方法 原位 小鼠肌肉和终末施万细胞中线粒体形态的定量分析

本研究首次探讨了神经肌肉接头处终末施万细胞的线粒体形态。我们的方法能够对难以获取的组织（如毛细血管和淋巴管床）中的线粒体形态进行定量分析。首先，获取野生型小鼠和D2-mdx小鼠。

通过夹趾反射确认麻醉深度后，将针头从远端肌腱向右膝方向插入。在胫骨前肌（TA）内注射 50 微升浓度为 2 微摩尔的远红荧光线粒体染料，同时沿注射路径缓慢退出针头，并在活体内孵育染料 1 小时。在保持动物麻醉状态下，使用剪刀和镊子在实施安乐死前解剖并分离 TA 肌肉。

将分离的TA肌肉置于4%多聚甲醛中，室温下固定15分钟。随后，在体视显微镜下轻轻撕散纤维以分离肌纤维。向4%多聚甲醛中加入细胞通透性核酸染料，使其终浓度为每毫升5至10微克，用于细胞核标记。

随后，用 PBS 清洗 TA 肌肉组织三次，每次五分钟，以去除多余的染料。依次将肌肉组织置于 50%、75% 和 100% 的乙醇中脱水，每次五分钟。然后，将样品依次在组织透明溶液一和溶液二中各孵育 30 分钟，确保样品完全浸没。

将肌肉组织置于盖玻片上。使用一块尺寸为2.5 × 2 × 1厘米、重7.8克的玻璃块轻轻压平。获取一只S100 beta小鼠。

通过夹趾反射确认麻醉深度后，在臀大肌（GM）上方做一小段皮肤切口。在臀大肌下方注射 75 µL 的 2 µmol 浓度远红荧光线粒体染料。缝合伤口，孵育 45 分钟，以特异性标记终末施万细胞。

在动物保持麻醉状态下，10 分钟内解剖出 GM 肌肉，并立即置于预冷的 0.9% 无菌生理盐水中。仅在使用 D2-mdx 小鼠时，需在显微解剖液中加入荧光标记的乙酰胆碱受体染料，按 1:500 比例稀释，将组织在其中孵育 30 分钟。去除多余的脂肪和结缔组织，将 GM 肌肉转移至盖玻片上，腹侧朝下，用于倒置显微镜观察。

在GM背侧表面加入两微升普通封片剂，并用玻璃块压平组织，然后进行成像。在软件中，将激发波长设置为646纳米。加入两滴透明溶液二后，选择63倍物镜对TA肌肉进行成像，并将Z轴层扫深度设置接近100微米。

然后，选择去卷积模式，并应用系统优化的参数。将步进尺寸设置为1微米，并采集图像。为获取终末施万细胞的图像，选择20倍放大倍数的物镜镜头，将Z轴扫描深度设置为约17微米，并采集图像。

然后，选择63倍放大倍数的物镜，采集单个终末施万细胞的图像。将单个Z轴切片导入软件，以训练软件识别线粒体信号，并使用人工智能驱动的软件进行定量分析。

为研究人员审查生成图像掩膜。在算法优化后，将3D图像堆栈分离为单独的光学切片。从每个3D图像中选取每第五个Z切片，并计算每个样本的平均值。

对所有样本采用标准化的成像参数，并对线粒体形态进行定量分析。通过免疫组织化学染色和统计学分析，评估组间差异及相关性。与野生型小鼠相比，mdx 小鼠肌肉中的线粒体连接性降低。

在 mdx 小鼠中观察到更大量的小型线粒体碎片，以及更少的大型相互连接的线粒体网络。在野生型小鼠中，终末施万细胞内的线粒体在分支处附近呈现出相互连接的环状结构。相比之下，在 mdx 小鼠中，线粒体表现为碎片化，且在分支处附近缺乏环状结构的形成。

共聚焦显微镜和电子显微镜证实，在终末施万细胞中存在类似的环形线粒体结构。突触后分析显示，肌膜下线粒体聚集在乙酰胆碱受体周围，但缺乏典型的椒盐卷饼样结构。图像分析表明，与野生型肌肉相比，mdx 肌肉中终末施万细胞的线粒体面积增大且碎片化程度增加，而相对颗粒大小无显著差异。

肌肉力量测量显示，mdx 肌肉的收缩力减弱，变异性增大，且峰值力降低。在刺激频率逐渐增加的情况下，mdx 肌肉的力产生能力也显著下降。mdx 肌肉的纤维尺寸出现左移，表明其肌纤维直径较野生型约小 60%。

本方案使研究人员能够研究并量化骨骼肌和终末施万细胞中的线粒体形态。未来的研究可采用此方法来探究微循环和淋巴管中的线粒体形态。