一种使用关节滑膜炎的临床前模型 离体 具有保留功能与结构的人类滑膜组织

我们想回答的主要问题是，对于感染性和炎症刺激，本地滑膜的免疫反应是什么，以及这反映在滑膜结构的改变中吗？我的主要临床和研究重点是治疗病态肥胖患者的晚期RC关节炎。在这个患者群体中，由于他们难以找到疾病的外科治疗选择，往往会在医疗上被忽视。

首先，在手术室进行关节切开术和解剖。使用标准的内侧髌骨旁入路，并在对病态肥胖和晚期骨关节炎的患者进行手术时进行更广泛的暴露。识别前滑膜并使用电凝刀来解剖组织。

观察膝盖是否有炎症迹象，因为肥胖患者可能表现出与肥胖更广泛的炎症效应相关的局部炎症反应。以无菌方式将滑膜传递给研究团队成员。将装满冷的Dulbecco's PBS或DPBS的标本容器放在冰上，并将在全膝关节置换术期间获得的人类前滑膜组织转移到容器中。

在摇床上将组织在冷的DPBS中洗涤两次，每次10分钟。接下来，将滑膜转移到10厘米或更大的无菌培养皿下的生物安全2级柜内。加入冷的无菌低葡萄糖DMEM，含有丙酮酸钠和L-谷氨酰胺，使其充满盘子的一半。

通过珠光色的内膜层识别滑膜内衬，但不要剥离它。准备所需的工具以获得至少两个技术重复的三毫米活检核心。使用虹膜剪刀或手术刀，从烧焦的一侧解剖掉多余的脂肪和基质组织，以隔离滑膜，在整个过程中保持组织深度约为四到五毫米。

根据需要更换培养皿培养基以保持视野范围。将组织放置，使滑膜内衬面朝向取核工具。用非主导手用镊子或止血钳稳定组织，并通过施加坚定的垂直压力和轻微扭转来取核组织。

在使用大约10到15次后更换活检打孔器，或在取核时组织扭曲时更换，以避免损坏内膜内衬结构。打开第二个培养皿并用5到10毫升含有10%FBS的培养基填充，在37摄氏度下温和。用平坦的或无齿镊子将核心转移到盘中，轻轻摇动一到两秒钟以洗掉碎屑而不是紧紧捏住它们。

为了准备关节间隙分析系统的底部井，加入600微升含有10%FBS的低葡萄糖DMEM，在37摄氏度下温和。将车辆控制或选择的处理试剂，如LPS或MCP-1，添加到底部井中。根据所需的实验结果，选择transwell孔径大小，并将300微升含有10%FBS的低葡萄糖DMEM加入transwell。

使用无菌镊子，轻轻将单个组织核心转移到transwell的培养基中，避免毛茸茸和漂浮的核心。接下来，将组装体放在37摄氏度、5%碳酸钠的孵化器中，持续八到72小时，具体取决于将要进行的下游分析。用10%中性缓冲福尔马林固定滑膜组织。

然后将其嵌入并切片以进行组织学分析。在进行苏木精和伊红染色后，使用明场显微镜以10X和40X成像组织切片。使用Photoshop在40X TIFF图像中勾勒内膜内衬和下层区域，遮盖非目标区域、红细胞和大血管，以便后续的定量分析。

分析最终的掩膜以定量内膜内衬和下层厚度、完整性和细胞数。最后，通过流式细胞术评估迁移细胞，并通过酶联免疫吸附试验评估收集的培养基中的可溶因子。与对照相比，培养的MCP-1或LPS剂量增加的滑膜组织显示出不同的内膜内衬形态变化，包括易碎的内膜内衬和细胞密度降低的增厚内膜内衬。

MCP-1和LPS处理改变了滑膜细胞因子反应。MCP-1在下层诱导致病性成纤维细胞标志物podoplanin表达，而LPS在内膜内衬和下层中均增加了podoplanin。底部井中的迁移性免疫细胞包括中性粒细胞、NK细胞、NKT细胞、T细胞、B细胞或树突状细胞、单核细胞或巨噬细胞和M2巨噬细胞。

T细胞是最丰富的迁移性免疫细胞。从统计学上讲，基于底部井刺激，细胞迁移没有差异。骨保护蛋白，一种与关节炎相关的蛋白，在未处理的培养的关节炎滑膜中在24、48和72小时被检测到，并且在72小时比在24小时时显著更高。

内膜内衬中诱导型一氧化氮合酶的表达在0小时时在对照组中很高，但在24小时后几乎不存在。用N-乙酰半胱氨酸处理时，一氧化氮合酶的表达得以维持。相反，N-乙酰半胱氨酸并没有改变基质金属蛋白酶-9的表达，这是滑膜炎和潜在的软骨损伤的标志物。

该协议允许研究人员研究滑膜内膜和下层的改变，包括深度、细胞数和