一种新型平台 体外 细胞拉伸与成像

我们的目标是开发一种低成本、受霍伯曼结构启发的显微镜兼容细胞拉伸装置，用于研究机械拉伸如何影响细胞功能。该装置使研究人员能够观察活细胞对机械刺激的反应，模拟诸如跳动的心脏或呼吸的肺等生理系统。开始实验前，请穿戴适当的个人防护装备。

在塑料培养皿中按10:1的比例混合Silgard 184基础剂与固化剂。使用压舌板剧烈搅拌组分2至3分钟。随后将培养皿置于脱气室中处理1小时。

接下来，取制备好的3D打印模具，将1.3克PDMS混合物加入各向同性模具中，然后向单轴模具中加入0.5克PDMS混合物。将凝胶均匀铺展至整个模具，并对注满的模具抽真空处理一小时。

将模具中的凝胶在室温下于平坦表面静置两小时。然后在60摄氏度的烘箱中过夜固化模具。接着，按相等比例混合NuSil凝胶8100的A组分和B组分。

将混合凝胶与Silgard 184交联剂按总体积的0.36%混合，以制备硬度为13千帕的基质。若要制备硬度为0.3千帕的柔软基质，则跳过添加交联剂的步骤，然后将溶液旋转混合15分钟。将NuSil混合物置于脱气室中，脱气30分钟。

现在小心地将PDMS凝胶从定制模具中取出，放置在40毫米的盖玻片上，注意不要撕裂。接着将PDMS凝胶放入旋涂仪中。用移液器吸取100微升NuSil混合物，滴加到各向同性PDMS凝胶的负性区域。

然后将50 µL的NuSil混合物移液至单轴PDMS凝胶的负区域。随后在7 G条件下离心50秒，以获得100 µm的厚度。

将包被的凝胶在室温下置于平坦水平表面静置两小时。将凝胶放入烘箱中，在60摄氏度下过夜固化。随后在弹性细胞培养孔中接种人气道平滑肌细胞，并在标准条件下进行培养。

随后，将细胞与FLIPR钙离子六号溶液混合用于成像。对于牵引力测量，需在PDMS NuSil凝胶基底上包被一层荧光微珠作为标记点。用HBSS配制浓度为0.025%、直径为一微米的红色荧光羧基修饰微球溶液。

使用涡旋混合器将珠子溶液涡旋混匀10秒。然后用移液器将880 µL珠子溶液加入各向同性凝胶中。将420 µL珠子溶液加入单轴凝胶中。

将凝胶在室温下孵育一小时后，小心移除珠子溶液以保持珠子分布均匀。然后使用棉签或实验室擦拭纸轻轻吸去凝胶表面残留的溶液。接下来，使用配备相机、光源和10倍干物镜的倒置显微镜进行观察。

将激发波长设为475±40纳米，发射波长设为555±50纳米。在拉伸实验期间，以每秒2帧的速率采集16位图像。现在将各向同性凝胶放置于拉伸装置上，然后使用配备10倍干式物镜的倒置显微镜对荧光微珠成像，采集拉伸前状态的图像。

在整个拉伸过程中，持续采集基底中心区域的图像。若有必要，在拉伸位置重新对焦显微镜后再进行图像采集。使用基于傅里叶牵引力显微技术的自定义 MATLAB 代码分析图像，以计算位移矢量及相应的平面应变场。

将数据表示为末次试验的平均值。施加240微米的位移导致荧光微珠从中心径向向外移动。牵引力显微镜显示了一个各向同性的位移场，其矢量从中心向外辐射，并随距离增加而增大。

各向同性的位移场产生了一个均匀的平面应变场。将位移增加至1000微米后，位移矢量的幅值增大，同时保持径向排列。在1000微米条件下的相应应变场，其幅值随之增大，但仍保持径向对称性。

在经受250微米位移的单轴凝胶中，位移矢量主要沿单一轴线排列，与单轴应变一致。应变波形与程序设定的电机位移高度一致，并在三次重复循环中保持同步。在最大位移时的应变值在三个独立样本中保持一致。

施加最高达 5,555 微米的瞬时位移，可产生从大于 0.1% 到 12% 的应变。瞬时 0.5% 的应变可诱导细胞内钙离子浓度升高，在拉伸后表现为荧光强度增加。利用我们的拉伸装置，研究人员可开展活细胞钙成像、牵引力显微镜观察，并量化细胞对各向同性或单轴拉伸的力学响应。一个关键步骤是确保凝胶在水平表面上固化，因为厚度不均可能导致基底偏离焦平面，从而在活体成像过程中降低光学清晰度。

未来的研究可探讨拉伸诱导的细胞骨架重定向、与哮喘或肺损伤相关的病理性应变条件，以及不同细胞类型中的此类现象。