Name: 体 外 细胞拉伸与成像的新平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-10T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 了解一种低成本、显微镜兼容的细胞拉伸平台，用于研究原代人气道平滑肌细胞在机械拉伸下的钙信号和牵引力变化。该装置支持各向同性和单轴拉伸，适用于机械生物学和疾病机制研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢诺亚·约瑟夫先生在模具制造过程中提供的帮助。作者感谢波士顿大学科学仪器设施的海托尔·穆拉托和格伦·赛耶在设备加工方面提供的协助。本研究得到了美国国家科学基金会（NSF）职业奖 #2047207 的资助，该奖项授予哈里克里希南·帕拉梅斯瓦兰。H.P. 提出了研究构想。S.E.S. 和 S.R.P. 负责设备的整体设计，S.E.S. 和 H.P. 设计了各向同性实验。S.E.S. 开展了各向同性模具实验，分析了实验数据，并与 H.P. 共同解释了实验结果。V.C. 设计了单轴模具，优化了凝胶制备和成珠过程。B.M.G. 开展了单轴凝胶实验，分析了实验数据，并与 H.P. 和 V.C. 共同解释了实验结果。S.E.S. 和 B.M.G. 负责制备图表。B.M.G.、S.E.S.、V.C. 和 H.P. 参与了论文的起草与修改。H.P. 批准了论文的最终版本。

本研究中使用的人原代气道平滑肌细胞（ASMCs）购自美国典型培养物保藏中心（ATCC，弗吉尼亚州），并根据美国国立卫生研究院（NIH）指南对供体信息进行了去标识化处理。本研究在开展实验前已获得东北大学生物安全委员会的批准。
注意：有关该设备的制作说明及设备尺寸，请参见我们 GitHub 仓库中提供的 CAD 文件：https://github.com/Breathe-Lab/A-Novel-Platform-for-In-Vitro-Cellular-Stretching-and-Imaging。
1. 3D打印模具的设计
<ol>
	<li>各向同性模具尺寸
	<ol>
		<li>模具外径为 37 mm。</li>
		<li>模具外高为 4.1 mm。</li>
		<li>外壁厚度为 2.1 mm。</li>
		<li>模具底部厚度为 2 mm。</li>
		<li>安装孔位于距边缘 2 mm 处。</li>
		<li>内部细胞培养孔区域直径为 20 mm，深度为 1.9 mm。 
		注：完成后的 PDMS 模具其细胞培养区域厚度应为 200 µm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单轴拉伸模具尺寸
	<ol>
		<li>模具外部尺寸为 41 mm × 12 mm × 4 mm（长 × 宽 × 高）。</li>
		<li>安装孔距离宽度边缘 3 mm，距离长度边缘 4 mm，柱状凸起深度为 1 mm。</li>
		<li>宽度方向边缘的外壁厚度为 1.5 mm，长度方向边缘的外壁厚度为 2 mm。</li>
		<li>内部细胞培养孔尺寸为 26 mm × 5.5 mm × 1 mm（长 × 宽 × 高）。</li>
		<li>底部厚度为 2 mm。 
		&#8203;注：模具在 SolidWorks 中设计，使用 FormLabs 液态灰色树脂系统进行 3D 打印，并在东北大学（Northeastern University）创客空间制造。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>仅限模具首次使用时的操作说明
	<ol>
		<li>打磨模具打印件的粗糙边缘。</li>
		<li>在负模表面涂覆透明指甲油，以利于后续固化后脱除 PDMS 模具。让模具在空气中干燥 24 小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 用于细胞培养的光学透明、弹性凝胶的制备及其基底刚度的可调性
注意：操作 PDMS 和 NuSil 时应穿戴适当的个人防护装备（手套、实验服、护目镜）。
<ol>
	<li>按重量比10:1将Sylgard 184基础剂与固化剂加入塑料皿中。</li>
	<li>用压舌板（或类似工具）剧烈搅拌2-3分钟。</li>
	<li>将混合物抽真空脱气1小时。</li>
	<li>将PDMS混合物倒入定制的负模中（图2A、B）。
	<ol>
		<li>各向同性模具中加入1.3 g。</li>
		<li>单轴模具中加入0.5 g。 
		&#8203;注意：需小心操作，确保凝胶在模具内均匀分布。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对模具抽真空脱气1小时。</li>
	<li>将模具中的凝胶在室温下平放静置2小时，使其充分沉降。</li>
	<li>在60 °C下固化过夜。</li>
	<li>将NuSil Gel-8100的A组分和B组分按等比例（1:1）放入滚筒混合器中混合15分钟。
	<ol>
		<li>加入Sylgard 184交联剂，添加量为总体积的0.36%，以制备刚度为13 kPa的基底32。</li>
		<li>不添加交联剂，以制备刚度为0.3 kPa的基底。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将混合物抽真空脱气30分钟。</li>
	<li>小心地从定制模具中取出PDMS凝胶，将其放置于40 mm盖玻片上。 
	注意：操作时需小心，避免撕裂凝胶，因其质地脆弱。</li>
	<li>将NuSil混合物倒入PDMS凝胶的凹面区域。
	<ol>
		<li>各向同性凝胶：100 µL。</li>
		<li>单轴凝胶：50 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用旋涂仪以7 × g 的离心力旋转涂覆50秒，使PDMS凝胶表面的NuSil混合物形成厚度均匀的基底（100 µm）。</li>
	<li>将凝胶在室温下平放静置2小时，随后在60 °C下固化过夜。 
	注意：请务必确保所有固化步骤均在水平表面上进行。若凝胶表面不平整，将导致显微成像时无法使整个感兴趣区域保持在同一焦平面。若成像结果显示视野内存在焦距差异，则表明凝胶可能在非水平条件下固化，应重新制备。</li>
	<li>将制备完成的细胞培养皿存放于带盖的培养皿中，待用（图2D-E）。</li>
</ol>
3. 基质蛋白包被
<ol>
	<li>加入 500 &#181;L-多聚赖氨酸（PLL，500 &#181;g/mL）加入每种基质中。</li>
	<li>室温孵育1小时。</li>
	<li>洗涤基质 3 次 &#215; 用1 mL PBS洗涤，随后进行3次 &#215; 用1 mL 10 mM HEPES缓冲液（pH 8.0）处理。</li>
	<li>加入 500 &#181;向每个基质中加入 mPEG-SVA（50 mg/mL）的 L。</li>
	<li>室温孵育1小时。</li>
	<li>洗涤基底 3 次 &#215; 用 1 mL PBS 冲洗。</li>
	<li>用 500 μL PBS 替换 &#181;L 型 PLPP（14.5 mg/mL）。</li>
	<li>使用配备 Leonardo 软件的 PRIMO 微图形化系统，将预定义图案通过紫外光投射到基底表面，持续 30 秒。</li>
	<li>洗涤基底 3 次 &#215; 用1 mL PBS冲洗，并置于紫外线下照射15分钟以进行消毒。</li>
	<li>加入 500 &#181;每种底物上加入0.1%荧光素标记的明胶L。</li>
	<li>室温孵育1小时。</li>
	<li>洗涤 3 次 &#215; 用 1 mL PBS 冲洗。 
	注意：为观察图案，需在室温下用0.1%荧光素标记的明胶孵育1小时。</li>
	<li>继续进行成像。</li>
</ol>
4. 弹性培养皿中人源气道平滑肌细胞的培养
注意：所有细胞培养操作均须在生物安全柜中使用标准无菌技术进行。
<ol>
	<li>从 ATCC（弗吉尼亚州）获取原代人支气管平滑肌细胞（ASMCs），并确保根据 NIH 指南对供体信息进行去标识化处理。在开展实验前，确认已获得机构生物安全委员会的批准。</li>
	<li>使用来自三位不同性别和年龄、无哮喘/疾病史的健康人供体的细胞。示例：一位女性（18 岁）和两位男性（34 岁和 59 岁）。</li>
	<li>在标准条件下（37 °C，5% CO₂）培养细胞，所有实验均使用不超过第 6 代的细胞。</li>
	<li>使用以下完全培养基培养细胞：
	<ol>
		<li>DMEM/F12（500 mL）</li>
		<li>10% 胎牛血清（FBS）（50 mL）</li>
		<li>1× 青霉素/链霉素（5 mL）</li>
		<li>1× MEM 非必需氨基酸（5 mL）</li>
		<li>两性霉素 B（0.5 mL）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在测量前至少 24 小时将细胞更换至无血清培养基。无血清培养基的配制如下：
	<ol>
		<li>Ham's F-12 培养基（500 mL）</li>
		<li>1× 青霉素/链霉素（5 mL）</li>
		<li>两性霉素 B（50 µg/L）</li>
		<li>1× MEM 非必需氨基酸（5 mL）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对可拉伸细胞培养皿进行 15 分钟的紫外灭菌。</li>
	<li>在接种细胞前，将灭菌后的培养皿在室温下用 0.1% 明胶孵育 1 小时（图 2F）。
	<ol>
		<li>对于图案化基底：
		<ol>
			<li>以 104&#160;cells/cm2 的密度将细胞接种至弹性细胞培养孔中。</li>
			<li>在含 10% 血清的培养基中孵育 10 分钟，以促进细胞在图案化区域的贴附。</li>
			<li>用 PBS 洗涤培养孔，去除未贴附的细胞。</li>
			<li>向培养孔中加入含 10% 血清的培养基，并孵育 24 小时。</li>
			<li>更换为无血清培养基，并在测量前继续孵育 24 小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对于非图案化基底：
		<ol>
			<li>以所需密度接种细胞：单个细胞为 102&#160;cells/cm2&#160;；稀疏细胞为 103&#160;cells/cm2&#160;；汇合细胞为 104cells/cm2&#160;。</li>
			<li>在含 10% 血清的培养基中孵育 24 小时。</li>
			<li>更换为无血清培养基，并在测量前继续孵育 24 小时。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 荧光钙成像与分析
<ol>
	<li>将气道平滑肌细胞在无血清培养基中饥饿培养 24 h。</li>
	<li>根据制造商说明书配制 FLIPR Ca2+&#160;6 染料。</li>
	<li>将 FLIPR Ca2+&#160;6 染料与无血清培养基按 1:1 比例混合。</li>
	<li>将细胞与 FLIPR Ca²⁺ 6 溶液在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 2 h。</li>
</ol>
6. 成像设置
<ol>
	<li>使用配备以下组件的 Leica DMi8 倒置显微镜：
	<ol>
		<li>Leica DFC6000 相机</li>
		<li>Leica LED8 光源引擎</li>
		<li>5×/0.12 干式物镜</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置激发光波长为 480/40 nm，发射光波长为 527/50 nm。</li>
	<li>在拉伸实验期间以 2 Hz 的帧率采集 16 位图像。</li>
</ol>
7. 数据分析
<ol>
	<li>将图像序列导入 Fiji（ImageJ）33。</li>
	<li>手动定义每个细胞胞质内的感兴趣区域（ROI）。</li>
	<li>提取每个感兴趣区域随时间变化的平均灰度值。</li>
	<li>使用自定义的 MATLAB 脚本处理荧光强度数据。 
	注意：荧光强度与胞质内 [Ca2+] 成正比。</li>
</ol>
8. 牵引力测量与分析
注意：所有代码，包括图像分析、牵引力显微镜和电机控制的代码，均可在我们的 GitHub 仓库获取：&#160;<a href="https://github.com/Breathe-Lab/A-Novel-Platform-for-In-Vitro-Cellular-Stretching-and-Imaging">https://github.com/Breathe-Lab/A-Novel-Platform-for-In-Vitro-Cellular-Stretching-and-Imaging</a>
<ol>
	<li>用荧光微珠涂覆 PDMS-NuSil 凝胶基底，作为牵引力显微镜的基准标记。</li>
	<li>将直径为 1 µm 的红色荧光羧基修饰微球以 1:4000 的比例稀释于 HBSS 中，配制 0.025% 的溶液。</li>
	<li>涡旋混匀微珠溶液 10 秒。</li>
	<li>将微珠溶液加入凝胶中。
	<ol>
		<li>各向同性凝胶加入 880 µL。</li>
		<li>单轴拉伸凝胶加入 420 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>室温孵育 1 小时，使微珠充分黏附。</li>
	<li>1 小时后，小心移除溶液。 
	注意：倾倒微珠溶液时应轻柔，避免破坏软凝胶表面。操作不当会影响微珠分布的均匀性。</li>
	<li>用棉签或无尘纸轻轻吸除残留溶液。</li>
	<li>使用配备 10x/0.32 干式物镜的 Leica DMi8 显微镜对微珠成像。</li>
	<li>在拉伸前状态及整个拉伸过程中持续采集图像。 
	注意：所有成像均应在基底中心区域进行，该区域的应变最均匀。必要时，在拉伸状态下重新对焦后再采集图像。</li>
	<li>采用基于傅里叶牵引力显微镜方法的自定义 MATLAB 程序分析图像，计算位移矢量及相应的平面应变场 34。</li>
	<li>数据以 N 次重复实验的平均值表示。</li>
</ol>
9. 细胞拉伸装置的校准
<ol>
	<li>向孔中加入 500 µL 的 H₂O，以模拟细胞培养基的重量，并保持蛋白图案湿润。</li>
	<li>有关创建特定蛋白图案的方案，请参见第 3 节“基质蛋白包被”。</li>
	<li>以 400 µm 的电机位移为步长，逐步增加至最大 2800 µm，然后以反向 400 µm 递减返回至零，每次移动后对荧光图案成像。</li>
	<li>通过测量弹性基底拉伸过程中荧光蛋白图案拼写的“BREATHE”字母在面积和离心率上的变化，表征步进电机线性位移与可拉伸细胞培养皿各向同性形变之间的关系，评估范围涵盖宏观和区域尺度。使用一个包含所有字母的矩形边界框，计算整个单词的面积和离心率。</li>
	<li>在 MATLAB 中应用图像分割技术，对每个单独字母的上述参数进行量化。</li>
	<li>以细胞培养皿未拉伸时的尺寸定义零位移。</li>
	<li>在两到三个独立制备的可拉伸细胞培养孔上重复每次实验，以确保可重复性。</li>
</ol>
10. 数据呈现与统计检验
<ol>
	<li>对于拉伸装置校准实验，将试验定义为循环次数。</li>
	<li>将每次试验单独展示，而非合并为单一条曲线，以证明系统的重复性。</li>
	<li>以标准差表示误差线。</li>
	<li>对于受一个独立因素影响且包含三个或更多组的数据集，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验显著性差异。</li>
	<li>对于受两个独立因素影响的数据集，采用双因素方差分析（two-way ANOVA），随后进行事后两两比较。</li>
	<li>当数据呈正态分布时，使用 t 检验进行两两比较。</li>
	<li>当数据非正态分布时，采用 Mann-Whitney 秩和检验比较中位数值。</li>
	<li>报告所使用的具体检验方法、样本数量及相应的 P 值，并连同结果一并呈现。</li>
	<li>采用 P 值 0.05 作为判定数据集间统计学显著性差异的阈值。</li>
	<li>在 SigmaStat 中进行统计学检验。</li>
	<li>使用 GraphPad Prism 和 MATLAB 绘制图表。</li>
</ol>

<ol><li>Alvarez, Y., Smutny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+mechanical+forces+in+cell+fate+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging role of mechanical forces in cell fate acquisition.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 864522(2022).</li>
<li>Vining, K. H., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+forces+direct+stem+cell+behaviour+in+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18, 728-742 (2017).</li>
<li>Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+force-induced+signal+transduction+in+lung+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanical force-induced signal transduction in lung cells.</a> Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).</li>
<li>Stasiak, S. E., Jamieson, R. R., Bouffard, J., Cram, E. J., Parameswaran, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+communication+controls+agonist-induced+calcium+oscillations+independently+of+gap+junctions+in+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Intercellular communication controls agonist-induced calcium oscillations independently of gap junctions in smooth muscle cells.</a> Sci Adv. 6 (32), eaba1149(2020).</li>
<li>Riley, D. J., Rannels, D. E., Low, R. B., Jensen, L., Jacobs, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NHLBI+workshop+summary%3A+effect+of+physical+forces+on+lung+structure%2C+function%2C+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Rev+Respir+Dis%22%5BJournal%5D)">NHLBI workshop summary: effect of physical forces on lung structure, function, and metabolism.</a> Am Rev Respir Dis. 142, 910-914 (1990).</li>
<li>Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+and+extracellular+matrix+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 802-812 (2014).</li>
<li>Gong, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+role+of+mechanical+stretching+in+the+progression+of+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">An overview of the role of mechanical stretching in the progression of lung cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 781828(2021).</li>
<li>Jaalouk, D. E., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+gone+awry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction gone awry.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 63-73 (2009).</li>
<li>Tilghman, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+rigidity+regulates+cancer+cell+growth+and+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype.</a> PLoS One. 5, e12905(2010).</li>
<li>Hannezo, E., Heisenberg, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanochemical+feedback+loops+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanochemical feedback loops in development and disease.</a> Cell. 178, 12-25 (2019).</li>
<li>Das, S., Ippolito, A., McGarry, P., Deshpande, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+reorientation+on+a+cyclically+strained+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+Nexus%22%5BJournal%5D)">Cell reorientation on a cyclically strained substrate.</a> PNAS Nexus. 1, pgac199(2022).</li>
<li>Dartsch, P. C., Hämmerle, H., Betz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+cultured+arterial+smooth+muscle+cells+growing+on+cyclically+stretched+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Anat%22%5BJournal%5D)">Orientation of cultured arterial smooth muscle cells growing on cyclically stretched substrates.</a> Acta Anat. 125, 108-113 (1986).</li>
<li>An, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+stiffness%2C+contractile+stress+and+the+role+of+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Cell stiffness, contractile stress and the role of extracellular matrix.</a> Biochem Biophys Res Commun. 382, 697-703 (2009).</li>
<li>Arold, S. P., Bartolák-Suki, E., Suki, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+stretch+pattern+enhances+surfactant+secretion+in+alveolar+type+II+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Variable stretch pattern enhances surfactant secretion in alveolar type II cells in culture.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L574-L581 (2009).</li>
<li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+physical+responses+to+stretch+in+the+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Universal physical responses to stretch in the living cell.</a> Nature. 447, 592-595 (2007).</li>
<li>Benavides Damm, T., Egli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+%27s+role+in+mechanotransduction+during+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Calcium 's role in mechanotransduction during muscle development.</a> Cell Physiol Biochem. 33, 249-272 (2014).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Ca2%2B+influx+pathway+activated+by+mechanical+stretch+in+human+airway+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel Ca2+ influx pathway activated by mechanical stretch in human airway smooth muscle cells.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 407-413 (2008).</li>
<li>Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-activated+calcium+mobilization+in+airway+smooth+muscle+and+pathophysiology+of+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stretch-activated calcium mobilization in airway smooth muscle and pathophysiology of asthma.</a> Curr Opin Physiol. 21, 65-70 (2021).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton+regulates+stretch-activated+Ca2%2B+influx+in+human+pulmonary+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton regulates stretch-activated Ca2+ influx in human pulmonary microvascular endothelial cells.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 26-34 (2010).</li>
<li>Tanaka, Y., Hata, S., Ishiro, H., Ishii, K., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+stretch+increases+the+production+of+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+%28IP3%29+in+porcine+coronary+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Quick stretch increases the production of inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) in porcine coronary artery.</a> Life Sci. 55, 227-235 (1994).</li>
<li>Brown, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+mechanical+stimulation+of+cells+in+vitro%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Techniques for mechanical stimulation of cells in vitro: a review.</a> J Biomech. 33, 3-14 (2000).</li>
<li>Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+stretching+devices+as+research+tools%3A+engineering+and+biological+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell stretching devices as research tools: engineering and biological considerations.</a> Lab Chip. 16, 3193-3203 (2016).</li>
<li>Fredberg, J. J., Bunk, D., Ingenito, E., Shore, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+resistance+and+the+contractile+state+of+lung+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tissue resistance and the contractile state of lung parenchyma.</a> J Appl Physiol. 74, 1387-1397 (1993).</li>
<li>Shen, Z. L., Dodge, M. R., Kahn, H., Ballarini, R., Eppell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-strain+experiments+on+individual+collagen+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Stress-strain experiments on individual collagen fibrils.</a> Biophys J. 95, 3956-3963 (2008).</li>
<li>Atcha, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low-cost+mechanical+stretching+device+for+uniaxial+strain+of+cells%3A+a+platform+for+pedagogy+in+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">A low-cost mechanical stretching device for uniaxial strain of cells: a platform for pedagogy in mechanobiology.</a> J Biomech Eng. 140, 0810051-0810059 (2018).</li>
<li>Tschumperlin, D. J., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equibiaxial+deformation-induced+injury+of+alveolar+epithelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro.</a> Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).</li>
<li>Meza, D., Abejar, L., Rubenstein, D. A., Yin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shearing-stretching+device+that+can+apply+physiological+fluid+shear+stress+and+cyclic+stretch+concurrently+to+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">A shearing-stretching device that can apply physiological fluid shear stress and cyclic stretch concurrently to endothelial cells.</a> J Biomech Eng. 138, 4032550(2016).</li>
<li>Ursekar, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+construction+of+an+equibiaxial+cell+stretching+system+that+is+improved+for+biochemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Design and construction of an equibiaxial cell stretching system that is improved for biochemical analysis.</a> PLoS One. 9, e90665(2014).</li>
<li>Pelham, R. J., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 13661-13665 (1997).</li>
<li>Cell stretching bioreactor FAQs. , Flexcell International. 
 <a target="_blank" href="https://www.flexcellint.com/resources/faq">https://www.flexcellint.com/resources/faq</a> (2024).</li>
<li>Bossé, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+strain+on+airway+smooth+muscle+during+a+deep+inspiration+to+total+lung+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Eng+Sci+Med+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">The strain on airway smooth muscle during a deep inspiration to total lung capacity.</a> J Eng Sci Med Diagn Ther. 2, 010802(2019).</li>
<li>Yoshie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+screening+enabled+by+compliant+PDMS+elastomers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Traction force screening enabled by compliant PDMS elastomers.</a> Biophys J. 114, 2194-2199 (2018).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open+source+platform+for+biological+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open source platform for biological image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Butler, J. P., Toli ć-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+fields%2C+moments%2C+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 282, C595-C605 (2002).</li>
<li>Dessalles, C. A., Leclech, C., Castagnino, A., Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+substrate-+and+flow-derived+stresses+in+endothelial+cell+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Integration of substrate- and flow-derived stresses in endothelial cell mechanobiology.</a> Commun Biol. 4, 764(2021).</li>
<li>Ji, G., Barsotti, R. J., Feldman, M. E., Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-induced+calcium+release+in+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stretch-induced calcium release in smooth muscle.</a> J Gen Physiol. 119, 533-543 (2002).</li>
<li>Davis, M. J., Meininger, G. A., Zawieja, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-induced+increases+in+intracellular+calcium+of+isolated+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stretch-induced increases in intracellular calcium of isolated vascular smooth muscle cells.</a> Am J Physiol. 263, H1292-H1299 (1992).</li>
<li>Naruse, K., Sokabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+stretch-activated+ion+channels+in+Ca2%2B+mobilization+to+mechanical+stretch+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of stretch-activated ion channels in Ca2+ mobilization to mechanical stretch in endothelial cells.</a> Am J Physiol. 264, C1037-C1044 (1993).</li>
<li>Arold, S. P., Bartol ák-Suki, E., Suki, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+stretch+pattern+enhances+surfactant+secretion+in+alveolar+type+II+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Variable stretch pattern enhances surfactant secretion in alveolar type II cells in culture.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L574-L581 (2009).</li>
<li>Cell stretching bioreactors. , Flexcell International. 
 <a target="_blank" href="https://www.flexcellint.com">https://www.flexcellint.com</a> (2024).</li>
<li>Mitrossilis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+response+to+stiffness+exhibits+muscle-like+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell response to stiffness exhibits muscle-like behavior.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18243-18248 (2009).</li>
<li>Parameswaran, H., Lutchen, K. R., Suki, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computational+model+of+the+response+of+adherent+cells+to+stretch+and+changes+in+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">A computational model of the response of adherent cells to stretch and changes in substrate stiffness.</a> J Appl Physiol. 116, 825-834 (2014).</li>
</ol>

所有作者均声明不存在任何竞争利益。

在本方案中，我们描述了一种新型显微镜兼容性细胞拉伸装置的设计、开发、验证与实施，该装置可在实时成像活细胞的同时模拟各向同性与单轴应变。该设备结构紧凑，可安装于 Leica DMi8 显微镜载物台上，所有运动部件均被限制在单一平面内，从而在维持对基底及下方细胞聚焦的同时实现活细胞成像。该设计采用受二维 Hoberman 球体几何结构启发的倾斜臂结构。这种二维构型将运动限制在单一平面内，对于在活细胞成像过程中维持显微镜聚焦至关重要。该几何结构可实现大应变，并允许将旋转运动简单地转化为线性运动。八个支柱的中心排列方式使该装置在可施加的机械应变类型方面具有灵活性。尽管所有八个支柱均对称运动，但通过选择性地将特定支柱连接至基底，同一平台即可实现各向同性与单轴应变的施加。
该实验方案中有多个步骤对实验成功至关重要。在将固化的PDMS凝胶从模具上取下时需格外小心，避免撕裂，因为薄层膜较为脆弱。NuSil涂层必须涂覆于水平表面，以确保厚度均匀；若凝胶不平整，将无法使整个目标区域处于显微镜的成像平面上。PDMS和NuSil必须充分脱气，以防止产生气泡，气泡会影响光学透明性，并在基底中形成薄弱点。在从...

细胞会受到来自周围环境的机械力作用，这些机械力在调控细胞功能的诸多方面发挥着关键作用，包括决定细胞命运1，2、细胞间通讯3，4以及正常生长2，5。此外，这些机械力的变化可能导致疾病进展加剧或疾病的发生，包括细胞外基质（ECM）重塑6和肿瘤生长7，8，9，10。细胞能够感知并响应这些机械信号，其中包括细胞外基质（ECM）刚度的变化4，以及心脏、肺和肌肉等器官中的周期性应变11，12。体外研究表明，ECM的刚度和组成可影响细胞骨架的刚性，无论是在静息状态下还是在接触收缩性激动剂之后13。大量体外和原位研究已探讨了瞬时、静态和周期性应变如何影响细胞和组织，结果表明细胞响应依赖于应变类型、速率和幅度14。例如，近期研究发现，短暂拉伸会以与施加应变成正比的方式降低贴壁细胞的刚度，而持续增加应变则会导致刚度先迅速升高，随后逐渐松弛15。此外，作为力生成主要分子调节因子的钙信号通路也会受到拉伸及其他机械力的影响4，16，17，18，19，20。研究刚度和应变如何影响力学生物学通路，需要在监测细胞响应的同时对这两个因素进行调控。因此，我们开发了一种新型的显微镜兼容细胞拉伸装置，能够诱导各向同性或单轴拉伸，并可独立控制基底刚度、基质蛋白包被以及多种可编程波形。
过去，研究人员已开发出类似的装置，用于对细胞培养物和组织施加特定的运动和机械拉伸21，22。最简单的情况是单轴运动，即在单一维度上施加机械拉伸。例如，已有部分装置被设计用于对组织条带23和胶原纤维24施加机械拉伸和应变，或用于调控细胞取向并诱导细胞迁移25。各向同性拉伸是指从各个方向对凝胶或基底施加相等的力，从而导致材料内部产生均匀的应变。这种拉伸方式可模拟细胞在某些生理环境中所经历的均匀受力状态，例如肺泡内部的细胞在呼吸过程中会受到径向的扩张和收缩作用26，27。
现有的拉伸装置存在多种局限性，限制了其在力学生物学相关研究中的应用。许多设计采用超出典型生理范围的基底刚度，以承受机械应变并支撑细胞培养基的重量28。然而，使用此类非生理性的刚度可能也会影响细胞行为，从而可能降低模型对天然组织环境的适用性29。此外，一些拉伸装置会遮挡物镜或光路，妨碍成像，而另一些则使用过厚的膜，不利于清晰观察28。即使拉伸装置与显微镜兼容并使用薄基底，膜下垂和失焦等问题仍较为常见。商用平台（如Flexcell）采用基于真空的形变方式来拉伸柔性膜。尽管该方法可产生稳定且均匀的应变场，但其并未针对活细胞显微成像进行优化，且与显微镜兼容的配置需要昂贵的附加配件。&#160;此外，这些平台的最大应变仅能达到21.8%30，而深吸气时产生的应变可超过30%，在哮喘和慢性阻塞性肺疾病（COPD）等疾病中甚至可观察到更高的应变值31。
因此，我们设计了一种新型的细胞拉伸装置，该装置能够精确控制基底刚度和细胞外基质（ECM）成分，同时可对贴壁细胞施加可变的各向同性或单轴应变。该平台非常适合需要在生理相关刚度的基底上进行力学刺激并同时开展活细胞成像的机械生物学研究者。该装置采用一种受二维霍伯曼球（Hoberman sphere）几何结构启发的机械驱动方式，通过剪刀状关节实现扩张与收缩（图1，补充图1）。单个步进电机通过连杆机构驱动16个呈放射状排列的臂，从而协调带动8个固定柱的同步伸缩。该结构通过同时对所有固定柱施加相等的径向位移，产生均匀的面内应变。该装置独特的设计和紧凑的结构使其能够在倒置荧光显微镜下对细胞进行面内各向同性和单轴拉伸过程中的活细胞成像，且成本仅为商用设备的一小部分。线性步进电机由定制的Arduino程序控制，可实现周期、振幅可调的可编程循环波形。在本研究中，我们证明该装置可提供精确且可重复的应变，范围从低于1%至15%，其几何形变能力超过200%。此外，我们还量化了机械拉伸对原代人支气管平滑肌细胞内钙动力学及细胞牵引力的影响。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔&amp;rsquo;s medium/F12</td><td>Fisher Scientific</td><td>12634010</td><td>500 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>(4-苯甲酰基苄基)三甲基氯化铵（PLPP）</td><td>Alv&amp;eacute;ole</td><td>N/A</td><td>14.5 mg/mL</td></tr><tr><td>0.1% 荧光素偶联明胶&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>G13187</td><td></td></tr><tr><td>0.1% 明胶溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ES-006</td><td>500 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1 &amp;mu;直径为 m 的红色荧光羧基修饰微球</td><td>FluoSpheres</td><td>F8816</td><td></td></tr><tr><td>1&amp;times; MEM非必需氨基酸溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7145</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>1&amp;times; 青霉素/链霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>10% 胎牛血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A5256701</td><td>500 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>1x 谷氨酰胺&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10010CM</td><td></td></tr><tr><td>1x 胰岛素-转铁蛋白-硒生长添加剂</td><td>康宁生命科学</td><td>25-800-CR</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td>25 &amp;mu;克/升</td></tr><tr><td>滚珠轴承</td><td>McMaster-Carr&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>载物台导轨</td><td>McMaster-Carr&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>FLIPR Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 6</td><td>Molecular Devices</td><td>R8190</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>Dotmatics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>火腿&amp;rsquo;F-12 培养基&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8641</td><td>500 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hanks' 平衡盐溶液&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14025092</td><td>500 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES缓冲液&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15630080</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Leonardo 软件</td><td>Alv&amp;eacute;ole</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>甲氧基聚乙二醇&amp;ndash;琥珀酰亚胺戊酸酯（mPEG-SVA）</td><td>莱桑生物公司</td><td>N/A</td><td>50 mg/mL</td></tr><tr><td>Nusil Gel-8100</td><td>Nusil&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>263991</td><td>90 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10010023</td><td>500 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸（PLL）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>500&amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>原代人支气管平滑肌细胞&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>PCS-130-011</td><td></td></tr><tr><td>PRIMO 光学模块&amp;nbsp;</td><td>Alv&amp;eacute;ole</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>螺钉</td><td>McMaster-Carr&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SigmaStat</td><td>Systat Software</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>旋涂仪</td><td>劳雷尔</td><td>Model WS-650MZ-23NPPB</td><td></td></tr><tr><td>担架与载物台连接组件&amp;nbsp;</td><td>波士顿大学科学仪器设施</td><td>N/A</td><td>不锈钢</td></tr><tr><td>Sylgard 184 基础弹性体与固化剂试剂盒</td><td>道</td><td>H047J8Q026</td><td></td></tr><tr><td>T-25 组织培养瓶 - 透气盖，无菌</td><td>CellTreat</td><td>229331</td><td></td></tr><tr><td>压舌板&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>22-363-154</td><td></td></tr></tbody></table>

一种新型平台 体外 细胞拉伸与成像

A Novel Platform for In Vitro Cellular Stretching and Imaging

细胞对外界环境中的力学信号产生响应，例如细胞外基质（ECM）刚度和周期性应变的变化，这些信号可调控细胞命运决定、细胞间通讯以及发育等细胞过程。这些力学信号的改变在哮喘、高血压和癌症等疾病的发生和发展中起到促进或驱动作用。尽管现有方法 体外 拉伸装置可施加单轴或各向同性应变，但通常使用非生理性的刚度，限制活细胞成像，或无法达到与生理及病理条件相关的高应变幅度。本文介绍一种紧凑型、与显微镜兼容的拉伸装置，可对弹性培养皿上的贴壁细胞施加可控的各向同性或单轴应变。这些培养皿具有可调的杨氏模量's模量，并可兼容多种用于细胞黏附的基质蛋白涂层，从而能够独立调控基底刚度和细胞外基质（ECM）成分。重要的是，该装置'其操作简便性得益于由步进电机驱动的设计，可支持生成可编程的周期性波形。我们展示了该设备'通过量化原代人支气管平滑肌细胞在机械拉伸条件下的细胞内钙动力学和细胞牵引力，评估其功能能力。该平台为研究机械信号在健康和疾病相关背景下对细胞功能的影响提供了多功能工具。

细胞拉伸装置可诱导宏观面积变化，以反映局部形变。为评估各向同性行为，我们在可拉伸细胞培养孔中，对各向同性基底上形成的荧光明胶蛋白图案“BREATHE”及其各个字母的面积变化进行了测量。结果表明，该单词整体及各个字母均表现出相等的面积变化图3A，B）。在 图3B蓝色圆圈及误差线表示在位移间隔为 400 µm 时测量的七个字母面积的均值和标准差。橙色方块对应于单词总面积的各个单独测量值 "呼吸" 当基底被拉伸和释放时。以测量区域（字母 vs. 单词）和线性位移为独立因素的双因素方差分析显示，两者之间无显著交互作用（P = 0.743）。
为了研究拉伸和释放过程中的定向形变，我们计算了各区域相对于其初始值归一化的偏心率。结果显示，在整个拉伸过程中，字母和完整单词的偏心率均保持不变，且在任何位移下均无显著差异。以字母/单词身份和位移为因素进行的双因素方差分析证实，不同位移...

本文介绍了一种新型装置，该装置能够在支持细胞于刚度可调且蛋白基质可定制的基底上培养的同时，向细胞施加各向同性和单轴应变波形。这一结构简单且经济的实验平台使研究人员能够在基础研究和与疾病相关的环境中探究机械信号如何调控细胞功能。

细胞会响应来自其环境的机械信号，例如细胞外基质（ECM）硬度和周期性应变的变化，这些信号可调控……

我们的目标是开发一种低成本、受霍伯曼结构启发的显微镜兼容细胞拉伸装置，用于研究机械拉伸如何影响细胞功能。该装置使研究人员能够观察活细胞对机械刺激的反应，模拟诸如跳动的心脏或呼吸的肺等生理系统。开始实验前，请穿戴适当的个人防护装备。在塑料培养皿中按10:1的比例混合Silgard 184基础剂与固化剂。使用压舌板剧烈搅拌组分2至3分钟。随后将培养皿置于脱气室中处理1小时。接下来，取制备好的3D打印模具，将1.3克PDMS混合物加入各向同性模具中，然后向单轴模具中加入0.5克PDMS混合物。将凝胶均匀铺展至整个模具，并对注满的模具抽真空处理一小时。将模具中的凝胶在室温下于平坦表面静置两小时。然后在60摄氏度的烘箱中过夜固化模具。接着，按相等比例混合NuSil凝胶8100的A组分和B组分。将混合凝胶与Silgard 184交联剂按总体积的0.36%混合，以制备硬度为13千帕的基质。若要制备硬度为0.3千帕的柔软基质，则跳过添加交联剂的步骤，然后将溶液旋转混合15分钟。将NuSil混合物置于脱气室中，脱气30分钟。现在小心地将PDMS凝胶从定制模具中取出，放置在40毫米的盖玻片上，注意不要撕裂。接着将PDMS凝胶放入旋涂仪中。用移液器吸取100微升NuSil混合物，滴加到各向同性PDMS凝胶的负性区域。然后将50 µL的NuSil混合物移液至单轴PDMS凝胶的负区域。随后在7 G条件下离心50秒，以获得100 µm的厚度。将包被的凝胶在室温下置于平坦水平表面静置两小时。将凝胶放入烘箱中，在60摄氏度下过夜固化。随后在弹性细胞培养孔中接种人气道平滑肌细胞，并在标准条件下进行培养。随后，将细胞与FLIPR钙离子六号溶液混合用于成像。对于牵引力测量，需在PDMS NuSil凝胶基底上包被一层荧光微珠作为标记点。用HBSS配制浓度为0.025%、直径为一微米的红色荧光羧基修饰微球溶液。使用涡旋混合器将珠子溶液涡旋混匀10秒。然后用移液器将880 µL珠子溶液加入各向同性凝胶中。将420 µL珠子溶液加入单轴凝胶中。将凝胶在室温下孵育一小时后，小心移除珠子溶液以保持珠子分布均匀。然后使用棉签或实验室擦拭纸轻轻吸去凝胶表面残留的溶液。接下来，使用配备相机、光源和10倍干物镜的倒置显微镜进行观察。将激发波长设为475±40纳米，发射波长设为555±50纳米。在拉伸实验期间，以每秒2帧的速率采集16位图像。现在将各向同性凝胶放置于拉伸装置上，然后使用配备10倍干式物镜的倒置显微镜对荧光微珠成像，采集拉伸前状态的图像。在整个拉伸过程中，持续采集基底中心区域的图像。若有必要，在拉伸位置重新对焦显微镜后再进行图像采集。使用基于傅里叶牵引力显微技术的自定义 MATLAB 代码分析图像，以计算位移矢量及相应的平面应变场。将数据表示为末次试验的平均值。施加240微米的位移导致荧光微珠从中心径向向外移动。牵引力显微镜显示了一个各向同性的位移场，其矢量从中心向外辐射，并随距离增加而增大。各向同性的位移场产生了一个均匀的平面应变场。将位移增加至1000微米后，位移矢量的幅值增大，同时保持径向排列。在1000微米条件下的相应应变场，其幅值随之增大，但仍保持径向对称性。在经受250微米位移的单轴凝胶中，位移矢量主要沿单一轴线排列，与单轴应变一致。应变波形与程序设定的电机位移高度一致，并在三次重复循环中保持同步。在最大位移时的应变值在三个独立样本中保持一致。施加最高达 5,555 微米的瞬时位移，可产生从大于 0.1% 到 12% 的应变。瞬时 0.5% 的应变可诱导细胞内钙离子浓度升高，在拉伸后表现为荧光强度增加。利用我们的拉伸装置，研究人员可开展活细胞钙成像、牵引力显微镜观察，并量化细胞对各向同性或单轴拉伸的力学响应。一个关键步骤是确保凝胶在水平表面上固化，因为厚度不均可能导致基底偏离焦平面，从而在活体成像过程中降低光学清晰度。未来的研究可探讨拉伸诱导的细胞骨架重定向、与哮喘或肺损伤相关的病理性应变条件，以及不同细胞类型中的此类现象。

a-novel-platform-for-in-vitro-cellular-stretching-and-imaging

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

体 外 细胞拉伸与成像的新平台

本文介绍了一种新型拉伸平台，可用于研究单个细胞对复杂各向异性双轴机械变形的响应，并量化生物组织的力学特性。...

一种用于细胞与组织力学生物学研究的新型拉伸平台

我们报道了一种用于研究细胞和胚胎的装置及新方法。单个细胞被精确地排列在微腔阵列中。这种三维限制更接近生理条件下的三维环境，有助于细胞器的定向排列。通过控制细胞形态，该装置可最大限度地减少标准检测中常见的变异性。...

在三维限域中排列单细胞与单胚胎：一种用于高内涵筛选的新装置

本研究开发了一种新型成像方案，采用定制的电机驱动机械执行器，可实现对活细胞在机械应变下的实时响应进行测量。该系统适用于力学生物学研究，能够施加高达20%的应变，同时支持使用共聚焦显微镜或原子力显微镜进行近实时成像。...

活细胞成像在机械拉伸过程中的应用

利用先前设计的装置对贴壁细胞施加机械应变，本文描述了一种重新设计的基质几何结构以及一种定制设备，可用于使用100倍油浸物镜对受应变细胞进行高分辨率单细胞成像。...

在单轴拉伸应变下单个活细胞核动力学的高分辨率成像

本方法涉及在允许活细胞共聚焦显微镜观察的同时，对嵌入硅橡胶中的三维软水凝胶进行单轴拉伸。文中展示了对外部和内部水凝胶应变以及纤维取向的表征。所开发的装置与实验方案可用于评估细胞对不同应变条件的响应。...

活体显微成像下三维水凝胶的可控应变

本研究展示了一种灵活的实验方案，采用微孔板格式的荧光标记弹性可收缩表面（FLECS）技术，通过可视化荧光蛋白微图案的位移，实现对单细胞收缩力的简化、免手动定量分析。...

使用微图案化弹性体进行单细胞收缩力的简化高通量分析

本文介绍了一种多功能等双轴拉伸装置，该装置由气动驱动，且兼容高分辨率显微镜成像。...

用于高倍率活细胞共聚焦荧光显微镜观察的双轴拉伸装置

在许多生物学和临床情境中，研究细胞过程在其天然微环境中的动态演变具有显著优势。本文介绍了低成本光纤显微镜的组装及其应用，该显微镜可实现实时成像，适用于细胞培养、动物实验以及临床患者研究。...

高分辨率光纤微内窥镜技术用于 原位 细胞成像

本方案将演示从细胞中提取和分析游离及酯化生物活性脂肪酸的方法。采用稳定同位素稀释法、手性液相色谱-电子捕获大气压化学电离多反应监测质谱法（SID-LC-ECAPCI-MRM/MS）对脂肪酸进行准确定量。...

细胞脂质提取用于靶向稳定同位素稀释液相色谱-质谱分析

黑腹果蝇 幼虫因其半透明的角质层和强大的遗传学工具，成为活体成像的理想模型系统。本方案描述了如何利用一种单层聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置，即“幼虫芯片”，对3龄幼虫神经元中的细胞过程进行活体成像rd 龄期 果蝇...

使用微流控芯片进行活体成像及损伤反应研究 果蝇 幼虫

了解一种低成本、显微镜兼容的细胞拉伸平台，用于研究原代人气道平滑肌细胞在机械拉伸下的钙信号和牵引力变化。该装置支持各向同性和单轴拉伸，适用于机械生物学和疾病机制研究。

一种新型平台体外细胞拉伸与成像

探索更多视频

一种新型平台 体外 细胞拉伸与成像

探索更多视频

一种新型平台体外细胞拉伸与成像