Name: 利用体 外 人体滑液组织且功能和结构保存的前临床滑膜炎模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 了解利用JSAS模块化离体系统建立人滑膜组织模型的方法，用于研究关节炎中的急性滑膜反应。该模型保留三维组织结构，支持炎症因子检测和细胞迁移分析，为临床前类风湿研究提供生物学相关平台。

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本方案的实施离不开捐献组织样本的患者们的慷慨，以及我们骨科外科同事们的精湛技术，他们愿意为本研究安全地获取组织样本。K.I.C. 获得 NIAMS K08 AR084605 资助，C.P.P. 也获得支持。&#160;由退伍军人事务部职业发展计划 [IK2BX004532] 提供支持。本研究团队感谢爱荷华大学中央显微镜研究设施的使用支持，该核心资源由爱荷华大学研究副校长办公室及卡弗医学院提供资助。流式细胞术数据在流式细胞术设施中获得，该设施为爱荷华大学卡弗医学院/霍尔登综合癌症中心的核心研究设施。该设施的资金来源于用户费用，以及卡弗医学院、霍尔登综合癌症中心和爱荷华市退伍军人事务医疗中心的慷慨财政支持。本出版物所报告的研究获得以下机构资助：美国国立卫生研究院研究资源中心，资助编号 1 S10 OD034193-01；美国国立卫生研究院国家癌症研究所，资助编号 P30CA086862。

患者知情同意及组织处理方案已获当地机构审查委员会（IRB）批准。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 组织获取与活检
<ol>
	<li>根据外科医生的手术安排，在术前确定患者。招募年龄在18至65岁之间、拟接受开放性关节手术（如全膝关节置换术（TKA）或胫骨结节截骨术（TTO，也称为Fulkerson手术））且未使用全身性免疫调节药物的患者。 
	注意：理想情况下，应排除接受过一次以上关节镜手术或接受过一次以上糖皮质激素注射的患者，因为这些患者由于纤维化，术中组织获取失败率高于其他人群。鉴于感染传播风险，除非与研究结局相关，否则应暂缓招募有丙型肝炎或人类免疫缺陷病毒（HIV）感染史的患者。无论传染病状态如何，始终对新鲜人体组织采取安全操作规范。</li>
	<li>骨科医生按照标准操作程序进行关节切开和解剖。识别位于滑车沟近端前方的滑膜组织，使用电凝设备整块切除滑膜，避免解剖股内侧肌或靠近内、外侧髁区域。滑膜切除术对TKA的手术结局影响中性，在炎症状态下可能具有益处9,10。将滑膜无菌转移至研究团队成员，并置于含冷的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）的无菌标本容器中，置于冰上。 
	注意：若手术团队发现组织异常，或滑膜切除可能影响伤口闭合或手术结局，则应终止组织获取。后者在TKA中尤为罕见，因为滑膜切除可作为延长性操作用于松解僵硬关节。切除组织的数量取决于实验规模。每1 cm2组织可获得约四个直径3 mm的活检组织芯。在许多情况下，可获取24 cm2或更多的组织。组织重量高度依赖于手术解剖方式，因此在判断实验组织是否充足时，表面积比重量更可靠。图1展示了步骤1.2–1.7。</li>
	<li>将滑膜组织带回实验室，在冷的DPBS中于摇板仪上洗涤两次，每次10分钟。</li>
	<li>在生物安全二级（BSL2）认证的生物安全柜内，无菌条件下将滑膜转移至直径10 cm或更大的无菌培养皿中。加入足够量的冷的、无菌的低糖杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），其中含丙酮酸钠和L-谷氨酰胺，加至培养皿半满。通过珍珠样光泽的滑膜衬里层（IntL）识别滑膜表面（图2A），而非电凝侧（图2B）。 
	注意：IntL较为脆弱，操作时应避免剥离，否则其将从下层组织分离（图2A，图中由止血钳夹持）。既往有血性关节积液史（因含铁血黄素呈黄橙色）、高BMI（被脂肪组织覆盖）或炎症（呈红色、易碎、绒毛状）的患者，其珍珠样光泽可能改变。在继续操作前，准确识别IntL至关重要。应仔细检查是否存在手术切除、电凝、出血或凝固等迹象，以确保后续操作未在IntL上进行。</li>
	<li>在电凝侧去除多余的脂肪和基质组织，以分离滑膜组织，各区域保留约4–5 mm的组织厚度。可根据个人偏好使用虹膜剪或手术刀。根据需要更换培养皿中的培养基，以保持视野清晰。 
	注意：后方的基质或脂肪组织易于切除。若解剖困难或阻力较大，可能提示残留韧带、组织化生（如异常软骨沉积）或已切穿IntL。</li>
	<li>解剖至适当深度后，根据需要获取直径3 mm的活检组织芯，每种检测条件至少保留2个技术重复样本。操作时应使滑膜衬里面向取芯工具，而非紧贴培养皿表面。高质量的活检打孔器在变钝前可使用约10–15次；钝化的打孔器将导致衬里层结构损伤。
	<ol>
		<li>取芯时施加有力的垂直压力并轻微扭转。若组织随之旋转，则表明打孔器已变钝，需更换。使用镊子或止血钳以非优势手固定组织。 
		注意：采用3 mm组织芯旨在最大化组织灌注效率、每位患者可获取的组织芯数量，并确保本实验具备足够的技术重复。可使用其他尺寸的组织芯，但本方案仅验证了3 mm规格。 
		注意：若因解剖不充分而残留过多脂肪组织，可能导致组织芯在JSAS中漂浮，此情况不理想。若组织芯浮至液面而非保持浸没状态，应返回重新解剖或选择已浸没的组织芯。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打开第二个培养皿，加入5–10 mL预热（37 °C）的含10%胎牛血清（FBS）的培养基。使用平头或无齿镊子将组织芯转移至该培养皿中，通过1–2秒的轻柔机械震荡清洗去除碎片。切勿用力夹捏组织芯，以免损伤衬里层。 
	注意：可在此处暂停操作，最长不超过24小时，将组织芯置于标准条件（37 °C、5% CO2）的培养箱中保存。</li>
</ol>
2. 关节间隙分析系统（JSAS）的设置
<ol>
	<li>在JSAS的下层孔中加入600 µL预热（37 °C）的低糖DMEM培养基，含10% FBS。尽管在此系统中已测试添加1%青霉素-链霉素，未观察到明显不良影响，但如果无菌条件已得到充分维持，则通常不在培养基中添加抗生素。 
	注意：若与细菌或需要不同培养基的细胞系共培养，下层孔可使用不同的培养基。与细菌共培养时，应避免使用含抗生素的培养基。</li>
	<li>向下层孔中加入所需处理因素，例如脂多糖（LPS）。为避免渗透压差异，建议处理物的体积不超过总体积的2.5%（例如，600 µL时不超过15 µL）。若处理因素引起pH变化，应使用缓冲液调节以维持pH在7.0–7.4之间；否则应使用溶剂对照。</li>
	<li>根据预期实验结果选择合适的Transwell孔径（图3）。</li>
	<li>向Transwell中加入300 µL含10% FBS的低糖DMEM培养基。</li>
	<li>用无菌镊子将组织芯轻轻转移至Transwell的培养基中。组织的方向无法人为控制；但由于间质组织的脂肪含量及其天然浮力，大多数组织芯会自然使内膜层朝下。
	<ol>
		<li>应仔细观察组织芯，因为取芯过程可能破坏内膜层，避免在实验开始时使用边缘松散或破损的组织芯。若组织芯漂浮，应改进解剖操作并更换其他组织芯。 
		注意：若组织方向至关重要，可考虑使用胶原基质；但此举将影响与下层孔之间形成化学梯度所需的时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将装置置于37 °C、5% CO2的培养箱中，孵育所需时间。 
	注意：建议检测生物学变化的最早时间点为8小时；经验证的生物学活性最晚时间点为3天。</li>
</ol>
3. 实验拆解与分析
<ol>
	<li>进行组织学分析时，使用无菌无齿镊子将组织转移至 3–5 mL 的 10% 中性缓冲福尔马林（NBF）中，用于福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）分析。在包埋和切片前，将组织在 NBF 中保存 3–7 天。
	<ol>
		<li>避免组织&#160;长时间放置，否则会加重自发荧光。根据标准方法进行组织学分析，包括苏木精和伊红（H&amp;#38;E）11染色用于组织形态计量学分析、免疫荧光（IF）12和/或与 IF 结合的 RNAscope13。 
		注意：取出组织时，注意不要用镊子刺穿 transwell。转移组织核心时务必极其轻柔，否则内膜层可能解离。将组织核心轻轻放入固定液中，不要搅动。NBF 必须在经认证的化学通风橱内使用，废弃时需遵循当地环境健康与安全（EHS）指南，不得倒入水槽。实验中剩余的人体组织应置于过量 10% 漂白液中 30 分钟，然后按照当地 EHS 要求放入二级密闭容器，再投入标有生物危害标识的垃圾桶进行焚烧处理。若经当地 EHS 批准，漂白液可倒入水槽。请遵循当地指南，不同机构的规定可能有所不同。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将技术重复样本包埋于同一 FFPE 区块中。使用带筛孔的包埋盒以避免样本丢失。沿纵向轴切片，厚度为 5 µm。将三个连续切片置于同一张载玻片上（补充图 1）。</li>
	<li>使用明场显微镜在 10x 和 40x 下对 H&amp;#38;E 染色切片进行成像。将内膜层（IntL）识别为组织与空腔之间界面处排列有序的细胞层。
	<ol>
		<li>在每种处理条件下，至少对两个技术重复样本获取 3 张具有代表性的 10x 图像和 10 张具有代表性的 40x 图像，确保内膜层位于视野中。以高分辨率 TIFF 格式保存图像，并进行组织形态计量学分析：</li>
		<li>在 ImageJ/FIJI 中进行测量。首先，使用 分析菜单 → 设置比例尺 设置比例尺。设置比例尺需使用在每台显微镜各物镜下拍摄的校准切片图像。首先使用直线工具，根据校准切片图像绘制一条已知长度的线段，然后全局设定比例尺。 
		注意：在 10x 下，比例尺为 3 像素/µm；在 40x 下，比例尺为 12 像素/µm。</li>
		<li>使用 10x 图像和直线工具测量 SubL 厚度。将厚度定义为从 IntL 表面到底部 SubL 的垂直深度（µm）。每绘制一条线后，使用键盘快捷键 m 测量线段长度。
		<ol>
			<li>对每张 10x 图像至少测量 5 次并取平均值（图 4A、B）。SubL 与基质组织之间的过渡区域表现为结构较松散、细胞密度较低，含有胶原和脂肪组织（图 4B）。将组织区室间的过渡点平分。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对于 40x 图像中 IntL 厚度、IntL 细胞密度、IntL 完整性以及 SubL 细胞密度的测量，首先在 Adobe Photoshop（或任何类似图像编辑软件）中打开 40x TIFF 图像。IntL 定义为约 1–5 个细胞厚度、在组织与空腔（如滑液）界面处排列成明显细胞层的结构（图 4C）。</li>
		<li>创建一个新图层。选择 多边形套索 工具。通过鼠标点击启动套索并锚定线条转折点，沿整张图像将 IntL 与 SubL 之间的过渡区域平分。然后，继续将套索延伸至 IntL 外侧的空腔区域。
		<ol>
			<li>双击闭合套索。反选选区（选择 → 反向），然后使用 油漆桶 工具将非 IntL 区域填充为黑色。将此图像另存为高分辨率 JPG 文件以表示 IntL，然后隐藏该图层。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>创建一个新图层。在多边形套索设置中，选择 交集 功能，使新套索区域仅与旧套索区域相交。通过点击 IntL 中部，绕过图像左右边缘进入背景画布，再将 SubL 与其后无细胞组织之间的过渡区域平分，从而套选 SubL。
		<ol>
			<li>若 SubL 底部超出 40x 图像范围，则简单选择剩余边缘周围的背景画布。再次反选该区域，然后使用 油漆桶 工具填充黑色。将此图像另存为高分辨率&#160;JPG 文件以表示 SubL。将此分层图像另存为 PSD 格式以供将来参考。 
			注意：红细胞在这些切片中常见，可能干扰后续细胞计数。若存在大面积血管结构，可使用多边形套索工具、画笔工具或其他合适工具在独立图层上创建遮罩覆盖这些区域。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在 FIJI 中打开 IntL 遮罩&#160;图像。使用直线工具在 40x 图像上至少测量 5 次并取平均值，测量 IntL 厚度（µm），方法同步骤 3.3.2–3.3.3。</li>
		<li>使用折线工具测量 IntL 的总长度（µm），再使用折线工具仅测量完整区域的长度（图 4D、E）。不完整的 IntL 区段表现为细胞间出现间隙、呈虫蚀样外观，或从组织上断裂、剥落。
		<ol>
			<li>计算完整 IntL 边界的百分比，公式为（完整 IntL / 总 IntL）×100。必须与相同时间点的对照组比较，以校正任何切片伪影。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用 IntL 遮罩图像测量 IntL 的细胞密度。首先转换为 8 位图像（图像 → 类型 → 8 位）。然后进行阈值处理&#160;（图像 → 阈值），以最小化噪声并最大化细胞识别。在阈值菜单中，取消选择 暗背景，并使用底部滑块进行调整。
		<ol>
			<li>根据图像手动确定阈值，参考标准为噪声（如背景伪影）消失的同时保留原始核体数量。频繁与原始图像对比以保持保真度。当噪声最小化（假阳性）且苏木精信号最大化（真实核阳性）时，即可设定阈值（补充图 2）。 
			注意：同一张切片扫描图像内的阈值应保持一致，但在不同切片扫描图像之间、以及任意单个 10x 或 40x 图像之间均可能不同。此外，不同批次的 H&amp;#38;E 染色之间也会不同，因为染色深度难以保持一致。因此，若图像在以下任一类别中存在差异，则简单的宏命令不适用：患者、H&amp;#38;E 染色批次、切片厚度、光照条件（房间或显微镜光源亮度/色温）、图像采集软件、图像采集显微镜、是否使用白平衡或色彩校正算法。此列表并非详尽。使用 AmScope T390B-3M 显微镜配合兼容相机和软件，在昏暗房间中以最大显微镜光源亮度并启用自动白平衡设置，对涵盖 3 名患者的 10 张随机 40x 图像进行分析，阈值范围为 96–182，平均值为 137。该广泛范围反映了底层 8 位直方图的差异，而非操作者不一致。因此，确保原始图像与阈值图像之间的视觉保真度至关重要，而非阈值的具体数值。自动化此过程超出了典型实验科学家的能力范围，需由图像分析专业人员进行编程实现。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用“分析颗粒”功能（分析 → 分析颗粒），设定细胞大小为 8–150 µm2，识别并计数细胞核作为细胞数量的替代指标。在设置中选择 叠加遮罩 以可视化已识别细胞，并再次与原始图像对比。由于 IntL 主要为线性而非体积性结构，需将细胞数标准化为每 100 µm IntL 长度（例如，#细胞/100 µm）。在新鲜获取的滑膜组织中，平均每 100 µm 约有 13.19 个细胞（范围 5.4–21.9，标准差 3.9）。 
		注意：8–150 µm2 的范围是基于 设置比例尺 及对阈值图像与原始图像的迭代视觉比较确定的。该经验确定的界限对应于基于巨噬细胞直径约为 8–20 µm14,15 的形态假设。排除更大尺寸，因为这通常代表多个紧密相邻的独立细胞核被识别为单个细胞。 
		注意：类似工作流程也可在例如 QuPath 软件中建立。</li>
		<li>打开已排除红细胞的 SubL 遮罩图像（图 4G）。按照步骤 3.3.9–10 所述进行 8 位转换、阈值处理和颗粒分析。由于 SubL 为体积性层状结构，需将细胞计数结果标准化为每 100 µm2 SubL 面积（例如，非遮罩区域的测量值）（图 4H）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于底部小室中迁移细胞的流式细胞术分析，以 300 x g 在 4 °C 下离心 10 分钟，并将细胞沉淀置于冰上。预计每 3 mm 活检组织核心在 24 小时后可获得约 20,000 个活的迁移细胞。流式细胞术方法此前已有发表8。</li>
	<li>进行 ELISA 时，将培养基在 4 °C 下以最大速度（&#62;5000 x g）离心 5 分钟，以沉淀任何细胞或细胞碎片。按需储存于适当温度。ELISA 方法此前已有发表8。</li>
</ol>

不存在利益冲突。

本研究展示了关节滑膜组织培养系统（JSAS）的功能，特别是维持具有完整且功能可响应的关节滑膜结构的活体滑膜组织的能力。在大多数培养条件下，培养长达72小时后细胞死亡极少。为了评估滑膜结构的显微变化，本文描述了一种独特的组织学测量系统，用于量化滑膜表层（IntL）和滑膜下层（SubL）的结构改变。此类改变提示急性或慢性基础上的急性滑膜炎。当该量化方法与细胞水平和机制性分析相结合时，可能具有特别优势，因为传统分类系统依赖于淋巴细胞浸润及较长的时间进程50。在近五十例患者中，不同组织间的组织形态计量学结果与ELISA结果具有一致性，无需对数据进行归一化处理即可比较患者间差异。除了可重复的组织形态计量分析外，JSAS还适用于免疫组织化学、流式细胞术和ELISA检测。本文未进行但显然具有应用价值的技术还包括：大量qPCR检测、将滑膜组织经酶消化制备为单细胞悬液后的流式细胞术分析、单细胞RNA测序以及空间转录组学。如果实验室已掌握从手术室招募患者并无菌获取组织的技术，JSAS还具有极高的成本效益。因此，主要费用仅限于试剂、常规实验设备和解剖工具。
<p class="jove_content"...

关节炎影响了超过20%的美国成年人以及50%年龄超过65岁的慢性病患者1。它也是全球范围内导致残疾的主要原因之一2。关节炎不仅包括软骨损伤，还涉及关节囊或滑膜的炎症（例如滑膜炎）。慢性滑膜炎可能是骨和软骨损伤过程中促炎性细胞因子的重要来源，在骨关节炎和类风湿关节炎中起着加剧作用3,4。因此，了解滑膜内由免疫介导的变化，对于开发针对关节炎患者的新疗法甚至预防策略可能至关重要。
滑膜是一种由两层主要结构组成的有序组织：细胞化的表层（IntL）和衬层下层（SubL）。IntL 与滑液（SF）相接触，而 SubL 则生成滑液成分并含有血管结构5。在 IntL 中，存在巨噬细胞和成纤维细胞样滑膜细胞（FLS）。IntL 中的巨噬细胞为定居细胞，由 SubL 内的间质巨噬细胞局部更新而来6。这些定居滑膜巨噬细胞（RSMs）表现为 M2 型极化，表达 CD206 和 TREM2，具有上皮样形态，并表达紧密连接标志物。IntL 的这一亚结构可能在功能上和结构上对维持关节腔稳态起关键作用5,6。这一现象已在类风湿关节炎（RA）中被观察到。例如，当 IntL 结构破坏时，类风湿关节炎患者会出现疾病发作症状，而当表层重建后症状随之缓解6,7。自发性 RA 缓解特别与 MerTK+CD206+ 滑膜巨噬细胞相关7。在急性关节疼痛患者的滑液（SF）中也鉴定出了 RSMs，发现感染性或炎症性疾病的严重程度与 RSMs 数量及炎症性细胞因子水平呈正相关8。然而，IntL 与 SubL 结构之间的关系、RSMs 与 FLS 的功能改变，以及炎症介质的产生如何进一步导致软骨和/或骨组织损伤等问题仍难以探究，尤其是在人体中。 
为了探究多种临床相关情况下滑膜炎的潜在机制，研究人员开发了一种名为关节腔分析系统（Joint Space Analysis System, JSAS）的人体离体（ex vivo）模型。该系统具有模块化设计，可重复性好，适用于对炎症性关节炎和感染性关节炎进行广泛评估。本文描述了从常见的开放性关节手术（如全关节置换术）中获取组织的过程、JSAS的设计方案、用于量化滑膜急性结构改变所必需的组织形态计量学分析方法，以及组织功能反应的检测方法，包括免疫荧光（IF）、RNAscope 和酶联免疫吸附测定（ELISA）。与常见的人体体外（in vitro）模型不同，JSAS 能够保留滑膜的间质层（IntL）和下层（SubL）结构，从而提供接近体内（in vivo）环境的急性或慢性基础上急性发作的滑膜炎导致软骨损伤的深入见解。通过维持滑膜的天然结构，可以解析滑膜巨噬细胞（RSM）和滑膜成纤维细胞（FLS）在抑制或持续炎症反应中的内在能力。作为一种离体（ex vivo）模型，JSAS 无需将外周免疫细胞分化为滑膜巨噬细胞，也避免了将滑膜简化为仅1-2种独立细胞类型的过度简化。与胶原诱导性关节炎（Collagen Induced Arthritis, CIA）等动物模型相比，JSAS 使用天然患病的人体组织，能够实现具有人类相关性的病原体特异性评估。此外，该模型还可模拟多种感染，从而不仅可用于骨关节炎和炎症性关节炎的研究，还可用于化脓性关节炎的建模。其主要局限性在于，在标准培养条件下，组织仅能维持3天，随后即开始发生凋亡。

<table><tbody><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>Corning</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>23srRNA RNAscope 探针</td><td>ACD/Biotechne</td><td>468211</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Life Sciences</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>3 mm 活检打孔器</td><td>Integra</td><td>12460406</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形离心管</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇（用于消毒）</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Borrelia burgdorferi&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td>35210&amp;nbsp;</td><td>必须在对数生长后期使用以获得最大致病性</td></tr><tr><td>BSK-H 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8291</td><td></td></tr><tr><td>CD68 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>14-0688-82</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 气体罐（标准条件）</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco 磷酸盐缓冲液（不含 Ca²⁺/Mg²⁺）</td><td>Thermofisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Biotechne</td><td>S11150</td><td>热灭活批次：F22100</td></tr><tr><td>镊子（无齿）</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>止血钳</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加湿细胞培养箱（标准条件）</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>低氧培养箱</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>低氧气体罐（5% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，其余为 N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，生理条件）</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-4 抗体</td><td>Thermofisher</td><td>MA5-42470</td><td>1:100</td></tr><tr><td>iNOS 抗体</td><td>Thermofisher</td><td>PA1-036</td><td>1:100</td></tr><tr><td>眼科剪刀</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>脂多糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>低糖 DMEM（含丙酮酸钠、L-谷氨酰胺）</td><td>Life Technologies</td><td>11885084</td><td></td></tr><tr><td>MMP9 抗体</td><td>Thermofisher</td><td>MA5-32705</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>模块化培养室（高氧条件）</td><td>Emrbient, Inc</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>单核细胞趋化蛋白 1</td><td>Peptrotech</td><td>300-04-20UG</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>每次实验必须新鲜配制，并用等摩尔碳酸氢钠缓冲至 pH 7–7.4</td></tr><tr><td>OPG ELISA 试剂盒</td><td>Millipore</td><td>RAB0484</td><td>1:1 稀释</td></tr><tr><td>带每分钟升流量调节器的氧气罐</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDPN 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>14-9381-82</td><td>1:100</td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Thermofisher</td><td>J66764.MC</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 多重荧光 V2 检测试剂盒</td><td>ACD/Biotechne</td><td>323100</td><td></td></tr><tr><td>sRANKL ELISA 试剂盒</td><td>MyBioSource</td><td>MBS262624</td><td>1:1 稀释</td></tr><tr><td>金黄色葡萄球菌 USA 300 耐甲氧西林菌株（MRSA）</td><td>ATCC</td><td>BAA-1717</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Thermofisher</td><td>S7563</td><td>10,000X 储存液</td></tr><tr><td>TNF 抗体</td><td>Thermofisher</td><td>PA5-19810</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Transwell 小室 - 0.4 μm 孔径</td><td>Millicell</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Transwell 小室 - 5 μm 孔径</td><td>Corning</td><td>CLS3421</td><td></td></tr></tbody></table>

一种使用关节滑膜炎的临床前模型 离体 具有保留功能与结构的人类滑膜组织

A Pre-Clinical Model of Synovitis Using Ex vivo Human Synovial Tissue with Preserved Function and Architecture

关节炎是一种累及关节的炎症状态，可导致软骨损伤、疼痛及活动能力丧失。近期关节炎研究进展明确表明，关节囊（例如滑膜）是此类炎症的重要来源，但目前尚无能够复制关键滑膜结构的人体模型。为解决这一问题，研究人员开发了关节腔分析系统（Joint Space Analysis System, JSAS）。在患者接受全膝关节置换术（TKA）过程中，术中获取其前部滑膜组织。将滑膜组织解剖并切割成直径3 mm的活检组织芯。将组织芯置于Transwell上室，加入300 µl含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，Transwell孔径为5 µm或0.4 µm。在下室中加入600 µL培养基，并每2–3天更换一次。在高氧（50%）、大气/标准（约21%）和生理氧（5%）三种培养条件下，评估组织活力达7天。下室中添加的刺激物包括单核细胞趋化蛋白1（MCP-1/CCL2）、脂多糖（LPS）、N-乙酰半胱氨酸、S. aureus 和 B. burgdorferi。培养基用于ELISA检测，组织则保存用于甲醛固定石蜡包埋（FFPE）分析。在标准培养条件下，滑膜组织可维持完全活力达3天。刺激物可改变滑膜衬里层及衬下层细胞的结构与功能，包括固有巨噬细胞边界消失、衬下层扩张、致病性成纤维细胞上调，以及白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNFα）的产生。通过流式细胞术分析发现，免疫细胞和成纤维细胞可迁移至下室（5 µm孔径）。具有运动能力的 B. burgdorferi 可穿过0.4 µm孔径进入组织，而非运动型的 S. aureus 则不能。相关细胞因子表达量足以进行ELISA检测。JSAS是一种模块化系统，可用于研究人类滑膜的急性改变，在维持生物学相关结构与功能的同时，为临床前模型中复杂的三维结构研究提供了可能。

优化氧气培养条件
生理状态下的组织灌注氧浓度约为6%-8%，而细胞培养的标准培养条件通常处于大气氧浓度（约21%）16。相比之下，高氧环境可能提高细胞培养的存活率，也可能产生毒性作用17。为了充分有效地利用JSAS，需尽早确定滑膜组织的存活能力；因此，在三种氧浓度条件下（生理氧浓度（5% O2）、大气/标准氧浓度（21% O2）和高氧浓度（50% O2）），于第0、1、2、3、5和7天通过caspase-3免疫组织化学或免疫荧光法评估细胞凋亡情况。在标准培养条件下，细胞凋亡从第3天开始，并在第5天达到峰值。在高氧和低氧条件下，细胞凋亡在第1-2天即可观察到，并于第5天达到高峰。因此，后续实验选择标准培养条件（图5）。然而，根据具体研究需求，也可采用其他氧浓度条件，因为在第1和第2天的细胞凋亡水平与第0天相比仍保持相对稳定。...

我们开发了一种人源ex vivo transwell系统，可用于评估滑膜的急性炎症、感染及结构变化。

关节炎是一种关节内的炎症状态，可导致软骨损伤、疼痛和活动能力丧失。近年来，关节炎研究取得了新进展……

我们想回答的主要问题是，对于感染性和炎症刺激，本地滑膜的免疫反应是什么，以及这反映在滑膜结构的改变中吗？我的主要临床和研究重点是治疗病态肥胖患者的晚期RC关节炎。在这个患者群体中，由于他们难以找到疾病的外科治疗选择，往往会在医疗上被忽视。首先，在手术室进行关节切开术和解剖。使用标准的内侧髌骨旁入路，并在对病态肥胖和晚期骨关节炎的患者进行手术时进行更广泛的暴露。识别前滑膜并使用电凝刀来解剖组织。观察膝盖是否有炎症迹象，因为肥胖患者可能表现出与肥胖更广泛的炎症效应相关的局部炎症反应。以无菌方式将滑膜传递给研究团队成员。将装满冷的Dulbecco's PBS或DPBS的标本容器放在冰上，并将在全膝关节置换术期间获得的人类前滑膜组织转移到容器中。在摇床上将组织在冷的DPBS中洗涤两次，每次10分钟。接下来，将滑膜转移到10厘米或更大的无菌培养皿下的生物安全2级柜内。加入冷的无菌低葡萄糖DMEM，含有丙酮酸钠和L-谷氨酰胺，使其充满盘子的一半。通过珠光色的内膜层识别滑膜内衬，但不要剥离它。准备所需的工具以获得至少两个技术重复的三毫米活检核心。使用虹膜剪刀或手术刀，从烧焦的一侧解剖掉多余的脂肪和基质组织，以隔离滑膜，在整个过程中保持组织深度约为四到五毫米。根据需要更换培养皿培养基以保持视野范围。将组织放置，使滑膜内衬面朝向取核工具。用非主导手用镊子或止血钳稳定组织，并通过施加坚定的垂直压力和轻微扭转来取核组织。在使用大约10到15次后更换活检打孔器，或在取核时组织扭曲时更换，以避免损坏内膜内衬结构。打开第二个培养皿并用5到10毫升含有10%FBS的培养基填充，在37摄氏度下温和。用平坦的或无齿镊子将核心转移到盘中，轻轻摇动一到两秒钟以洗掉碎屑而不是紧紧捏住它们。为了准备关节间隙分析系统的底部井，加入600微升含有10%FBS的低葡萄糖DMEM，在37摄氏度下温和。将车辆控制或选择的处理试剂，如LPS或MCP-1，添加到底部井中。根据所需的实验结果，选择transwell孔径大小，并将300微升含有10%FBS的低葡萄糖DMEM加入transwell。使用无菌镊子，轻轻将单个组织核心转移到transwell的培养基中，避免毛茸茸和漂浮的核心。接下来，将组装体放在37摄氏度、5%碳酸钠的孵化器中，持续八到72小时，具体取决于将要进行的下游分析。用10%中性缓冲福尔马林固定滑膜组织。然后将其嵌入并切片以进行组织学分析。在进行苏木精和伊红染色后，使用明场显微镜以10X和40X成像组织切片。使用Photoshop在40X TIFF图像中勾勒内膜内衬和下层区域，遮盖非目标区域、红细胞和大血管，以便后续的定量分析。分析最终的掩膜以定量内膜内衬和下层厚度、完整性和细胞数。最后，通过流式细胞术评估迁移细胞，并通过酶联免疫吸附试验评估收集的培养基中的可溶因子。与对照相比，培养的MCP-1或LPS剂量增加的滑膜组织显示出不同的内膜内衬形态变化，包括易碎的内膜内衬和细胞密度降低的增厚内膜内衬。MCP-1和LPS处理改变了滑膜细胞因子反应。MCP-1在下层诱导致病性成纤维细胞标志物podoplanin表达，而LPS在内膜内衬和下层中均增加了podoplanin。底部井中的迁移性免疫细胞包括中性粒细胞、NK细胞、NKT细胞、T细胞、B细胞或树突状细胞、单核细胞或巨噬细胞和M2巨噬细胞。T细胞是最丰富的迁移性免疫细胞。从统计学上讲，基于底部井刺激，细胞迁移没有差异。骨保护蛋白，一种与关节炎相关的蛋白，在未处理的培养的关节炎滑膜中在24、48和72小时被检测到，并且在72小时比在24小时时显著更高。内膜内衬中诱导型一氧化氮合酶的表达在0小时时在对照组中很高，但在24小时后几乎不存在。用N-乙酰半胱氨酸处理时，一氧化氮合酶的表达得以维持。相反，N-乙酰半胱氨酸并没有改变基质金属蛋白酶-9的表达，这是滑膜炎和潜在的软骨损伤的标志物。该协议允许研究人员研究滑膜内膜和下层的改变，包括深度、细胞数和

a-pre-clinical-model-synovitis-using-ex-vivo-human-synovial-tissue

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

利用体 外 人体滑液组织且功能和结构保存的前临床滑膜炎模型

我们提出一种方法，用于评估在施加可控机械负荷或冲击后，完整小鼠关节关节面上细胞损伤/死亡的空间范围。该方法可用于研究骨关节炎、遗传因素和/或不同加载方案如何影响关节组织的易损性 原位...

实时可视化与分析机械负荷对完整小鼠软骨外植体中软骨细胞损伤的影响

本文介绍了一种从牛膝关节中分离和培养软骨外植体的实验方案。该方法提供了一种简便且易于获取的工具，可用于描述组织在生物刺激或靶向关节的新型治疗手段作用下的变化。...

牛膝关节软骨外植体中软骨重塑的离体组织培养模型

本文介绍了一种详细且可重复的流式细胞术方案，利用已建立的小鼠骨关节炎手术模型，通过胞外和胞内染色实验，鉴定小鼠脾脏、骨髓、淋巴结及滑膜组织中的单核细胞/巨噬细胞和T细胞亚群。...

骨关节炎模型中经由流式细胞术分析小鼠脾脏、骨髓、淋巴结及滑膜组织内的免疫细胞亚群

我们提供了从人源间充质干细胞生成四种组织的详细方法，这些组织用于模拟人类膝关节中的软骨、骨、脂肪垫和滑膜。这四种组织被整合到一个定制的生物反应器中，并通过微流控系统相互连接，从而构建出膝关节芯片。...

创建用于模拟关节疾病与药物测试的膝关节芯片模型

我们提出了一种逐步识别和解决原子力显微镜微压痕实验中最常见问题的方法。我们以不同程度骨关节炎导致退变的原代人关节软骨组织为模型，示例说明实验中出现的各类问题。...

解决基于原子力显微镜的人类关节软骨离体组织微压痕实验中的实际问题

本研究提供了一种改良方案，用于从鼠类炎症性关节炎组织中分离滑膜巨噬细胞和成纤维细胞。...

从小鼠关节炎组织中分离和培养原代滑膜巨噬细胞与成纤维细胞

本文介绍了一种类组装体模型系统，用于模拟承重肌腱核心组织与含有在疾病和损伤中被激活的细胞群体的外部区室之间的肌腱细胞间相互作用。作为一个重要的应用实例，我们展示了如何利用该系统探究与疾病相关的外部内皮细胞的激活过程。...

构建肌腱类组装体以研究疾病与修复中的细胞间串扰

本文报道了一种通过过继转移SKG小鼠的CD4+...

小鼠类风湿性关节炎的过继转移模型

本文介绍了一种切断前交叉韧带（ACL）的手术方法，作为一种可靠的诱导啮齿类动物膝骨关节炎的模型，以及采集膝关节滑液、测量膝关节水肿和评估骨关节炎严重程度的方法。...

在啮齿类动物模型中通过前交叉韧带横断与关节腔灌洗研究关节炎症及创伤后骨关节炎

介绍了一种新的无需树突状细胞的抗原特异性T细胞诱导与扩增方法。基于HLA...

基于HLA-Ig的人工抗原呈递细胞用于高效 离体 人类CTL的扩增

了解利用JSAS模块化离体系统建立人滑膜组织模型的方法，用于研究关节炎中的急性滑膜反应。该模型保留三维组织结构，支持炎症因子检测和细胞迁移分析，为临床前类风湿研究提供生物学相关平台。

一种使用关节滑膜炎的临床前模型离体具有保留功能与结构的人类滑膜组织

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一种使用关节滑膜炎的临床前模型 离体 具有保留功能与结构的人类滑膜组织

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