Name: 整个 秀丽隐 杆线虫L4幼虫的染色质可及性分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-17T13:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 了解针对秀丽隐杆线虫L4幼虫优化的ATAC-seq染色质可及性分析方法。该方案克服了胶原蛋白角质层的技术障碍，仅需30微升虫体沉淀即可在一天内完成全基因组染色质开放性图谱构建，为研究表观遗传调控提供高效工具。

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J Hersch-González 获得了墨西哥国家人文、科学与技术理事会（CONAHCYT，现为科学、人文、技术与创新部 SECIHTI）的博士奖学金（#CVU 846476）。J Hersch-González 还获得了 CONAHCYT（现为 SECIHTI）奖学金（788519）的支持。本项目得到了 PAPIIT-UNAM 基金（项目编号 IN217824）以及 SECIHTI 基金（项目编号 CBF-2025-I-2275）对 VJV 的资助。在 IFC，我们感谢以下单位及人员：分子生物学单位（UBM）的 Laura Ongay-Larios、Guadalupe Códiz Huerta 和 Minerva Mora Cabrera；分子生物学与免疫学单位（UBMI）的 Augusto César Poot-Hernández 和 Carlos Peralta Alvarez；以及计算、影像、车间和图书馆部门。我们衷心感谢线虫遗传学中心（CGC）提供本研究所用的菌株。CGC 由美国国立卫生研究院研究基础设施项目办公室（NIH Office of Research Infrastructure Programs，P40 OD010440）资助。

建议始终佩戴手套。
注意：第1天： 制备同步化的线虫群体。所有线虫均在接种有大肠杆菌OP50的NGM平板上培养。 E. coli OP50。开始前所需物品（每个样品或菌株）：一个90 mm或两个60 mm成虫培养板，一个90 mm或两个60 mm带食物的培养板，M9无菌缓冲液27 (3 g KH2PO4，6 g Na2HPO4，5 g NaCl，1 ml 1 M MgSO₄4，H20至1升。经高压灭菌消毒
1. 蠕虫的收集
<ol>
	<li>取一个90 mm（或两个30 mm）培养皿，其中含有线虫的成虫群体。</li>
	<li>用M9缓冲液重悬线虫，并转移至15 mL离心管中。</li>
	<li>重复上一步骤，以回收培养皿中的全部线虫。</li>
	<li>让线虫在15 mL离心管中静置约1分钟，然后小心吸除上层M9缓冲液。</li>
	<li>确保线虫体积约为1 mL。</li>
</ol>
2. 漂白
<ol>
	<li>加入 5 mL M9 缓冲液 + 650 µL 5M NaOH + 1,300 µL 家用漂白剂（5% NaClO 溶液）。</li>
	<li>涡旋振荡，最大速度下振荡 1–2 分钟（不超过 2.5 分钟）。</li>
	<li>在室温下以 1,000 × g 离心 1 分钟。</li>
	<li>移除上清液，并加入 9 mL M9 缓冲液。</li>
	<li>重复步骤 2.3 和 2.4，共再进行五次。</li>
	<li>将胚胎重悬于 7 mL M9 缓冲液中。 
	注意：漂白步骤的效率可能因温度和市售漂白剂的类型而有所不同28。</li>
</ol>
3. 卵在M9（液体）中过夜孵化
<ol>
	<li>确保装有漂白后卵的收集管已正确封闭。</li>
	<li>将试管置于20 °C下缓慢振荡（例如，放入20 °C室温环境中的摇床内）。</li>
	<li>线虫将在过夜后孵化，并停滞于L1阶段。 
	注意：试管放置时间不要超过12小时。</li>
</ol>
第2天：线虫的生长：复苏L1期线虫。
<ol>
	<li>从摇床中取出试管，在显微镜下确认存在 L1 期线虫。</li>
	<li>将试管在室温下垂直静置约 1 小时。</li>
	<li>吸去上清液，将约 300 条 L1 期线虫转移至一个 90 mm 或两个 30 mm 的含食物培养皿中。</li>
	<li>将培养皿置于 20 °C 培养箱中，培养 26 小时，使其发育至 L4 期。</li>
</ol>
第5天：第3天——储备液的配制：必须在第3天配制以下溶液，以便在第4天制备新鲜溶液
注意：此步骤可在第2天或第3天进行。
<ol>
	<li>1 mL 10% SDS。</li>
	<li>50 mL 1M HEPES pH 8（高压灭菌）。</li>
	<li>250 mL 20% 蔗糖（高压灭菌）。</li>
	<li>100 mL 2M NaCl：配制（高压灭菌）。</li>
	<li>50 mL 2M KCl（高压灭菌）。</li>
	<li>10 mL 1M CaCl2（高压灭菌）。</li>
	<li>10 mL 1M MgCl2（高压灭菌）。</li>
	<li>100 mL 1M Tris，pH 7.4。</li>
	<li>5 mL 5M NaCl（高压灭菌）。</li>
	<li>500 µL 10% Tween-20。</li>
	<li>500 µL 10% Nonidet P40/IGEPAL。</li>
	<li>100 µL 5% Digitonin（需加热至 65 ˚C 溶解）。</li>
	<li>500 µL 10% BSA（用 0.22 µm 滤器过滤），4 ˚C 保存。 
	第 4 天：L4 期线虫用于 ATAC 
	注意：开始前，请确保准备 25 ˚C 培养箱、4 ˚C 离心机，将 Digitonin 加热至 65 ˚C（用于新鲜缓冲液配制），并备好无菌 M9 缓冲液、无菌 H2O 和 20 µm 滤器。</li>
</ol>
6. 溶液配制
<ol>
	<li>配制新鲜溶液（见表1）。操作L-15 10% FBS和卵缓冲液时，必须在无菌条件下进行，并保持低温。</li>
</ol>
表1：新鲜溶液配制用储备液。 线虫解离和细胞悬浮液方案（第6和第7节）中所用储备液的配制配方。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69791/Table1_JoVE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
7. 线虫解离与细胞悬液制备方案
注意：需要一个90 mm或两个30 mm的培养皿，其中含有同步化的L4期线虫群体。
<ol>
	<li>在20 °C培养箱中培养26小时后，于显微镜下确认大部分线虫处于L4阶段。</li>
	<li>用M9缓冲液从平板上回收所有线虫，并将其转移至1.5 mL离心管中。</li>
	<li>用1 mL无菌H洗涤5次2O 通过让蠕虫在重力作用下自然沉降。</li>
	<li>将装有蠕虫的试管转移至25 °C培养箱中孵育30分钟，以清除肠道内的食物残留。</li>
	<li>取50 µL线虫沉淀，转移至新离心管中。</li>
	<li>加入200 µL新鲜配制的SDS-DTT缓冲液，在管式旋转仪中准确混匀5分钟（不可超过）。</li>
	<li>加入1 mL冷卵缓冲液并轻轻吹打 旋转 使用微量离心机去除上清液，重复6次。</li>
	<li>加入80 µL新鲜配制的蛋白酶（15 mg/mL）。</li>
	<li>使用带滤芯吸头的200 µL移液器将线虫-蛋白酶混合液吹打混匀70次，在室温下孵育15分钟。</li>
	<li>加入800 µL含10% FBS的L-15培养基，500 x g离心5分钟 g 在 4 °C 下。</li>
	<li>加入1 mL含10% FBS的L-15培养基，再次离心。</li>
	<li>重复上一步骤两次。</li>
	<li>移除上清液，并用900 µL含10% FBS的L-15培养基重悬。</li>
	<li>使用20 µm滤器过滤。</li>
</ol>
8. 细胞核分离与染色质标签化
注意：使用经过滤嘴的移液器吸头。开始前：取出 Tn5 缓冲液，使其融化，将恒温金属浴预热至 37 °C，取出 PCR 产物纯化试剂盒（材料表），将 EB 缓冲液置于 37 °C 预热，离心柱的离心步骤应在室温下进行。
<ol>
	<li>将过滤后的细胞悬液在500 × g下离心5分钟 g 在 4 °C 下。</li>
	<li>移除上清液，保留约 50 µL。</li>
	<li>加入45 µL裂解缓冲液（现配），并小心重悬。</li>
	<li>小心加入 50 µL 洗涤缓冲液（不要混匀）。</li>
	<li>离心5分钟，500 x g g 在 4 ˚C 下。移除上清液。将其保持在冰上。</li>
	<li>离心过程中，为每个反应（Rx）按每份样品配制以下Tn5混合液：25 µL Tn5 Buffer29，24.8 µL 无核酸酶水2O，0.2 µL Tn5酶。为多个样本配制主混合液。</li>
	<li>离心后，弃去上清液，将细胞核置于冰上保存。向细胞核沉淀中加入50 µL Tn5混合液，缓慢吹打7次。将样品置于恒温金属浴中，37 °C孵育30分钟，每10分钟轻轻振荡各管一次。 
	注意：取出PCR纯化试剂盒，并将EB缓冲液置于37 °C培养箱中预热。接下来的5个步骤将使用该试剂盒中的缓冲液。</li>
	<li>Tn5 孵育后，加入 300 µL 试剂盒中的 PB 缓冲液（黄色），在涡旋振荡器上以最大速度混匀 25 秒。</li>
	<li>从离心管中取出全部液体，转移至离心柱（紫色，4 °C 保存），室温下最大转速离心 1 分钟。 
	注意：柱子将吸附DNA，因此上清液可放心弃去。</li>
	<li>向离心柱中加入 750 µL PE 缓冲液，在室温下以最大速度离心 1 分钟。</li>
	<li>弃去收集管中的上清液。将柱子放入新的1.5 mL离心管中，重复离心；弃去该1.5 mL离心管。</li>
	<li>将柱子放入新标记的1.5 mL离心管中，于柱子中央加入10 µL 37 °C的EB缓冲液。注意勿触碰柱子。室温静置1分钟。</li>
	<li>室温下以最大速度离心1分钟；切勿在4 °C下进行。</li>
	<li>重复最后两步，总共用 20 µL EB 缓冲液进行洗脱。 
	注意：可选暂停步骤：如需暂停，样品可在 -20 °C 保存。此处，经标签化处理的染色质体积为 20 µL。</li>
</ol>
9. 文库扩增
<ol>
	<li>进行ATAC文库扩增时，需通过实时PCR确定合适的扩增循环数（见表2）。该步骤需在PCR板上进行。</li>
	<li>为确定最终扩增的循环数，应选取扩增曲线前三分之一阶段所对应的循环数。理想情况下，循环数不应超过15。每个样本均需单独估算循环数。 
	注意：qPCR完成后，经转座处理的DNA体积为18 µL。可选暂停步骤：如需暂停，样本可保存于-20 ˚C。</li>
	<li>ATAC文库最终扩增：
	<ol>
		<li>每个样本必须使用不同的Rv引物（请做好记录）。</li>
		<li>每个样本应根据为其估算的循环数（N）进行扩增。</li>
		<li>该PCR反应需在200 µL离心管中进行（见表3）。</li>
		<li>此处含有8 µL转座DNA和50 µL扩增后的ATAC文库。</li>
		<li>可选暂停步骤：如需暂停，样本可保存于-20 ˚C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
表2：首次文库扩增操作说明。 首次文库扩增（第9节）的试剂配方与PCR程序。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69791/Table2_JoVE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表3：ATAC文库最终扩增操作说明。 文库最终扩增的试剂配方与PCR程序（第9节）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69791/Table3_JoVE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
10. 文库纯化
注意：开始前，将磁珠（AMPure、SPRIselect 或自制校准磁珠）从冰箱中取出，使其升至室温。每次使用前均需用涡旋振荡器剧烈混匀磁珠。
<ol>
	<li>准备 1 mL 分子级 80% 乙醇。</li>
	<li>向样本管（其中含有 50 µL）中加入 25 µL（0.5 体积）磁珠，并用移液器混匀。</li>
	<li>室温孵育 10 分钟。</li>
	<li>将试管置于磁力架上静置 5 分钟。</li>
	<li>将上清液（70 µL）转移至新的洁净 200 µL 管中。 
	注意：此步骤中，&#60;200 bp 的 DNA 片段被弃去。</li>
	<li>加入 65 µL（1.3 体积）磁珠，轻轻吹打混匀 10 次。</li>
	<li>室温孵育 10 分钟。</li>
	<li>将试管置于磁力架上静置 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液（试管保持在磁力架上，无需取出）。 
	注意：此时磁珠上保留的是 &#62;200 bp 且 &#60;1000 bp 的 DNA 片段。</li>
	<li>试管仍置于磁力架上，直接在磁珠上方加入 200 µL 新配制的 80% 乙醇，上下吹打数次以洗涤磁珠。</li>
	<li>移除乙醇，并用 200 µL 乙醇重复洗涤一次。</li>
	<li>弃去乙醇，然后打开管盖让磁珠干燥约 2–5 分钟（切勿过度干燥）。</li>
	<li>将样本从磁力架中取出，加入 50 µL 无菌 H2O 重悬磁珠，确保将管壁上的所有磁珠冲洗下来。</li>
	<li>最后，将试管放回磁力架中孵育 5 分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新的洁净试管中。此处获得的为扩增并纯化的 ATAC 文库，可进行保存。 
	注意：文库可在 -20 ˚C 短期保存（最长四周），或在 -80 ˚C 长期保存。</li>
</ol>
11. 片段大小分布
<ol>
	<li>完成最终扩增后，建议将部分样品进行毛细管电泳，以观察片段大小分布模式。</li>
</ol>

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<li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nat. Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li>
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作者声明不存在利益冲突。本手稿的撰写、分析或准备过程中未使用生成式人工智能。

本文介绍了一种在全生命周期L4阶段的Caenorhabditis elegans线虫中，通过ATAC-seq进行全基因组染色质可及性分析的优化方案。染色质可及性直接影响基因表达、DNA修复、复制和重组过程。尽管ATAC-seq已成为细胞和组织样本研究中的标准方法，但将其应用于完整生物体时仍面临独特的技术挑战，尤其是在具有不可渗透且富含胶原蛋白角质层的线虫中。与此同时，对完整生物体进行检测为揭示全局表观遗传响应提供了独特的机会。本方法通过优化线虫解离、通透化处理、细胞核制备、染色质片段化（tagmentation）以及少量同步化L4期线虫的文库构建，克服了上述挑战。该方案可在一至两天内完成，并支持多个样本的并行处理。
本方案的成功依赖于多个关键步骤。（1）新鲜配制的缓冲液和试剂对于降低样本间的变异性至关重要。（2）本方案针对同步化群体中L4期线虫优化；我们预计该方案可适用于其他发育阶段，但需仔细优化线虫解离条件以防止细胞裂解。（3）在解离过程中，SDS-DTT孵育时间不应超过5分钟，蛋白酶K消化时间不应超过15分钟；建议在显微镜下观察以避免过度消化和细胞死亡。（4）...

真核生物基因组在细胞核内高度密集地包装。为了适应空间限制，DNA 会紧密缠绕在核小体上，核小体是由八个组蛋白组成的多蛋白复合物，在不同门类生物中高度保守1。染色质的可及性模式随组织中细胞状态的不同而变化，并具有基因特异性2,3,4。核小体的可及性与活跃转录密切相关，尤其是在启动子和远端调控区域（如增强子）处，这些区域对转录因子具有可及性5。开放的染色质区域在DNA修复、复制以及染色体分离过程中也发挥着重要作用3。相反，可及性降低通常与沉默的异染色质和重复序列相关6,7。
绘制染色质可及性图谱一直是理解基因调控的有力方法。已有多种技术被用于检测染色质的可及性。在早期方法中，微球菌核酸酶（MNase）和DNase I消化被用于在特定基因座上定位核小体并分析其可及性8,9。当这些技术与下一代测序（NGS）相结合后，进一步被应用于全基因组范围的研究10,11。然而，这些技术的成功实施需要精确优化酶浓度和反应时间，并且需要大量的细胞。 
2013年，Greenleaf实验室建立了利用测序技术检测转座酶可及性染色质（ATAC-seq）的方法，该方法能够使用少量细胞在全基因组水平上无缝绘制染色质可及性图谱12。ATAC-seq利用商业化可得的Tn5转座酶，优先将短DNA序列（即条形码）插入无核小体占据的开放染色质区域，这些区域通常与活性启动子和增强子相关。该实验方案需要先对细胞进行透化处理并分离细胞核，随后使用Tn5进行有限的切割，以实现对高可及性染色质的标签化（tagmentation）。之后在PCR过程中引入互补索引，便于在下一代测序（NGS）前进行样本多重分析13。ATAC-seq已被证明是一种稳健的实验流程，还可用于in silico转录因子足迹分析，并已实现单细胞分辨率的应用14,15,16,17。除了小鼠和人类样本外，ATAC-seq还已在多种生物系统中得到应用，包括斑马鱼以及果蝇和线虫Caenorhabditis elegans等无脊椎动物18,19,20。
数十年来，C. elegans 一直是发育生物学、细胞生物学和神经科学等领域中强大的模式系统，推动了包括发现微小 RNA（micro RNAs）和 RNA 干扰（RNAi）在内的里程碑式研究21,22。其基因组紧凑，大小约为 100 MB，包含约 20,000 个编码蛋白质的基因23。基因调控不仅通过启动子活性实现，还依赖远端增强子，这些增强子已通过 ATAC-seq 在不同组织、发育阶段和衰老时间点被系统绘制24,18。因此，染色质可及性分析已成为理解 C. elegans 基因调控机制的重要工具。相应地，ATAC-seq 在研究不同环境条件或野生分离株中的表观遗传景观方面具有重要意义，有助于揭示多样的转录响应。此外，该技术还可为了解其他致病性和非致病性线虫的染色质结构提供新见解。
在C. elegans研究中，一个主要的方法学挑战在于其富含胶原蛋白的角质层，必须将其解离才能从完整线虫中获得均一的细胞悬液25。为应对这一挑战，我们整合并优化了多种解离线虫的方案，进而开展C. elegans的ATAC-seq分析18,26。推荐使用L4幼虫阶段的线虫，因为此发育阶段的个体具有转录活跃的生殖系，表现为染色质开放状态，从而为体细胞中染色质可及性提供稳定且信息丰富的来源。本文介绍了一种快速高效的线虫解离与细胞悬液制备方案，适用于C. elegans的ATAC-seq实验。本方法针对L4期线虫进行了优化，仅需低至30 µL的线虫沉淀，且具备适应其他发育阶段或更小样本（如FACS分选纯化的细胞）的潜力。该方案可应用于不同的C. elegans品系和实验条件，在Bristol-N2参考品系中可鉴定出5,000–9,000个染色质可及性峰，为后续的染色质可及性分析奠定了基础。

<table><tbody><tr><td>250 mL，0.22 &amp;micro;m PES</td><td>Ultra Curz</td><td>sc-200253</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPURE XP</td><td>Nalgene</td><td>A63886</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Maplica</td><td>200100</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma</td><td>C5670-100G</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics 20 &amp;micro;m</td><td>Sysmex</td><td>04-0042-2315</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Sigma</td><td>C8503-25G</td><td></td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma</td><td>D141-500 mg</td><td></td></tr><tr><td>一次性手套</td><td>Microflex</td><td>94-243</td><td></td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇</td><td>sigma</td><td>D0632-10G</td><td>有害</td></tr><tr><td>纯乙醇</td><td>Sigma</td><td>1003661421</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>biowest</td><td>S181S-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-250 G</td><td></td></tr><tr><td>Illumina Tagment DNA 酶和缓冲液（大试剂盒）</td><td>Illumina</td><td>20034211</td><td></td></tr><tr><td>Kapa Syber 50 mL</td><td>Sigma</td><td>KK4618</td><td></td></tr><tr><td>L-15 培养基（Leibovitz）</td><td>sigma</td><td>L4386-10L</td><td></td></tr><tr><td>无水氯化镁</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>七水合硫酸镁</td><td>Sigma</td><td>M1880-500G</td><td></td></tr><tr><td>七水合硫酸镁</td><td>Sigma</td><td>M1880-500G</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR 纯化试剂盒（50 次）</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext&amp;reg; 高保真 2X PCR 预混液</td><td>NEB</td><td>M0541S</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 替代物</td><td>Sigma</td><td>74835-1L</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（Pen Strep）</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>Tritech</td><td>T3308</td><td></td></tr><tr><td>90 mm 培养皿</td><td>Interlux</td><td>C9015-2C</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L 带滤芯移液器吸头</td><td>Cellpro</td><td>800108</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;micro;L 带滤芯移液器吸头</td><td>Cellpro</td><td>800708</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L 带滤芯移液器吸头</td><td>Cellpro</td><td>800608</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma</td><td>P9541 -500G</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾粉末</td><td>J.T. Baker</td><td>3252-01</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾晶体</td><td>J.T. Baker</td><td>3246-01 500G</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>JT Baker</td><td>3624-01</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>sigma</td><td>L4509-100G</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Macron</td><td>7708-10</td><td></td></tr><tr><td>次氯酸钠</td><td>Cloralex</td><td>544394479</td><td></td></tr><tr><td>七水合磷酸氢二钠晶体</td><td>J.T. Baker</td><td>3824-01</td><td></td></tr><tr><td>SPRIselect</td><td>Beckman</td><td>B23318</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 针式滤器，0.22 &amp;micro;m</td><td>Ultra Curz</td><td>Sc-358812</td><td></td></tr><tr><td>Trizma 基础缓冲液</td><td>Sigma</td><td>T1503 1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr></tbody></table>

完整 caenorhabditis elegans l4 幼虫中的染色质可及性分析

Chromatin Accessibility Profiling in Whole Caenorhabditis elegans L4 Larvae

染色质可及性在转录、DNA修复和染色体分离中发挥着关键作用。高可及性区域通常与活跃的启动子和增强子相关，有助于转录因子结合和调控活性。利用测序技术检测转座酶可及性染色质（ATAC-seq）能够以极少量细胞实现全基因组范围的染色质可及性分析。然而，由于秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）具有富含胶原蛋白的角质层，导致细胞解离困难，限制了该技术在该线虫中的应用。本文介绍了一种针对L4期完整线虫进行ATAC-seq的优化方案。该流程始于同步培养的线虫，包括角质层破坏、酶解解离以及细胞悬液制备。随后对通透化处理的细胞核进行Tn5转座反应，接着进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，并纯化获得适用于下一代测序（NGS）的文库。本方案仅需30 µL线虫沉淀，可在一天内完成，在Bristol N2参考品系中可检测到5,000–9,000个可及性峰。该简化的工作流程可适用于其他发育阶段或经荧光激活细胞分选（FACS）纯化的细胞群体。通过降低在C. elegans中开展ATAC-seq的技术门槛，该方法为在完整生物体背景下研究遗传和环境扰动所引起的全基因组染色质可及性变化提供了更多机会。

标签化后的质量控制可确保文库制备的准确性 
在实验过程中，需特别关注染色质标签化后进行的qPCR（第9节），因为这是评估DNA质量和实验效果的关键步骤。图1A展示了两条扩增曲线，左侧曲线（少于15个循环）代表高质量样本，表明至此所有步骤均成功，可以继续后续操作；而右侧曲线（图1A）显示为低质量样本，此类样本不应继续使用。下一步需注意的是，在文库扩增和纯化后，建议进行毛细管电泳以评估片段长度分布。为正确验证转座后的DNA，应出现对应核小体模式的片段：约150 bp（单核小体）、约300 bp（双核小体），依此类推（图1B–D，样本1和2）。若电泳条带呈现片段弥散状，则说明DNA被过度标签化，这些样本需重新制备（图1B和1E，样本3）。
测序指标证实了文...

本文介绍了一种快速简便的ATAC-seq实验方案，仅需30 µL线虫沉淀，即可应用于秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）L4幼虫期的全虫样本。

完整 Caenorhabditis elegans L4 幼虫中的染色质可及性分析

染色质可及性在转录、DNA修复和染色体分离中发挥关键作用。高可及性区域通常与……相关。

我们的研究重点是表观遗传调控如何塑造基因表达，特别是染色质可及性如何在不同生物学条件下控制基因活性。在秀丽隐杆线虫中，ATAC-seq受到其保护性角质层的限制。我们的协议克服了这一障碍，实现了可靠的染色质可及性分析。首先，获得一个同步的L1幼虫种群，并让它们在20摄氏度下生长26小时。在显微镜下确认大多数蠕虫处于L4阶段。用M9缓冲液从培养板上回收所有蠕虫，并将它们转移到1.5毫升离心管中。用一毫升无菌水将蠕虫洗涤五次，让它们通过重力沉淀。接下来，将装有蠕虫的管子转移到25摄氏度的孵化器中30分钟，以去除肠道中的食物残留。然后取50微升的蠕虫沉淀物，放入新的管子中。为了裂解蠕虫，加入200微升新鲜的SDS-DTT缓冲液，并在管子旋转器中旋转5分钟。接下来，加入一毫升冷的鸡蛋缓冲液。然后在超微离心机上旋转以去除上清液，并重复六次。之后，加入80微升新鲜制备的蛋白酶。使用带有过滤尖端的200微升移液器，将蠕虫和蛋白酶混合物搅拌70次，并在室温下孵育15分钟。加入800微升L15 10%胎牛血清培养基，在四摄氏度下以500G离心五分钟。去除上清液后，加入一毫升L15 10%胎牛血清培养基，并如前所示进行离心。洗涤沉淀物三次后，去除上清液，并将沉淀物重新悬浮在900微升L15 10%胎牛血清培养基中。然后使用20微米过滤器过滤悬浮液。在四摄氏度下以500G离心过滤的细胞悬浮液五分钟。然后去除上清液，留下约50微升。加入45微升新鲜制备的裂解缓冲液，并小心地重新悬浮样品。然后小心地加入50微升洗涤缓冲液，不要混合样品。在四摄氏度下以500G离心五分钟。去除上清液，并将样品保持在冰上。在离心的同时，为每个样品准备TN5混合物，将25微升TN5缓冲液、24.8微升无核酸酶水和0.2微升TN5酶混合。离心后，去除上清液，将核心保持在冰上。将50微升TN5混合物加入核心沉淀物中。然后上下移动移液器七次以混合。在热块上以37摄氏度孵育30分钟，每10分钟轻轻拍打管子。TN5孵育后，加入300微升PB缓冲液，并以最大速度涡旋25秒混合。将管子中的全部体积转移到旋转柱中。在室温下以最大速度离心一分钟。将750微升PE缓冲液加入旋转柱，并再次离心。然后丢弃带有收集管的上清液。进行空旋转后，将柱子放入新的标记的1.5毫升管中。在不触及柱子的情况下，在柱子中心加入37摄氏度的10微升EB缓冲液。在室温下静置一分钟。然后在室温下以最大速度离心一分钟。然后重复洗脱步骤，以在EB缓冲液中获得20微升的最终体积。进行实时PCR以估算ATAC文库扩增的适当循环次数。通过选择每个样品的扩增信号达到最大值的1/3的循环次数来估算最终扩增循环次数。进行ATAC文库的最终扩增，并为每个样品分配不同的反向引物并记录下来。对每个样品进行估计的循环次数的扩增。使用10微升DNA文库，在总反应体积为50微升的200微升管中进行所提示的聚合酶链反应。如果暂停协议，将样品存储在零下20摄氏度。在纯化扩增的文库后，进行毛细管电泳以查看扩增后的片段大小分布模式。导致估计的最终文库扩增少于15个循环的扩增曲线表示质量良好的材料，适合继续使用。显示延迟增加的扩增曲线表示质量差的材料，不应继续使用。扩增后的片段长度分布在有效样品中显示了大约150碱基对和300碱基对的核小体模式。扩散的片段模式表示DNA过度标记，需要重复样品。我们的协议将使得在整个蠕虫中进行基因组范围的染色质可及性分析，以了解环境如何影响基因调控。关键挑战是平衡蠕虫输入和TN5活性，以避免标记不足或过度标记，确保最佳的染色质可及性分析。这种方法为研究野生种群、环境条件甚至其他物种的表观遗传变异提供了机会。

chromatin-accessibility-profiling-whole-caenorhabditis-elegans-l4

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

整个 秀丽隐 杆线虫L4幼虫的染色质可及性分析

采用微阵列分析来确定秀丽隐杆线虫（C.

使用微阵列和实时 PCR 确定秀丽隐杆线虫（C. elegans）的基因表达谱

染色质调控因子和染色质状态如何影响基因组的问题 在体 对于理解发育中胚胎早期细胞命运决定机制至关重要。本文概述了在全基因组水平上研究染色质特征最常用的方法——ChIP-Seq。 非洲爪蟾...

通过ChIP-Seq获得的Xenopus胚胎中染色质调控因子和状态的全基因组快照

本文详细描述了专门用于监测线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

表征线虫胚胎伸长的新指标 秀丽隐杆线虫

本文介绍了一个将大范围饮食限制与基因表达及寿命关联起来的研究框架。我们描述了实施大范围饮食限制的实验方案，以及在此条件下对基因表达进行定量成像的技术流程。此外，我们还概述了用于揭示参与食物感知的遗传回路中潜在信息处理特征的计算分析方法。...

在 C. elegans 中通过基因表达水平编码的信息量化：广泛范围饮食限制下寿命调控过程中的研究

我们提出一种用于三维重建的自动化方法 秀丽隐杆线虫 生殖系.

计算分析 秀丽隐杆线虫 生殖系中细胞核、蛋白质及细胞骨架分布的研究

本文介绍了一种组合方法，结合高分辨率显微镜、计算工具以及活体秀丽线虫（C.

亚细胞分辨率下利用各向同性光片显微镜与自动化细胞谱系分析记录秀丽隐杆线虫胚胎发育

该方法旨在追踪细胞系中由PRC2介导的染色质结构域的形成过程，并且可适用于许多其他系统。...

一种研究方法 从头合成 染色质结构域的形成

本研究描述了一种半高通量实验方案，可在一次过夜实验中同时对80–100个C.

一种用于分析的半高通量成像方法与数据可视化工具包 秀丽隐杆线虫 胚胎发育

动态微管成像方案 体内 使用荧光标记的末端结合蛋白对秀丽隐杆线虫后侧微管（PLM）神经元中动态微管进行标记、成像和分析的方法已得到描述。 秀丽隐杆线虫.

秀丽隐杆线虫神经元中微管动态与取向的活体评估

本方案描述了一种通过手工分离成年秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

手部解剖 秀丽隐杆线虫 肠道

本方案描述了一种RNA干扰和染色质免疫沉淀实验，用于研究RNA干扰诱导的沉默及其相关染色质修饰在C.

利用荧光报告基因与染色质免疫沉淀（ChIP）分析秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的跨代表观遗传

了解针对秀丽隐杆线虫L4幼虫优化的ATAC-seq染色质可及性分析方法。该方案克服了胶原蛋白角质层的技术障碍，仅需30微升虫体沉淀即可在一天内完成全基因组染色质开放性图谱构建，为研究表观遗传调控提供高效工具。

完整 Caenorhabditis elegans L4 幼虫中的染色质可及性分析

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