激光捕获显微切割用于RNA分析的多聚甲醛固定小鼠肝组织

我们的研究主要探讨慢性肝病背景下与肝细胞相关的病理生理学。本方案可实现肝组织切片中的细胞分离及RNA提取。与FFPE或甲醛固定相比，CT方案能够保存并整合细胞结构，从而实现精确的显微观察，并为后续的OMI分析提供高质量的样本。

首先，将带有膜的载玻片暴露于紫外线下照射 30 分钟。用浓度为 0.1 毫克/毫升的多聚-L-赖氨酸包被载玻片，并使其自然风干。用中性封片剂密封每张载玻片的边缘。

使用 RNase 去污染试剂擦拭冷冻切片机所有可接触的表面及所有工具。使用 75% 乙醇清洁毛刷和工具，确保彻底清洁。

现在，将冷冻切片机的温度设置为零下20摄氏度，并使其稳定。从零下80摄氏度的储存环境中取出肝组织样本，放入冷冻切片机腔室中，至少平衡15分钟。

在样本台上涂抹一层2至3毫米厚的OCT包埋剂。然后将样本台置于速冻架上或冷冻切片机腔体内，使包埋剂层预先固化。在已预固化的包埋剂层上再加少量OCT包埋剂后，将平衡至室温的组织块水平放置于包埋剂上，并固定10至15秒。

然后将带有已固定组织块的切片台安装到冷冻切片机的样品头上。现在从冷冻切片机的一侧小心地将刀片插入夹紧板与背板之间。压下夹紧杠杆以固定刀片。

将冷冻切片机的切片厚度设置为10微米。将组织切成切片，并直接贴附于冷冻切片机腔室内预处理过的膜片载玻片上，腔室温度维持在零下20摄氏度。将载玻片在室温下解冻20分钟。

用无RN ACE的PBS缓冲液清洗载玻片三次，每次10秒。将过滤后的Mayer苏木精溶液加入组织切片中，染色5至10秒。然后用无RNase的水清洗载玻片三次，每次10秒，以去除残留的苏木精。

在显微镜下评估染色质量。使用吸水纸将玻片 blot 干，并使其完全空气干燥。用 RNase 去污染试剂擦拭实验台表面。

打开控制器并等待显微镜完成初始化。将钥匙从关闭位置顺时针旋转至开启位置，以启动激光系统。打开计算机并启动激光显微切割软件。

然后等待初始化完成。现在将一支无菌的 0.2 毫升 PCR 管插入收集装置中。使用移液器将 10 微升蛋白酶 K 消化缓冲液加入 PCR 管盖内。

将收集装置装入显微镜的样本架中。在更换收集装置窗口中，进入调整参考点界面，调节相机焦距以清晰观察参考点，并在必要时使用箭头控制将其居中。

将组织切片放入样本架中，组织面朝下，标签位置朝右。选择10倍物镜，识别具有特定病理特征的兴趣区域。进入激光菜单。

单击校准，选择“是”并完成校准。在激光控制面板中，将激光功率设为50，光圈设为5，速度设为9。然后使用图形工具栏在目标区域周围绘制一个圆。

选择单一形状，按下“开始切割”以执行激光显微切割，并定位收集装置以获取切割的组织。为获取记录图像，请选择文件并选择“保存图像”，以保存切割前后的图像至所需格式。收集完目标细胞后，单击“卸载”以将收集器从载物台上移除。

确认蛋白酶K消化缓冲液在管盖中剩余10微升，必要时补充。盖紧管盖并充分涡旋混匀，然后在离心机中短暂离心。

将试管于-80摄氏度保存，直至进行RNA提取。使用显微镜观察笔式载玻片上经苏木精染色的肝组织切片，在激光捕获显微切割前后均进行观察。显微镜下显示微泡性脂肪变性的目标区域被精确采集至PCR管盖中。

保持完整的细胞形态。从约1000个和2000个激光显微切割分离的细胞中提取的总核糖核酸分别获得110.7纳克和213.3纳克。所有样品均显示高纯度，260纳米与280纳米吸光度比值介于1.9至2.1之间。

凝胶电泳显示出清晰的28 s和18 s核糖体核糖核酸条带。仅来自1000个细胞的核糖核酸的Bioanalyzer图谱，其核糖核酸完整性数值为6.7。

内参基因Beta actin的Q-R-T-P-C-R扩增得到的循环阈值（Ct值）范围为17至19。使用50纳克总核糖核酸构建的测序文库经Bioanalyzer检测显示，在300至500个碱基对之间出现特征性峰。对这些文库进行RNA测序后获得了高质量数据，Q20和Q30得分均超过90%，且在重复样本中表现出较低的错误率。

一个重要考虑因素是在处理过程中通过控制终止、快速染色和直接操作条件来防止抗体降解。按此流程操作，可用于实时 PCR 以及经片段化优化文库接头的测序。该方法已在肝组织样本中建立。

本方案可实现肝细胞亚群的分析表征，并支持以病理学为重点的肝脏病学研究。