在地吉顿素通透化的BE（2）-C神经母细胞中，依赖胆碱能配体的氧化磷酸化偶联调节
April 28th, 2026
我们提出了一种选择性通透性质膜的方案，使底物和抑制剂能够靶向递送，以评估培养细胞中的线粒体氧化磷酸化（OXPHOS），克服通常阻碍此类分析的质膜运输障碍。利用该技术，我们展示了OXPHOS功能如何被毒蕈碱激动剂和拮抗剂调节。
本实验的总体目标是展示一种方法，利用选择性渗透和底物抑制剂组合，评估完整培养神经母细胞瘤细胞中的线粒体生物能量。传统上，线粒体呼吸通过Oroboros O2K高分辨率呼吸仪、Clark型氧电极和Seahorse XF分析仪等仪器进行评估。依赖组织或细胞分离或富集线粒体分数的传统方法，往往会损害线粒体结构。
例如，这张从小鼠皮层分离出线粒体的透射电子显微镜图像，显示出线粒体是否被包覆在突触前末端的结构完整性上存在明显差异。仍被包裹在突触前末端的线粒体结构上保持完整，如图中青色箭头所示。相比之下，未被包裹或缺乏膜结构的线粒体通常会变形，如黄色箭头所示。
Seahorse Flex分析仪常用于研究培养细胞和分离线粒体中的线粒体生物能量学。在培养细胞分析中，细胞结构和信号网络得以保留。然而，完整细胞的质膜对许多三羧酸循环底物是不透水的。
这限制了代谢分析的范围，而孤立的线粒体则缺乏质膜屏障，但通常表现出结构伪影。因此，这两种系统都有固有的局限性。这里展示的技术利用了质膜富含胆固醇，而线粒体膜胆固醇含量极低的事实。
通过使用如地地酮素等胆固醇结合洗涤剂，我们可以选择性地渗透质膜，同时保留线粒体膜完整。这种方法允许线粒体底物和抑制剂在不损害细胞器完整性的情况下受控进入细胞。因此，该技术能够在完整细胞背景下进行线粒体的功能分析，结合了全细胞结构的优势与分离线粒体检测的可及性。
从细胞的亚汇流培养皿开始实验。用无菌磷肥缓冲液轻柔清洗细胞，加入适当量的Triton溶液，使细胞单层均匀覆盖。孵育后，取出盘子，轻轻敲击或横向摇晃，帮助细胞脱落。
使用5毫升移液器和移液器控制器，将细胞悬浮液上下移液多次，以破碎任何团块，实现单细胞悬浮。在显微镜下观察细胞悬浮液，以确认单细胞悬浮液是否均匀。使用血细胞计或自动计数器计数细胞。
调整细胞浓度，使100微升的悬浮液中约含有10,000个细胞。小心地将100微升的细胞悬浮液注入Seahorse XF检测板的每个孔中。留一口空井作为测验时的背景控制。
将平板放入细胞培养箱中孵育两到三小时，使细胞能够附着在孔底。细胞连接完成后，轻轻向每个孔加入300微升的检测培养基。将平板放回培养箱，过夜孵育，让细胞稳定生长。
确保每个井底部的单元形成均匀的单层。避免过度拥挤。细胞应保持融合，但不应过于集中，以确保检测性能最佳。
实验前一晚，通过在每个孔中加入一毫升校准缓冲液来给XFp 24传感器滤芯加水。或者，你也可以使用磷酸盐缓冲盐水，pH值为7.4。把烟弹放在床上，放在室温下过夜。
无需在非COT培养箱中37摄氏度孵育，因为装填过程中弹匣会平衡至室温。召集所有冷冻液，并用2个室温微胶质细胞检测缓冲液。检查pH值，应该是7.4。
必要时调整。准备所有底物和注射液，并再次检查pH值。所有溶液都要冰冻保存，直到使用。
准备标有A、B、C、D的食品管，用于传感器筒注射口溶液。最好为每个端口制备含有相应抑制剂或底物的溶液。使用多通道移液器，小心地将每个注射口溶液50微升装入相应的A到D端口。
在实验开始前一到两小时启动海马生物分析仪，让内部孵化器稳定在37摄氏度。根据你的实验设计和Wave Desktop 2.6指南给每个井标注和分组。为生物分析仪编程，使其达到合适的比例、重量和测量周期。
参考见表8。在测量周期开始时关闭平衡选项非常重要。继续使用会不必要地延长实验时间，并可能消耗基材。
启动 机器首先校准传感器磁带，约需15分钟。在将传感器卡带放入校准后，立即开始准备电池板。在每个有粘附细胞的孔处，小心地在约700微升的1x线粒体检测缓冲液中抽取缓冲液，并让板子静置一分钟以达到平衡。
小心从每个孔中抽取缓冲液，同时不扰动粘附的细胞。重复洗衣机步骤三次以确保完全中介。同时，在无细胞的背景阱中加入50微升线粒体检测缓冲液。
用半月板作为体积一致性的视觉参考。小心从含细胞孔抽取缓冲液，留约50微升以维持细胞水分。在37摄氏度下孵育板，要么在水浴中保持其在水面以上，要么置于非钢制培养箱中，配合饱和的大气以防止蒸发。
在装入分析仪前，每孔加入450微升预热线粒体检测缓冲液，内含检测底物、抑制剂或药物，使总体积达到500微升。该板现已准备好使用Seahorse生物分析仪中校准的传感器卡带进行检测。首先，我们进行耦合测定，以检查电子传递系统与氧化磷酸化之间的耦合程度。
耦合检测有助于区分线粒体功能与功能障碍。在这张线粒体电子传递系统的示意图中，我们展示了复合体第一、第三和第五特异性抑制剂，以及不同底物（如丙酮酸或苹果酸）的节点，以及琥珀酸，将电子捐赠给系统。该可视化有助于理解测定的运作方式以及各种底物和抑制剂的作用。
我们首先考察两种不同浓度的地吉托宁，5微摩尔和10微摩尔，评估它们在促进电子穿越质膜和实现偶联测定的有效性。在该检测中，通过依次测量琥珀酸作为底物和螺环酮作为复合一抑制剂的氧气消耗率，评估呼吸联结水平。随后依次注射ADP、寡霉素、FCCP和抗霉素A，每次注射后记录OCR测量。
左侧面板展示了瞬态微室内氧张力的折线图。通常，该值应保持在100至200毫米汞柱之间，以确保传感器动态范围内的检测。这些数据集是通过安捷伦波软件中的点对点模式生成的，该模式在测量期间以一系列速率显示OCR数据，从而可视化动态变化，特别是10微摩尔的地尖素增加了肉烩的运输，而5微摩尔增加，导致微型腔室内的氧气张力降低，相应地提高氧气吸收量。
将这些实验数据绘制得出，介导的基底呼吸在10微摩尔的digitonin中显著高于5微摩尔，表明在高浓度下通过渗透性质膜的粘液运输效率更高。基于这一观察，鉴于10微摩尔digitonin提供了最佳通透性，我们随后将细胞数减少到每孔20,000个，以降低基础呼吸。这一调整确保了任何药物或底物引起的呼吸增强都保持在系统的动态检测范围内。
在极高浓度和细胞数优化后，进行下一次偶联检测以评估毒蕈碱激动剂和拮抗剂对线粒体呼吸的影响。该组实验的一个重要发现是，在未处理的地基酮细胞中，由琥珀酸驱动的第二至四个复合体以及State-3和State-3u呼吸的基底呼吸显著减少。这表明琥珀酸未在非渗透条件下被转运到细胞内。
通过绘制多项独立实验的数据，发现毒蕈碱拮抗剂阿托品在神经母细胞瘤细胞中由第二至四个复合物介导的基底呼吸显著减少，而毒蕈碱激动剂乙酰胆碱则维持较高呼吸水平。此外，State-3和State-3u呼吸在非渗透细胞中显著低于渗透细胞，强调了digitonin在选择性渗透质膜而不损害线粒体功能方面的有效性。电子流动分析法评估电子向线粒体电子传递链的顺序转移，有助于识别线粒体功能障碍或调制机制。
在检测的初期阶段，细胞用丙酮酸、苹果酸酯和FCCP处理，诱导由1至4号复合物驱动的高水平脱离呼吸。随后添加回旋酮抑制了复合物1，降低了基础呼吸，并分离了复合物2到4的活性。虽然我们在药物治疗条件下未观察到显著差异，但一个重要观察是琥珀酸驱动的State-3u呼吸在非渗透细胞中显著降低，表明digitonin在促进肉桂进入细胞中的关键作用。
总之，该方案为研究线粒体生物能学提供了可靠的途径。它结合了全细胞结构的生理相关性与分离线粒体检测的精确性，实现底物和抑制剂的受控递送，同时保持细胞器完整性。通过优化地基酮浓度和细胞密度，研究人员可以实现准确且可重复的测量。
这种可适应的方法非常适合探索受体介导的线粒体功能调节，并为疾病研究和药物发现提供了强大的平台。
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Overview
This study evaluates oxidative phosphorylation (OXPHOS) function in cultured cells by using defined substrate–inhibitor combinations, while preserving cellular structure and cytosolic context. The approach overcomes limitations of intact cell assays by employing digitonin-mediated selective plasma membrane permeabilization, enabling direct assessment of mitochondrial respiration through specific electron transport chain (ETC) entry points.
Key Study Components
Area of Science
- Cellular bioenergetics
- Mitochondrial physiology
- Pharmacology
Background
- OXPHOS function is commonly assessed in isolated mitochondria, which lose cellular context.
- Intact cells are poorly permeable to several Krebs cycle intermediates, limiting substrate-supported respiration studies.
- Selective permeabilization can expand substrate accessibility while retaining cellular architecture.
- Pharmacologic modulation of mitochondrial respiration is relevant for understanding drug effects.
Purpose of Study
- To assess OXPHOS function in cultured cells using defined substrate–inhibitor combinations.
- To retain cellular structure and cytosolic context lost in isolated mitochondrial preparations.
- To evaluate the impact of selective permeabilization on substrate accessibility and pharmacologic modulation.
Methods Used
- Digitonin-mediated selective plasma membrane permeabilization of cultured cells.
- Extracellular flux analyzer–based coupling and electron flow assays.
- Empirical titration of digitonin in BE(2)-C neuroblastoma, HEK293, and primary rat dorsal root ganglion (DRG) neurons.
- Use of substrate–inhibitor combinations (e.g., succinate + rotenone) to isolate specific ETC-driven respiration.
Main Results
- Permeabilized cells showed increased Complex II–IV-driven oxygen consumption with succinate and Complex I inhibition, indicating improved substrate access.
- Substrates entering via endogenous transport pathways (e.g., pyruvate/malate) showed smaller differences between permeabilized and non-permeabilized cells.
- Muscarinic ligands produced agonist- versus antagonist-associated differences in oxygen consumption in coupling assays.
- Electron flow assays revealed minimal ligand-associated effects under tested conditions.
Conclusions
- Selective permeabilization enhances substrate accessibility in cultured-cell bioenergetic assays.
- This approach enables detailed analysis of pharmacologic modulation of mitochondrial respiration.
- Ligand effects are more detectable at the level of coupling-defined respiratory states than maximal electron transfer capacity.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Selective plasma membrane permeabilization in cultured neuroblastoma cells enables direct interrogation of mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) coupling and pharmacologic modulation within a preserved cellular context. This approach addresses a key discovery-stage challenge by expanding substrate accessibility and supporting mechanistic de-risking of mitochondrial function. The method enhances predictive confidence for target validation and early-stage portfolio triage in neurodegenerative and metabolic disease research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct assessment of mitochondrial respiratory chain activity in disease-relevant cell models.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing ligand effects on coupling versus maximal electron transfer.
- Facilitates functional target validation for mitochondrial modulators in a controlled cellular environment.
Screening & Assay Development
- Provides a platform for quantitative, reproducible measurement of OXPHOS coupling states using defined substrate–inhibitor combinations.
- Improves assay standardization by controlling substrate entry and respiratory state transitions.
- Enables screening of pharmacologic agents for mitochondrial modulation with enhanced sensitivity to coupling changes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro bioenergetic profiling with disease-relevant cellular systems for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement of mitochondrial-targeted compounds by clarifying pharmacodynamic effects.
- Provides mechanistic insight into ligand-dependent modulation of cellular respiration relevant to preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to lead identification and preclinical validation for mitochondrial modulators.
- Discovery Biology: Expands hypothesis testing by enabling direct measurement of ETC complex-specific respiration in permeabilized cells.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible OXPHOS coupling data for compound evaluation and assay development.
- Analytics: Provides oxygen consumption readouts that differentiate between coupling states and maximal electron flow.
- Translational Research: Maintains cellular context for pharmacologic studies, supporting biomarker alignment and disease relevance.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable assay platform adaptable across cell types and mitochondrial targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in mitochondrial target validation and mechanistic de-risking.
- Operational Value: Enhances assay reproducibility, standardization, and scalability for screening campaigns.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying pharmacologic effects on OXPHOS coupling versus maximal capacity.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of mitochondrial modulators for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell permeabilization and extracellular flux analysis.
- Needs access to extracellular flux analyzers and validated substrate–inhibitor reagents.
- Demands cross-team standardization of permeabilization and assay conditions for reproducibility.
- Adaptable to multiple cell types with empirical optimization of permeabilization parameters.
- Limited to in vitro cellular models; does not capture whole-organism pharmacodynamics.
