通过在叶片基部切割去除叶柄，采集叶片远端区域。 
	&#8203;注意：建议每种处理或基因型至少使用100株四周大的植株，以确保获得足够的细胞外囊泡产量。拟南芥植株在8小时光照/16小时黑暗的条件下生长。避免使用表现出明显胁迫症状（如叶片漂白或皱缩）的叶片。</li>
	<li>用反渗透（RO）水清洗叶片三次。将叶片置于纸巾上，轻轻拍干。</li>
	<li>将约50 mL叶片装入一支120 mL注射器中。轻敲注射器使叶片沉降。</li>
	<li>向注射器中加入约60 mL VIB，直至叶片完全浸没。轻轻推动活塞排出滞留空气。将一块折叠四次的封口膜压在注射器前端，防止液体泄漏。 
	注意：进行基于注射器的真空渗透时，应在施加真空前确保注射器和活塞已牢固组装。施力应逐渐进行，并牢固握住注射器，以防活塞突然移动或失控。</li>
	<li>通过缓慢向外拉动活塞产生真空，使叶片渗透。将活塞保持在拉出位置5秒，然后缓慢释放。重复此渗透过程2–3次，直至叶片颜色变深且呈半透明状，表明渗透成功。</li>
	<li>注意：由于真空阻力，拉动活塞需要一定的力度。操作时应牢固握住注射器，并缓慢回拉活塞，以实现可控的渗透过程。</li>
	<li>叶片完成渗透后，抽出活塞。将多余的缓冲液倒入水槽中。</li>
	<li>重复步骤1.4–1.7，直至所有采集的叶片均完成渗透（图1A）。</li>
</ol>
2. 胞间洗涤液（AWF）的收集
<ol>
	<li>剪一段约30厘米长的透明胶带，粘性面朝上放置。将胶带一端绕在一支1 mL的空无针注射器较宽端下方，将其固定。将大约50–70片浸润过的叶片依次重叠排列在胶带的粘性表面上，使每片叶片的基部朝向注射器底部，叶尖向上，以便收集（图1B）。 
	注意：将多片叶片叠加在一条胶带上有助于防止损伤。所有叶片应统一朝向，叶片基部朝向收集管底部，以确保离心过程中高效回收质外体液体。</li>
	<li>将附有叶片的胶带牢固地缠绕在注射器周围，然后用两条透明胶带将束的顶部固定。将包裹好的注射器插入50 mL离心管中，使叶片的切割端和注射器基部朝向离心管底部。确保叶片被胶带牢固固定，因为缠绕松动可能导致叶片损伤，释放破裂的细胞，从而污染质外体洗出液（图1B）。</li>
	<li>将包裹好的注射器（内含浸润叶片）放入配备固定角转子的冷藏离心机中，在4 °C条件下以900 × g离心10分钟。将收集到的质外体洗出液转移至新的15 mL圆锥形离心管中，并将样品置于冰上保存。重复步骤2.1–2.3，直至所有叶片均用于收集AWF。 
	注意：AWF应澄清，不应呈绿色或淡绿色。绿色的AWF表明存在叶绿体/叶绿素，也可能提示细胞污染。为尽量减少叶片损伤，应使用固定角转子。</li>
</ol>
3. 通过差速离心法从拟南芥无细胞渗出液中分离细胞外囊泡
<ol>
	<li>将收集的质外体洗脱液在4 °C条件下，使用配备摆桶转子的冷藏离心机以2,000 g离心20分钟。离心后，使用0.45 µm尼龙细胞滤膜去除上清液中的大颗粒细胞碎片。弃去沉淀。将滤过的上清液转移至新的离心管中（图2）。</li>
	<li>将滤过的上清液在4 °C条件下，使用配备固定角转子的冷藏离心机以10,000 × g离心30分钟。弃去沉淀，保留上清液用于超速离心。此步骤可进一步去除大颗粒细胞碎片和大型囊泡（图2）。</li>
	<li>将上清液转移至17 mL超速离心管中，在4 °C条件下使用配备摆桶转子的超速离心机以100,000 × g离心1小时。离心结束后，弃去上清液，并将沉淀用约16 mL VIB缓冲液重悬进行洗涤。重复一次超速离心步骤以收集细胞外囊泡（EVs）（图2）。 
	注意：100,000 × g的离心用于沉淀外泌体等小型囊泡。后续的洗涤步骤通过将沉淀重悬于缓冲液中以去除非EV蛋白。超速离心管在离心前必须根据制造商说明按质量精确配平。使用前应检查离心管和转子是否存在缺陷，并确保转子已正确安装后再启动离心程序。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀用VIB缓冲液重悬。使用移液器吸头轻轻刮擦管底，以促进EV沉淀的完全回收（图2）。 
	注意：EV沉淀通常呈半透明状，重悬后可能肉眼不可见。轻轻刮擦管底有助于EV的充分重悬。可根据需要调整重悬体积以达到目标EV浓度，通常较小的重悬体积可获得更高浓度的EV制备物。一般将EV重悬于50 µL缓冲液中，可获得约1–1.5 µg/µL的蛋白浓度和接近109–1010 粒子/mL的粒子浓度。</li>
	<li>重悬后的EV可于4 °C保存以立即使用，或于-80 °C长期保存，无需液氮速冻。 
	注意：长期保存可能降低EV的完整性。应尽可能使用新鲜制备的EV。</li>
</ol>
4. 使用蔗糖密度梯度分离法进行细胞外囊泡纯化
注意：仅超速离心会共同沉淀多种类型的囊泡。为了获得更高的分辨率，可采用密度梯度分离法，根据囊泡的浮力密度和漂浮特性进行分离。该方法中，可使用蔗糖梯度以富集特定的细胞外囊泡亚群。 alternatively，也可使用碘克沙醇梯度。
<ol>
	<li>上加载蔗糖梯度分离EVs
	<ol>
		<li>使用VIB配制10-90%蔗糖梯度储备液，浓度分别为：10%、16%、22%、28%、34%、40%、46%、52%、58%、64%、70%和90%。使用60 °C水浴以助溶解70%和90%的储备液。</li>
		<li>在17 mL超速离心管中，从最浓溶液开始自下而上依次叠加1 mL各浓度蔗糖溶液，形成不连续梯度。组装梯度时省略10%蔗糖层。 
		&#8203;注意：沿离心管内壁小心加入每一密度层，以尽量减少相邻层之间的混合。建议使用设定为慢速排液的自动移液器，以提供连续、可控的流速并提高梯度稳定性。若使用普通手动移液器，应缓慢而稳定地排液，移液枪头置于前一层界面略上方，并注意避免气泡产生。</li>
		<li>将重悬的EV沉淀（约100 µg EV蛋白）与1 mL 10%蔗糖溶液混合，然后将此混合物作为最后一层加至不连续梯度顶部。总体积约为12.1 mL。</li>
		<li>在4 °C条件下，以100,000 g离心16小时。 
		&#8203;注意：对于长时间超速离心操作，请确认离心管、管盖和转子均适用于长时间高速运行，并遵循制造商推荐的平衡程序。</li>
		<li>用移液器从顶部收集每份样品的六个2 mL组分，分别转移至新的17 mL超速离心管中。</li>
		<li>将收集的各组分用约16 mL VIB缓冲液重悬，并在4 °C条件下以100,000 g离心1小时。</li>
		<li>弃去上清液，然后将每份沉淀用50 µL VIB缓冲液重悬。 
		&#8203;注意：EV沉淀不可见。应用移液枪头轻轻刮擦管底以助重悬。根据需要调整缓冲液体积（例如，高浓度时可使用10 µL）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>下加载蔗糖梯度分离EVs
	<ol>
		<li>使用VIB缓冲液配制10-90%蔗糖梯度储备液，浓度分别为：10%、16%、22%、28%、34%、40%、46%、52%、58%、64%、70%和90%。使用60 °C水浴以助溶解70%和90%的储备液。</li>
		<li>将重悬的EV沉淀（约100 µg EV蛋白）与1 mL 90%蔗糖溶液混合，然后将此混合物作为第一层加至不连续梯度底部。</li>
		<li>在EV-90%蔗糖混合物上方依次叠加1 mL各浓度蔗糖溶液，从70%蔗糖开始逐步递减至较低浓度（64%、58%、52%、46%、40%、34%、28%、22%、16%和10%），完成剩余的不连续蔗糖梯度。使用移液器沿管壁小心加入每一层，以尽量减少相邻层之间的混合。总体积约为12.1 mL。</li>
		<li>在4 °C条件下，以100,000 g离心72小时。 
		&#8203;注意：对于长时间超速离心操作，请确认离心管、管盖和转子均适用于长时间高速运行，并遵循制造商推荐的平衡程序。</li>
		<li>用移液器从顶部收集每份样品的六个2 mL组分，分别转移至新的17 mL超速离心管中。</li>
		<li>将收集的各组分用约16 mL VIB缓冲液重悬，并在4 °C条件下以100,000 g离心1小时。</li>
		<li>弃去上清液，然后将每份沉淀用50 µL VIB缓冲液重悬。 
		&#8203;注意：EV沉淀不可见。应用移液枪头轻轻刮擦管底以助重悬。根据需要调整缓冲液体积（例如，高浓度时可使用10 µL）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 使用尺寸排阻色谱法（35 nm 柱）纯化细胞外囊泡（EVs）
<ol>
	<li>缓冲液配制与柱平衡
	<ol>
		<li>新鲜配制 VIB 及所有其他缓冲液。使用前通过 0.22 µm 滤膜过滤所有缓冲液，并在超声波水浴中脱气，以防止气泡形成和孔道堵塞。 
		&#8203;注意：脱气不完全或使用未过滤的缓冲液可能将气泡或颗粒物引入树脂床，导致流速异常并降低外泌体（EV）分离效率。若观察到柱中存在气泡，应停止运行并重新平衡柱。</li>
		<li>在移除柱帽前，使柱和缓冲液充分平衡至室温（18–24 °C）。 
		&#8203;注意：在移除柱帽前，柱和缓冲液必须完全平衡至室温。将室温缓冲液施加到低温柱上可能导致树脂内产生气泡，从而引起洗脱曲线畸变并降低重复性。</li>
		<li>将柱垂直放置，并小心移除柱顶部的帽盖。</li>
		<li>移除底部帽盖，使缓冲液完全从柱中排出。 
		&#8203;注意：在平衡前，应确保储存缓冲液已完全排出柱外。</li>
		<li>使用三倍柱体积（25.5 mL）的脱气 0.22 µm VIB 缓冲液冲洗柱，以完成柱的平衡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>EV 上样与样品收集
	<ol>
		<li>每次尺寸排阻层析（SEC）纯化使用 100 µg 总 EV 蛋白。上样前，用 VIB 将 EV 样品调整至终体积为 500 µL。</li>
		<li>将 500 µL EV 悬液直接加至柱顶部的上样筛板上。</li>
		<li>待样品完全进入树脂床后，再加入 VIB 缓冲液。在整个分离过程中保持柱流速连续，以确保基于尺寸的准确洗脱。 
		注意：分离过程中柱流速应始终保持连续。让柱干涸或长时间暂停流速会破坏基于尺寸的分离效果，可能导致组分重叠并降低 EV 富集度。</li>
		<li>待 EV 样品（500 µL）完全进入树脂床后，加入 2 mL VIB 并使其完全洗脱。此洗脱液对应于柱的死体积，应予以弃去。随后通过依次加入 400 µL VIB 并收集洗脱液的方式，连续收集组分 1–6，分别收集至 1.5 mL 微量离心管中。 
		&#8203;注意：死体积中不应含有 EV。根据使用 35 nm 柱的验证结果，EV 通常在组分 1–3 中被回收。如有需要，可通过纳米颗粒追踪分析（NTA）或针对 EV 标志物的免疫印迹检测死体积，以确认其中无 EV 存在。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>柱清洗与储存
	<ol>
		<li>在完成组分收集后，立即用一倍柱体积（8.5 mL）的 0.5 M NaOH 冲洗柱，以对树脂进行消毒。随后用 17 mL VIB 冲洗柱，以恢复中性 pH。此时柱即可用于下一个样品的上样。 
		&#8203;注意：仅用缓冲液冲洗不足以去除残留的蛋白质或囊泡。NaOH 清洗步骤对于防止样品间交叉污染至关重要，尤其是在进行下游核酸或 RNA 分析时。</li>
		<li>对于长期储存，在清洗后先用两倍柱体积的去离子水冲洗柱，再用两倍柱体积的 20% 乙醇冲洗以用于储存。盖上柱帽并垂直存放。 
		&#8203;注意：在乙醇储存前用去离子水冲洗柱可防止树脂床内盐结晶，从而保持柱性能。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 细胞外囊泡的验证、定量及大小/形态评估
<ol>
	<li>纳米颗粒追踪分析（NTA）
	<ol>
		<li>采用纳米颗粒追踪分析法（NTA）测定细胞外囊泡（EV）的粒径分布及颗粒浓度。</li>
		<li>将EV样本用无菌、0.2 µm滤膜过滤的VIB缓冲液按1:100比例稀释，使颗粒浓度处于最佳检测范围（约10⁷–10⁹ 颗粒/mL）。</li>
		<li>轻柔混匀稀释后的样本以避免产生气泡，并将其加载至配备532 nm激光器和高灵敏度sCMOS相机的仪器中。</li>
		<li>使用NS Xplorer软件进行数据采集与分析，检测阈值设为10 nm（最高至1000 nm），并采用基于动态观测体积的浓度计算算法。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>EV标志物的蛋白质印迹分析（Western blot）
	<ol>
		<li>进行蛋白质印迹分析时，将蔗糖梯度分离后获得的EV组分用50 µL VIB缓冲液洗涤并重悬。取每组分10 µL与SDS上样缓冲液混合，经变性后在12% Tris-甘氨酸凝胶中电泳分离，随后使用EV标志物TET8抗体进行免疫印迹。</li>
		<li>对于尺寸排阻色谱（SEC）获得的EV组分，首先使用100 kDa截留分子量的离心滤膜将每份400 µL组分浓缩至50 µL，然后取10 µL浓缩样本按上述方法进行蛋白质印迹分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>透射电子显微镜（TEM）观察
	<ol>
		<li>将5 µL悬浮于VIB缓冲液中的EV样本滴加至经辉光放电处理的300目碳支持膜Formvar铜网上，随后用滤纸吸除多余液体。</li>
		<li>接着用3 µL电子显微镜负染液对铜网进行负染，再次用滤纸吸除染液，室温晾干后使用300 kV透射电子显微镜成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在利益冲突。

植物细胞外囊泡（EVs）在植物免疫中发挥着关键作用，特别是在介导与真菌病原体的跨界通信方面32。越来越多的证据表明，植物会将EVs分泌到质外体中，通过递送小RNA（sRNAs）、mRNA和蛋白质来抑制入侵病原体的毒力，例如Botrytis cinerea、Rhizoctonia solani以及卵菌病原体Phytophthora capsici10,18,33。然而，由于植物组织结构复杂，并且存在大量细胞壁碎片和蛋白质聚集体等污染物，高纯度植物EVs的可重复分离在技术上仍具挑战性31。因此，建立标准化且可放大的方法以分离完整且具有功能活性的EVs，对于推动植物-微生物互作中EVs的研究至关重要。
本方案中有多个关键步骤，对于确保成功且可重复地分离出污...

细胞外囊泡（EVs）是由从细菌到人类等多种生物分泌的、具有脂质双分子层的膜性颗粒1,2。在动物系统中，EVs通常根据其生物发生途径和大小分为外泌体、微囊泡和凋亡小体3。外泌体（直径约30–150 nm）来源于多泡体（MVBs）与细胞膜的融合，从而释放腔内小泡4，而微囊泡（直径约100–1000 nm）则直接从细胞膜出芽形成5。除外泌体和微囊泡外，哺乳动物细胞还会在程序性细胞死亡过程中释放凋亡小体6。这些囊泡已被证实参与免疫调节、肿瘤进展及治疗递送，因而成为生物医学研究的热点7,8。在植物中，EV的分类尚不如动物中明确。Arabidopsis thaliana的研究已根据蛋白标志物、大小及推测的生物发生途径的差异，鉴定出多种植物EV亚型。这些亚型包括四跨膜蛋白（TET）阳性的EVs，被认为是来源于多泡体的类外泌体囊泡9,10，syntaxin蛋白PEN1（Penetration 1）阳性的EVs11，外泌复合体阳性细胞器（EXPO）来源的EVs12,13，以及其他EV群体，如与自噬相关的EVs14和花粉体（pollensomes）15。
越来越多的证据表明，植物会分泌细胞外囊泡（EVs），作为其抵御病原体的防御策略的一部分。植物EVs可递送多种分子货物，包括小RNA、mRNA以及其他调控分子，从而抑制真菌和卵菌病原体的毒力10,16,17,18,19。这些发现凸显了EVs作为“RNA战”&#34;RNA warfare&#34;载体的作用，使植物能够直接抑制病原体的基因表达，这一机制对作物保护具有深远意义20。除了免疫功能外，植物EVs还可能参与细胞壁重塑、应激反应以及发育信号传导21。与动物EV研究相比，后者已有广泛建立的标准分离与表征流程22，而植物EV领域仍处于发展初期。这限制了不同研究之间的可重复性和可比性，迫切需要建立可靠且标准化的方法来分离和研究这些囊泡。
分离植物细胞外囊泡（EVs）面临在动物系统中未曾遇到的独特技术挑战。受损的植物组织含有大量次生代谢物、细胞壁碎片以及细胞器片段，这些物质可能与EVs共同纯化，从而增加后续表征的复杂性23。此外，通常作为植物EVs分离与纯化起始材料的质外体洗脱液（AWF），往往产生囊泡与污染物的异质混合物24。尽管差速离心法仍是一种广泛使用的基础性方法，但它无法完全区分不同的EV亚群，也不能将EVs与共纯化的高分子复合物有效分离25,26。近年来的综述和方法学研究为植物EVs的分离与表征提供了重要的指导和最佳实践建议27,28,29,30,31。然而，这些方法的实际应用与整合仍具挑战性，通常需要额外的纯化步骤，如密度梯度离心和尺寸排阻色谱，以提高EVs的纯度和不同研究间的可重复性。
本文介绍了一种利用多步纯化策略从拟南芥（Arabidopsis）质外体洗脱液中分离细胞外囊泡（EVs）的简化实验方案。与常用的依赖真空泵对整株植物进行渗透的植物EV分离方法11相比，本方案避免了叶柄和维管组织的参与，从而减少了来自维管结构的污染。取而代之的是，采用分离的叶片并结合温和的注射器渗透法，以提高质外体液的收集效率，同时最大限度地减少组织损伤。通过谨慎的叶片操作、正确的叶片方向以及优化的离心条件，可进一步降低细胞内组分的污染，从而为EV的分离提供更纯净的起始材料。在完成差速离心后，可进一步采用蔗糖密度梯度分离或尺寸排阻色谱法对EV进行纯化，以获得更高的囊泡纯度和分离分辨率。所获得的EV样品适用于多种下游应用，包括RNA测序、蛋白质组学分析，以及病原体相互作用和EV摄取等功能性实验，从而提升植物EV研究的可重复性和结果的可解释性。

<table><tbody><tr><td>0.45 &amp;micro;m 尼龙滤膜</td><td>VWR</td><td>76479-032</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 无针注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa 超滤离心管</td><td>Amicon</td><td>UFC 910008</td><td></td></tr><tr><td>100 ml 无针注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>551721050</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 锥形管</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形管</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Arabidopsis thaliana (Col-0)&lt;/em&gt;</td><td>实验室保种品系</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>300目碳膜铜网</td><td>TED PELLA</td><td>01753-F</td><td></td></tr><tr><td>透明胶带</td><td>Scotch Magic Tape</td><td>S-9783</td><td></td></tr><tr><td>封口膜</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>PBS 缓冲液</td><td>实验室自制</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>qEV original column Gen2 35 nm</td><td>IZON Science</td><td>ICO-35</td><td></td></tr><tr><td>冷冻离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>冷冻离心机固定角转子</td><td>Eppendorf</td><td>F-34-6-38</td><td></td></tr><tr><td>冷冻离心机水平转子</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-62</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>VWR</td><td>470302-810</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>XPN-100</td><td></td></tr><tr><td>超速离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>337986</td><td></td></tr><tr><td>UranyLess 染色液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>250218-01</td><td></td></tr></tbody></table>

利用优化的质外体洗脱液收集方法从拟南芥叶片中分离和纯化植物胞外囊泡

Isolation and Purification of Plant Extracellular Vesicles from Arabidopsis Leaves Using an Optimized Apoplastic Wash Collection Method

细胞外囊泡（EVs）是由多种生物体和细胞类型分泌的膜结合纳米颗粒，现已被广泛认为是细胞间及跨物种通讯的重要介质。尽管在哺乳动物系统中EV的生物学研究已较为成熟，但植物EV的研究起步较晚，近年来正迅速发展，部分原因在于已有证据表明植物EV可递送参与免疫反应及植物-微生物互作的小RNA、mRNA、蛋白质及其他 cargo 分子。然而，由于植物具有坚硬的细胞壁、富含次生代谢物，以及在收集质外体液过程中易发生胞质污染，因此高纯度植物EV的分离在技术上仍具挑战性。本实验方案提供了一种从拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片组织中分离和纯化植物EV的简化流程。采用温和的注射器浸润步骤以最大限度减少细胞损伤和胞质泄漏，同时使用单个叶片（去除叶柄和维管组织）有助于降低维管相关成分及细胞内含物的污染。EV首先通过差速离心进行富集，随后可进一步采用蔗糖密度梯度分离或尺寸排阻色谱法（SEC）进行纯化。该方案通过纳米颗粒追踪分析和透射电子显微镜评估，证实所获得的EV具有良好的结构完整性，并因在质外体液收集过程中有效减少细胞损伤和胞质泄漏而显著降低了细胞污染。所得EV样品适用于多种下游应用，包括RNA谱型分析、蛋白质组学以及植物-微生物互作的功能性实验。总体而言，该方法为获取高质量植物EV提供了一种可重复且可灵活调整的技术路径。

为了评估优化后的离体液（AWF）采集方案是否能够减少组织损伤和胞质污染，我们直接比较了使用本方法（方法1）与基于全植株真空泵浸润的替代方法（方法2）所获得的AWF11。通过台盼蓝染色评估浸润后的细胞损伤，结果显示，采用方法1处理的叶片染色显著减少，表明细胞破裂程度较低（图3A）。为进一步评估所收集AWF中的胞质污染情况，检测了叶绿素含量以及叶绿体标记蛋白RBCL。使用方法1收集的AWF中叶绿素含量显著更低，RBCL信号也较使用替代方法获得的AWF明显减弱（图3B、C）。综上所述，这些结果表明，优化后的AWF采集方案可最大限度地减少细胞损伤和胞内物质泄漏，从而为后续细胞外囊泡的分离提供更纯净的起始材料。
为评估分离得到的细胞外囊泡（EVs）的浓度和粒径分布，采用纳米颗粒追踪分析（NTA）对样品进行了检测。如图4A所示，EV制剂...

本方案描述了一种优化的方法，用于从拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片中分离细胞外囊泡（EVs），以支持后续的分子和功能分析。

细胞外囊泡（EVs）是由多种生物体和细胞类型分泌的膜结合纳米颗粒，其重要性正日益受到关注……

我们的研究聚焦于植物细胞外囊泡及其在植物与微生物互作中的功能。目前植物细胞外囊泡研究领域的主要局限在于不同实验室采用的分离方法各异，导致结果不一致。本研究将提供一种标准化、可靠且可重复的实验流程，用于分离植物细胞外囊泡。首先，将拟南芥（Arabidopsis thaliana）植株的地上部分从土壤中剪下。在叶片基部进行切割，去除叶柄，收集叶片远端的叶肉区域。用反渗透水（RO水）清洗叶片三次。将叶片放在纸巾上，轻轻拍干。然后将叶片装入一支120毫升的注射器中，轻弹注射器使叶片沉降至50毫升刻度处。加入约60毫升的囊泡分离缓冲液（VIB），直至叶片完全浸没。轻轻推动柱塞以排出滞留的空气。用四层折叠的封口膜密封注射器尖端，防止泄漏。为浸润叶片，向外拉动柱塞以形成真空。现在将活塞保持在拉出位置5秒钟，然后缓慢释放。重复此过程两到三次，直至叶片颜色变深且呈现半透明状，表明浸润已成功。接下来，为收集质外体洗出液（AWF），建议协作进行后续步骤，以加快完成速度并尽量减少对叶片的损伤。在干净的表面上，剪下一段12英寸长的透明胶带，将粘性面朝上放置。将胶带的一端缠绕在一支空的1毫升无针注射器的宽口下方。将50至70片已浸润的叶片依次重叠放置在胶带上，叶片基部朝向注射器，叶尖向上。将用胶带固定的浸润叶片紧密地缠绕在注射器周围，顶部用两条胶带固定。将包裹好的注射器放入一个50毫升的锥形管中，使叶片的切端和注射器底部朝下。现在，将装有包裹注射器的锥形管放入配备固定角转子的预冷离心机中离心。随后，将上清液或无细胞伤口液（AWF）收集至新的15毫升锥形管中，并将样品置于冰上。使用水平转子，以标准加速度和减速度设置对无细胞伤口液（AWF）进行离心。为去除较大的细胞碎片，将上清液通过0.45微米尼龙细胞滤膜过滤至洁净并标记的离心管中。使用配备固定角转子的冷藏离心机对过滤后的上清液进行离心，采用标准的加速度和减速度设置。将上清液转移至17毫升超速离心管中，并在配备摆桶转子的超速离心机中离心样品。离心后，弃去上清液，并用约16毫升VIB缓冲液重悬沉淀。重复超速离心洗涤步骤，以收集细胞外囊泡（EVs）。弃去上清液后，用50微升VIB缓冲液轻轻刮取管底，以回收EV沉淀。将10%至90%的蔗糖梯度溶液保持在固定浓度，新鲜配制并随时可用。制备顶部加样不连续蔗糖梯度时，首先取一支洁净的17毫升超速离心管。使用移液器小心地将一毫升最高浓度的蔗糖溶液加入离心管底部。接下来，将一毫升较低浓度的蔗糖溶液轻轻叠加在第一层之上。继续依次叠加蔗糖浓度递减的溶液，但省略10%蔗糖溶液。最后，在超速离心管中加入1.1毫升预先配制的混合液（包含100微升EV和1毫升10%蔗糖溶液），作为最上层，使总体积约为12.1毫升。将上层加载的蔗糖梯度混合物在超速离心机中离心。超速离心后，用移液器从顶部逐层收集每个样品的两毫升组分，并将每份组分转移至新的17毫升超速离心管中。向每份组分中加入约16毫升VIB。将它们离心，并将每个沉淀重悬于50 µL VIB中。对于底部加样，小心地将1.1 mL预混液（包含100 µL EV和1 mL 90%蔗糖）加至17 mL超速离心管底部，形成不连续蔗糖梯度的第一层。接着，轻柔地将1 mL下一较低浓度的蔗糖溶液叠加在第一层之上。使用逐渐降低的蔗糖浓度继续进行分层。在制备好底部加样梯度后，按照顶部加样法所示的方法进行离心和组分收集步骤。新鲜配制VIB及所有其他附加缓冲液，并通过0.22微米滤膜过滤缓冲液。使用前将缓冲液置于超声波清洗仪中脱气。在室温下安装孔径为35纳米的凝胶过滤层析柱，并打开柱顶盖。然后取下柱底盖，使缓冲液从层析柱中流出。为平衡色谱柱，用三倍柱体积的VIB缓冲液冲洗色谱柱。然后将500微升经VIB缓冲液调整后的EV悬液直接加样至柱顶部的加样筛板上。等待其完全进入树脂床。现在加入 2 毫升 VIB，使其完全洗脱。弃去洗脱液后，加入 400 微升 VIB，并收集 400 微升洗脱液作为第一组分，置于 1.5 毫升微量离心管中。重复该步骤，共收集六个组分。采用本文所述优化方案制备的叶片，其细胞损伤程度低于现有方法。一致地，利用优化方案获得的细胞壁外流液（AWF）中叶绿素含量更低，叶绿体标记蛋白信号更弱，表明组织损伤和胞质污染程度较低。蔗糖密度梯度离心有效富集并纯化了细胞外囊泡（EVs）。细胞外囊泡主要在第四和第五组分中被检测到，其中第四组分的颗粒浓度最高。对第四组分进行的透射电子显微镜分析证实了存在预期大小的囊泡，并呈现典型的杯状形态。尺寸排阻色谱法有效纯化了植物来源的细胞外囊泡，并可用于纳米颗粒追踪分析。并且对所得组分进行透射电子显微镜分析，证实了具有典型杯状形态、大小符合预期的囊泡。本研究将为研究人员提供一种获取纯植物胞外囊泡的实验方案，可用于表征其携带的RNA、蛋白质、代谢物及其他分子 cargo。植物胞外囊泡领域的主要挑战在于如何获得不含细胞内成分污染的高纯度样品。这项工作将帮助研究人员获得纯净的植物细胞外囊泡，以进一步研究其在植物发育及植物与微生物相互作用中的功能。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

利用优化的胞质洗收集方法从拟南芥叶片中分离和纯化植物胞外囊泡

本视频展示了一种从14天龄拟南芥幼苗组织中分离完整原生质体的方法。由于所分离的原生质体至少可保持完整状态96小时，且来源于幼苗而非一个月大的成熟植株，因此该方法可加快需要完整原生质体的实验检测流程。...

从14天龄的Arabidopsis thaliana幼苗组织中分离原生质体

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使用基于注射器加压法提取质外体细菌

了解韧皮部汁液的组成及其装载和长距离运输的机制，对于理解植物发育以及胁迫/病原体响应中的长距离信号传导和同化物运输至关重要。本文描述了利用EDTA促进法收集韧皮部渗出物的方法。...

使用 EDTA 促进法收集和分析 Arabidopsis 韧皮部渗出物

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使用拟南芥莲座叶分离与分析叶表面及质外体RNA的逐步指南

学习从拟南芥叶片中分离和纯化植物胞外囊泡的标准化方法。该优化方案采用温和的注射器渗透和先进的密度梯度离心技术，可最大程度减少细胞质污染，获得高纯度囊泡样品，适用于植物微生物互作及囊泡货物分析等下游研究。

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