完整 Caenorhabditis elegans L4 幼虫中的染色质可及性分析

我们的研究重点是表观遗传调控如何塑造基因表达，特别是染色质可及性如何在不同生物学条件下控制基因活性。在秀丽隐杆线虫中，ATAC-seq受到其保护性角质层的限制。我们的协议克服了这一障碍，实现了可靠的染色质可及性分析。

首先，获得一个同步的L1幼虫种群，并让它们在20摄氏度下生长26小时。在显微镜下确认大多数蠕虫处于L4阶段。用M9缓冲液从培养板上回收所有蠕虫，并将它们转移到1.5毫升离心管中。

用一毫升无菌水将蠕虫洗涤五次，让它们通过重力沉淀。接下来，将装有蠕虫的管子转移到25摄氏度的孵化器中30分钟，以去除肠道中的食物残留。然后取50微升的蠕虫沉淀物，放入新的管子中。

为了裂解蠕虫，加入200微升新鲜的SDS-DTT缓冲液，并在管子旋转器中旋转5分钟。接下来，加入一毫升冷的鸡蛋缓冲液。然后在超微离心机上旋转以去除上清液，并重复六次。

之后，加入80微升新鲜制备的蛋白酶。使用带有过滤尖端的200微升移液器，将蠕虫和蛋白酶混合物搅拌70次，并在室温下孵育15分钟。加入800微升L15 10%胎牛血清培养基，在四摄氏度下以500G离心五分钟。

去除上清液后，加入一毫升L15 10%胎牛血清培养基，并如前所示进行离心。洗涤沉淀物三次后，去除上清液，并将沉淀物重新悬浮在900微升L15 10%胎牛血清培养基中。然后使用20微米过滤器过滤悬浮液。

在四摄氏度下以500G离心过滤的细胞悬浮液五分钟。然后去除上清液，留下约50微升。加入45微升新鲜制备的裂解缓冲液，并小心地重新悬浮样品。

然后小心地加入50微升洗涤缓冲液，不要混合样品。在四摄氏度下以500G离心五分钟。去除上清液，并将样品保持在冰上。

在离心的同时，为每个样品准备TN5混合物，将25微升TN5缓冲液、24.8微升无核酸酶水和0.2微升TN5酶混合。离心后，去除上清液，将核心保持在冰上。将50微升TN5混合物加入核心沉淀物中。

然后上下移动移液器七次以混合。在热块上以37摄氏度孵育30分钟，每10分钟轻轻拍打管子。TN5孵育后，加入300微升PB缓冲液，并以最大速度涡旋25秒混合。

将管子中的全部体积转移到旋转柱中。在室温下以最大速度离心一分钟。将750微升PE缓冲液加入旋转柱，并再次离心。

然后丢弃带有收集管的上清液。进行空旋转后，将柱子放入新的标记的1.5毫升管中。在不触及柱子的情况下，在柱子中心加入37摄氏度的10微升EB缓冲液。

在室温下静置一分钟。然后在室温下以最大速度离心一分钟。然后重复洗脱步骤，以在EB缓冲液中获得20微升的最终体积。

进行实时PCR以估算ATAC文库扩增的适当循环次数。通过选择每个样品的扩增信号达到最大值的1/3的循环次数来估算最终扩增循环次数。进行ATAC文库的最终扩增，并为每个样品分配不同的反向引物并记录下来。

对每个样品进行估计的循环次数的扩增。使用10微升DNA文库，在总反应体积为50微升的200微升管中进行所提示的聚合酶链反应。如果暂停协议，将样品存储在零下20摄氏度。

在纯化扩增的文库后，进行毛细管电泳以查看扩增后的片段大小分布模式。导致估计的最终文库扩增少于15个循环的扩增曲线表示质量良好的材料，适合继续使用。显示延迟增加的扩增曲线表示质量差的材料，不应继续使用。

扩增后的片段长度分布在有效样品中显示了大约150碱基对和300碱基对的核小体模式。扩散的片段模式表示DNA过度标记，需要重复样品。我们的协议将使得在整个蠕虫中进行基因组范围的染色质可及性分析，以了解环境如何影响基因调控。

关键挑战是平衡蠕虫输入和TN5活性，以避免标记不足或过度标记，确保最佳的染色质可及性分析。这种方法为研究野生种群、环境条件甚至其他物种的表观遗传变异提供了机会。