Name: 新生儿小鼠幼崽口腔输液及利用使用腔体评估肠道屏障完整性的功能性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 了解如何使用口腔输液和Ussing腔室评估新生小鼠幼崽的肠道屏障完整性。该方法结合FITC-葡聚糖和辣根过氧化物酶检测，可精确测量细胞旁和跨细胞通透性，为研究早期生命暴露对肠道健康的影响提供可靠工具。

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本工作获得了ANR-11-IDEX-0005-02卓越实验室INFLAMEX的财政支持、未来基金会（2025，AP-RM-24-012）的资助以及ANR Diab1GUT项目（ANR-24-CE15-7152）的资助。本研究在INFIBREX联盟的框架下开展，并受益于以下机构的支持 &#34;法国2030&#34; 投资计划，由法国政府发起，并由巴黎城市大学（Université Paris Cité）负责实施 &#34;卓越计划&#34; IdEx 项目（ANR-18-IDEX-0001）。我们衷心感谢炎症研究中心Ussing Chamber技术平台提供的宝贵支持，并特别感谢Alexandra Willemtz和Maude Le Gall给予的专业协助。我们还要诚挚感谢炎症研究中心动物实验平台提供的关键支持，并特别感谢Isabelle Renault和Guillaume Anselmet的大力帮助。

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

口服灌胃可对单个新生小鼠重复给予精确且剂量明确的管腔内给药。相比之下，虽然自主摄食是一种可行的替代方法，但每只动物需要更长的给药时间，且所给予的化合物剂量较低，给药精度也较差。12此外，灌胃给药可容纳比可行方法更大的体积 通过 可注射途径，有助于在较低浓度下实现更高的总剂量，从而在给药时最大限度地降低潜在毒性13消化道的转运进一步限制了该化合物的分布容积，这对于研究肠道通透性和屏障功能具有优势。然而，毒性会因发育阶段和分子类别而存在显著差异；因此，首次对新生动物施用任何处理时必须格外谨慎。对新生幼鼠进行灌胃是一项精细操作，需要经过专门训练，尤其是出生后10天（DOL 10）以内的幼鼠。建议使用含深色食用染料的PBS进行训练，成功灌胃后可在幼鼠胃部观察到明显的深色区域。若染料出现在胃以外区域，特别是咽喉或胸腔部位，则表明灌胃失败，应立即对幼鼠实施安乐死。此外，灌胃操作不应在麻醉状态下进行，因为溶液的正确递送依赖于幼鼠主动吞咽饲管，这也有助于降低对上食管括约肌造成损伤的风险。&#160;和抽吸...

肠道屏障的完整性在维持整体健康中起着基础性作用，它通过协调黏膜免疫反应并调控肠上皮的选择性通透性来实现这一功能。该屏障系统控制营养物质的通过，同时阻止病原体、抗原和毒素进入体循环1。这种界面的长期破坏与肠道通透性增加相关，通常被称为&#34;肠漏&#34;，目前已被确认不仅是一种结果，更是慢性炎症状态及多种肠外病理变化的驱动因素2。
例如，肠道屏障功能受损已被证实是炎症性肠病（IBD）、幼年特发性关节炎（JIA）和1型糖尿病（T1D）等自身免疫性和代谢性疾病的关键因素。这凸显了肠道屏障状态不仅是一个重要的生物标志物，同时也可作为治疗靶点，以尽可能早地阻止病理生理过程的启动，并防止急性炎症向慢性状态发展3,4,5,6。
在此背景下，新生儿期代表了一个独特且高度敏感的发育窗口期，在此期间，肠道-微生物群界面的建立与成熟对终生的肠道及全身健康产生深远影响7。在这一早期阶段，肠上皮和免疫系统对内源性和外源性因素均表现出高度敏感性，在快速生长和分化的同时，还需适应微生物定植和饮食变化。在此关键发育窗口期内，若肠道屏障完整性受到破坏，可能在日后多种急性和慢性疾病的发生中发挥关键作用。这些疾病包括食物过敏等免疫介导性疾病，以及更严重的慢性疾病，如炎症性肠病（IBD）、幼年特发性关节炎（JIA）和1型糖尿病（T1D）7,8,9。这些疾病的发病机制往往起始于生命早期，因为其初次发病通常发生在儿童期至成年早期10,11。因此，阐明调控新生儿肠道屏障功能的机制，对于开发旨在减轻多种慢性疾病负担的预防和治疗策略至关重要。
鉴于这一背景，迫切需要可靠且具有生理相关性的工具，以在新生儿环境中研究肠道屏障完整性、慢性疾病机制以及炎症反应。这些工具必须能够在不牺牲精确性和有效性的前提下，重现已在成人模型中得到验证的实验检测方法。此外，越来越迫切需要研究多种感兴趣分子候选物的短期和长期效应，这些分子预计会对新生儿肠道稳态产生有益或有害的影响。在现有工具中，对新生小鼠幼崽进行口服灌胃给药是一种极为可靠的方法，可在特定发育阶段精确递送目标分子，从而实现对各种生物活性化合物、药物或微生物代谢产物在肠道成熟及屏障功能方面影响的可控性研究。
本文的第一部分描述了一种对出生后第6天（DOL 6）起的幼鼠进行灌胃的方法，可在食物多样化诱导肠道微生物群物种数量大幅增加之前、期间和之后研究干预措施的影响。因此，该技术能够在幼鼠生长发育过程中，对治疗干预对肠道健康的影响进行纵向分析。
在本文的第二部分，作为该方法的补充， 离体 使用Ussing chamber评估结肠上皮屏障功能可提供一种敏感且定量的通透性特征检测方法。通过对新生小鼠（如出生后第10天幼鼠）结肠活检组织中细胞旁路和跨细胞通透性的评估，能够精确判断多个关键候选因子对上皮屏障完整性和功能的影响。细胞旁路转运主要通过上皮层细胞间隙进行，是一种被动转运机制，依赖电化学梯度和渗透梯度驱动小分子溶质从管腔侧向基底外侧通过。该过程主要由紧密连接家族蛋白（如claudin和occludin）调控。相比之下，跨细胞转运是一种主动机制，可通过上皮细胞实现较大分子溶质的吸收。 通过 特定通道、载体和泵
异硫氰酸荧光素（FITC）标记的葡聚糖（4 kDa）由于分子尺寸较小，主要通过细胞旁路途径转运，而辣根过氧化物酶（HRP；44 kDa）则通过跨细胞途径选择性地转运至基底外侧。via 因此，定量这些非内源性示踪剂可分别评估细胞旁路和跨细胞通透性。采用FITC和HRP的Ussing室检测法可保持组织结构完整性，并实现实时测量肠道任意节段的细胞旁路和跨细胞通透性。新生儿灌胃与Ussing室分析相结合，为研究特定分子如何在短期和长期时间内影响肠道屏障功能提供了有力策略，有助于从生命最早期阶段制定减轻炎症和预防慢性疾病的干预措施。
综上所述，本实验方案描述了两种互补的实验方法，可用于：（1）在新生小鼠出生早期向其体内给予目标分子（步骤1）；（2）利用尤斯灌流室（Ussing chamber）评估从新生期至断奶期小鼠肠道节段的旁细胞和跨细胞通透性（步骤2-6）。

<table><tbody><tr><td>不含钙的10倍浓度DPBS &amp;& Mg</td><td>杜尔贝科氏</td><td>14200091</td><td></td></tr><tr><td>抗-HRP 抗体</td><td>Nordic Biosite</td><td>GTX10183</td><td>单克隆小鼠辣根过氧化物酶IgG [2H11]</td></tr><tr><td>双目放大镜</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td>SZ61</td><td>无需特殊要求。</td></tr><tr><td>黑色平底96孔板</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>137101</td><td>培养板必须为黑色，并适用于荧光检测。检测时需取下盖子。</td></tr><tr><td>BSA</td><td>默克</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>查尔斯河实验室</td><td>632C57BL/6J&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>默克</td><td>2382</td><td></td></tr><tr><td>透明96孔透明平底高结合板</td><td>康宁</td><td>9018</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>默克</td><td>G8270&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>蒸馏水 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-甘露醇</td><td>默克</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>FST</td><td>11445-12</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>FST</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>FITC-葡聚糖 4Kd</td><td>FD4</td><td>TdB Labs</td><td>对光降解敏感。</td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Minerve</td><td>20 031 01</td><td></td></tr><tr><td>HRP</td><td>默克</td><td>P8375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>默克</td><td>M2670&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2300 EasyMount Ussing 系统 &amp;和 Chambers</td><td>生理学仪器</td><td>EM6-C-CE</td><td>系统、腔室和滑块必须全部兼容。</td></tr><tr><td>P2306 Ussing Chamber 滑片</td><td>生理学仪器</td><td>PI-P2306</td><td>适用于不同大小和形态组织的滑块有多种型号可供选择。</td></tr><tr><td>QuantaBlu 荧光过氧化物酶底物试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15169</td><td></td></tr><tr><td>可重复使用喂养针，圆头</td><td>FST</td><td>18061-24</td><td>24 号，1.25 mm 尖端直径，圆头。使用前须用无菌水、70% 乙醇清洗，并经高压灭菌。</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>默克</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>碳酸钠</td><td>默克</td><td>S7795</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>TECAN&amp;nbsp;</td><td>Spark 10M</td><td>若使用137101黑色板，则需要配备顶部检测功能的酶标仪。</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>默克</td><td>P7949</td><td></td></tr></tbody></table>

新生小鼠口服灌胃及利用尤斯室功能评估肠道屏障完整性的方法

Oral Gavage in Neonatal Mouse Pups and Functional Assessment of Gut Barrier Integrity Using Ussing Chambers

越来越多的证据表明，生命最初1000天在塑造肠道-微生物组轴中具有重要意义。这一生命早期窗口期对于长期生理轨迹和免疫适应的建立至关重要，可能影响个体对与菌群失调和屏障功能障碍相关疾病的易感性。要深入理解其潜在机制，必须全面评估关键生理参数，包括新生儿肠道的旁细胞和跨细胞通透性。评估这些参数对于阐明外源性分子的早期暴露如何影响肠道完整性和远期健康结局至关重要。因此，本文第一部分描述了在出生后第6天即可对小鼠幼崽进行目标分子的口服给药，同时最大限度地减少应激、损伤风险和同类相食行为。采用润滑且尖端圆钝的24G饲喂针，对体重不低于2.5 g的小鼠幼崽进行灌胃。第二部分概述了利用Ussing chamber（尤斯室）装置对出生后第10天至断奶期间幼崽结肠组织样本进行离体（ex vivo）旁细胞和跨细胞通透性的评估方法。使用专为小型活检组织设计的无针滑片，配合Ussing chamber固定新生小鼠结肠样本。在实验开始时，将旁细胞探针FITC-葡聚糖（4 kDa）和跨细胞标志物辣根过氧化物酶（44 kDa，VI型）加入系统的顶端室。于0分钟、30分钟、60分钟、90分钟和120分钟从基底外侧室采集样本，以定量探针的跨膜转运量。两种标志物的转运量均通过酶标仪进行直接（FITC）和间接（HRP）检测，依据标准曲线计算，并以通量（flux）形式表示。

标准曲线绘制与孔浓度定量 
从每孔的吸光度值中减去空白对照孔的平均值。以Y轴为吸光度值，X轴为浓度，使用GraphPad Prism软件中的“插值标准曲线（Interpolate a standard curve）”功能绘制标准曲线。若所有标准品点呈线性排列，“线性（Line）”模型可提供最佳拟合结果； alternatively，采用“S型四参数逻辑斯蒂模型（Sigmoidal, 4 PL, X is concentration）”可在非线性标准曲线插值时提供更高的灵活性与准确性（图6）。将待测样本的吸光度值（Y轴）填入标准品下方，通过结果表中的“插值得到的X平均值（Interpolated X mean values）”反推出各样本的浓度（图6）。
<img alt="在535 nm处的吸光度与浓度关系图，显示标准曲线及插值。" cla...

本文描述了：（1）从出生后第6天（DOL&#8239;6）起对新生小鼠进行口服灌胃给药；（2）通过Ussing chamber评估出生后第10天至断奶期（出生后第20天）幼鼠结肠上皮屏障功能的离体（ex vivo）检测方法，包括细胞旁路和跨细胞通透性的测定。

越来越多的证据强调了生命最初1000天在塑造肠-微生物组轴中的重要性。这一生命早期窗口期对……至关重要

我们研究了microRNA在宿主与微生物相互作用中的作用，并探索其作为炎症性肠病（IBD）新型治疗手段的潜力。目前的方法缺乏可靠的工具来评估生命早期肠道屏障的完整性。本方案通过实现对慢性疾病发展基础因素的精确研究，弥补了这一空白。首先，将洁净的纸巾放在设定为约 38 摄氏度的已消毒加热垫上。在打开动物笼盒前，用 70% 乙醇清洗手套，以减少气味传递给幼崽，并降低母鼠食仔的风险。随后，将母鼠转移到另一个笼子中，并移至其他房间，以尽量减少幼崽叫声引起的应激反应。用巢材擦拭清洁过的手套，以防止灌胃过程中将外界气味传递给幼鼠。使用无菌技术将喂食针头连接到注射器上。测量出生六天及以上小鼠幼崽的剑突至吻部的距离，以此在喂食针上标记最大插入长度。吸取的灌胃液体积应超过所需剂量，以避免注入气泡。用非优势手的拇指和食指轻轻捏起幼鼠肩胛骨之间的皮肤以提起幼鼠。润滑后，将幼鼠保持接近水平的位置，将喂养针插入其口腔，并垂直向咽部推进，直至到达喉部后方。然后，将针头向口腔两侧滑动，避开舌头，同时保持相同的进针深度。缓慢向后倾斜幼鼠头部，同时调整针头角度，直至注射器、头部与背部成一直线，且头部略微向背部倾斜。接着，让注射器在自身重力作用下缓慢下降，不要施加压力，直至插入标记接近或到达吻部水平位置。当插管到达或接近标记位置时，迅速注入所需体积的灌胃液。接着，以与插入时相同的角度轻柔地撤出针头。将幼崽置于事先铺在加热垫上的纸巾上，观察其恢复情况，确保在20秒内恢复正常呼吸。待幼鼠恢复后，将其放回巢穴并与母鼠重新聚集。将之前经口灌胃处理、年龄为10至20天并已实施安乐死的幼鼠置于解剖显微镜下，用70%乙醇擦拭动物腹部。使用镊子夹住腹部皮肤和腹膜，然后用精细剪刀沿与头尾轴垂直的方向做大横切口，注意不要切到肠管。现在，将精细剪刀轻轻插入切口，并沿两侧横向剪开腹膜。使用镊子和精细剪刀，从胸腔区域向下至盆腔下部剪开腹膜的上部和下部。随后，辨认远端结肠，并沿其轴线平行方向切开，向直肠方向移动。现在，在结肠的末端部分做一切口以游离结肠，轻柔地牵拉结肠向盲肠方向推进，同时清除所遇到的任何结缔组织或脂肪组织。在盲肠上方的回盲交界处切断，将结肠从腹腔中分离。弃去盲肠及近端结肠最初的数毫米部分，然后采集一个或两个大于Ussing槽孔径的结肠组织样本。将剪刀闭合，施加轻微压力，从近端向远端滑动，以清除展平的活检组织中的粪便内容物。接着，将排空后的结肠组织放入冰冻的克雷布斯-林格碳酸氢盐缓冲液中。用纸巾轻轻擦干已清洁的结肠样本，去除多余水分。然后，将结肠样本置于放大镜下，小心地将精细剪刀的一侧刀刃插入管腔部分，将其剪开。使用精细镊子将组织放置在载玻片的白色部分，使管腔面朝上并面向操作者。最后，在双目显微镜下盖上盖玻片，并通过目视确认盖玻片已紧密闭合。在保持轻柔压力以确保推片闭合的同时，将其插入Ussing chamber，使由推片透明部分标记的管腔朝向左侧。使用FITC-葡聚糖和HRP进行结肠通透性检测。随时间收集跨膜转运样品以评估屏障功能。通过计算每个实验组在Ussing chamber测量中FITC-葡聚糖随时间依赖性的通量来定量结肠通透性。与对照组相比，经microRNA-B处理的动物组织活检中通量值显著增加，而microRNA-A处理组则无此变化。对各个样本的通量变化进行验证，以识别可能的异常情况，因为通量值在各时间点之间应保持稳定。在时间零点加入10毫摩尔EDTA后，与对照样品相比，通量显著增加，同时保持了相似的整体通量变化模式。该方案是一种研究特定分子如何影响新生儿肠道屏障功能的强大策略。除训练外，操作还需迅速且精确，以确保对动物的正确处理以及通透性测定的最佳条件。结肠通透性的变化可通过独立的实验方法进行验证，例如通过qPCR定量与之相关联的转录本，以确认屏障功能的调节。

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新生儿小鼠幼崽口腔输液及利用使用腔体评估肠道屏障完整性的功能性

术后肠梗阻（POI）是腹部手术后的一种并发症，可导致发病率升高和住院时间延长。由于目前缺乏有效的预防或治疗策略，亟需加强相关研究。因此，我们建立了一种标准化且可行的小鼠模型，用于研究POI的病理生理机制，并探索潜在的治疗方案。...

肠道运动功能及肠壁炎症在啮齿类动物中的功能评估：标准化肠道操作模型中的分析

本方案描述了使用离体肠组织制备物或“肠囊”作为肠道屏障功能的离体模型。ex vivo...

体外 肠道囊泡法评估胃肠道疾病模型中的黏膜通透性

本研究详细阐述了向新生小鼠灌胃精确剂量益生菌的操作过程。实验方案经过优化，包括但不限于益生菌给药、给药方法以及肠道内细菌的定量分析。...

使用灌胃法在新生小鼠中进行益生菌研究

利用活体显微技术，本文所介绍的方法能够实现对活体动物肠道上皮细胞脱落过程的实时可视化观察。因此，通过对麻醉小鼠的肠道黏膜进行局部染色（吖啶黄和罗丹明B-葡聚糖），可借助共聚焦显微镜以单细胞分辨率进行成像。...

基于活体显微镜的肠道通透性与上皮细胞脱落功能评估方法

肠道上皮屏障功能和免疫反应失调是炎症性肠病的特征，但由于缺乏生理相关模型，这些特征迄今研究尚不充分。本文介绍一种小鼠肠道环模型，该模型利用血供良好且外置于体外的肠段，在活体条件下研究黏膜通透性和白细胞募集。...

利用标准化肠段模型对小鼠肠道通透性及中性粒细胞跨上皮迁移进行功能评估

肠上皮不仅具有营养吸收功能，还能防止有害物质侵入。位于上皮细胞间连接最顶端的紧密连接可调节溶质和离子的细胞旁通透性。本文介绍了一种制备黏膜片并利用尤斯 chamber...

利用Ussing腔室技术对原生组织中肠紧密连接屏障功能及离子通透性的功能评估

坏死性小肠结肠炎（NEC）是最严重的胃肠道（GI）疾病，常发生于早产儿，尤其是极低出生体重儿，具有高死亡率且发病机制尚不明确。NEC的病因可能与炎症性免疫调节系统异常有关。建立NEC动物模型是研究NEC疾病免疫机制不可或缺的工具。目前NEC动物模型通常采用C57BL/6J新生小鼠；而BALB/c新生小鼠则较少被使用。相关研究表明，小鼠感染时，与C57BL/6J小鼠相比，BALB/c小鼠更倾向于Th2细胞分化。已有研究提示，NEC的发生与发展与辅助性T细胞2型（Th2）细胞的增加相关，并常伴随感染。因此，本研究采用新生BALB/c小鼠建立NEC模型，该模型具有与NEC患儿相似的临床特征和肠道病理改变。尚需进一步研究以明确该动物模型是否可用于NEC中Th2细胞应答的研究。...

一种新生BALB/c小鼠的坏死性小肠结肠炎模型

为了研究小肠如何处理不同大小的颗粒物，我们改进了一种已建立的方法 体内...

研究小鼠小肠对管腔内颗粒物的机械感知

在本研究中，向小鼠给予荧光素异硫氰酸酯标记的（FITC）葡聚糖 通过 口服灌胃以评估肠道通透性 体内...

利用荧光素异硫氰酸酯标记的葡聚糖评估小鼠肠道屏障完整性

本方案概述了一种坏死性小肠结肠炎（NEC）的新生小鼠模型，以及随后从新生小鼠小肠固有层中分离免疫细胞的方法。...

一种用于免疫细胞分析的坏死性小肠结肠炎新生小鼠模型及固有层分离方法

本实验方案旨在通过在牙龈表面局部应用不同分子量的荧光标记葡聚糖，对小鼠牙龈上皮屏障的完整性进行定量评估，提供一种标准化的方法。 体内，随后 离体 使用单光子显微成像系统进行成像。...

利用荧光示踪剂评估小鼠牙龈上皮屏障功能

了解如何使用口腔输液和Ussing腔室评估新生小鼠幼崽的肠道屏障完整性。该方法结合FITC-葡聚糖和辣根过氧化物酶检测，可精确测量细胞旁和跨细胞通透性，为研究早期生命暴露对肠道健康的影响提供可靠工具。

新生小鼠口服灌胃及利用尤斯室功能评估肠道屏障完整性的方法

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