Name: 基于人源ASC的生物制造中用于可重复大尺度组织构建物的生物学标准化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-05T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 学习基于人源脂肪干细胞的标准化生物制造流程，利用3D打印GelMA支架和球状体组装技术构建可重复的大尺度组织构建物。该方法通过质量控制确保再生医学应用的可重复性与临床转化潜力。

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图中插图由 BioRender.com (https://BioRender.com/x1lxn0y) 提供。

所用试剂和设备见材料表。
1. 琼脂糖微模具的制备及GelMA 3D打印支架的构建
<ol>
	<li>在0.9%氯化钠（NaCl）溶液中制备2%琼脂糖微模具（见图2A） 
	注意： 所有化学废弃物必须根据机构的化学品安全法规和危险废物处理指南进行处理和处置。
	<ol>
		<li>在超纯水中配制0.9% NaCl溶液，并在121 °C下高压灭菌30分钟。使用前保持无菌条件。</li>
		<li>将1 g无菌超纯琼脂糖溶于50 mL 0.9% NaCl溶液中。在微波炉中以10秒为间隔加热3–5个循环，期间充分混匀并解聚琼脂糖，直至完全溶解。</li>
		<li>在生物安全柜中，将含有81个圆形凹槽的商用硅胶模具置于无菌纱布上。</li>
		<li>小心地将600 µL琼脂糖溶液滴加至硅胶模具中心，并静置40分钟，以确保完全聚合。</li>
		<li>小心脱模已完全聚合的琼脂糖微模具，并将其转移至12孔微孔板的一个孔中。</li>
		<li>调整琼脂糖微模具的位置，并通过加入600 µL琼脂糖溶液将其固定在孔底。</li>
		<li>用杜氏改良伊格尔低糖培养基（DMEM，2 mL/孔）预孵育微模具15分钟。重复该步骤两次；在第三次孵育时，更换为三维（3D）培养基，该培养基由DMEM添加抗坏血酸（50 µg/mL）、人血清白蛋白（1.25 µg/mL）、青霉素-链霉素（PS，1×，来自100×储存液）和ITS补充剂（1×，来自100×储存液）组成。 
		注意： 三维培养基与单层扩增培养基的区别在于不含胎牛血清（FBS），并含有促进细胞间相互作用和细胞外基质支持的特定补充剂，有利于类球体的自组装和稳定。若模具制备与细胞接种在不同日期进行，则可在第二次DMEM孵育后暂停操作，将模具在37 °C湿润培养箱中无菌保存最多5天。第三次使用三维培养基的孵育必须仅在接种当天进行。接种细胞前，需彻底移除孔内及微模具中的培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶的制备 
	注意：整个操作应在避光条件下进行，因为试剂对光敏感。本研究中使用了明胶（凝胶强度300 g Bloom，取代度60%）和光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次磷酸锂（LAP）。配制10 mL含0.5% w/v LAP的10% w/v GelMA溶液的方法如下：
	<ol>
		<li>将50 mg LAP粉末溶于1 mL DMEM中，用移液器轻轻混匀，直至获得澄清、均一的溶液。</li>
		<li>将LAP溶液转移至含有9 mL DMEM的离心管中，充分混合。</li>
		<li>在生物安全柜中，通过0.22 µm滤膜过滤对该溶液进行灭菌。</li>
		<li>向溶液中加入1 g GelMA，并在50 °C下使用磁力搅拌约3小时，或直至形成澄清均一的溶液。将烧瓶置于光源下观察，确保溶液中无可见颗粒或浑浊。</li>
		<li>将所得水凝胶装入10 mL注射器中，用于后续打印；若不立即使用，则应避光保存于2–8 °C直至使用。 
		注意：GelMA和LAP溶液通常在配制后约24小时使用。不建议长期储存该溶液。GelMA和LAP粉末应按照制造商说明保存于2–8 °C。根据ABNT NBR 14725和欧盟法规（EC）第1272/2008号，LAP光引发剂被归类为非危险品。然而，制造商建议使用个人防护装备以防止呼吸道、皮肤和眼睛刺激。推荐佩戴符合相关政府标准（如NIOSH（美国国家职业安全与健康研究所）或EN 166（欧盟））测试和认证的安全眼镜，以及厚度不低于0.11 mm的丁腈橡胶手套。仅在产生粉尘时才需要呼吸防护。制造商关于带滤芯呼吸防护的建议基于DIN EN 143、DIN EN 14387及其他与所用呼吸防护系统相关的补充标准，推荐使用P1型滤芯。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>三维模型设计、切片及G代码文件生成 
	注意：三维支架模型使用在线三维计算机辅助设计（CAD）软件Tinkercad设计。本方案中生成的圆柱形支架直径为15 mm，底部厚度为1 mm，包含两个圆形孔，每个孔直径为5.50 mm，深度为2 mm。
	<ol>
		<li>完成三维模型设计后，将其导出为*.stl文件（补充文件1）。</li>
		<li>打开Repetier-Host V2.3.2软件，用于对设计模型进行切片。</li>
		<li>在&#34;切片&#34;选项卡中选择所需的切片器选项。本研究中使用了CuraEngine。</li>
		<li>配置合适的参数配置文件。本研究中使用的参数为：速度10 mm/s；层高0.2 mm；填充模式：网格；喷嘴直径0.41 mm。</li>
		<li>加载待打印三维模型的*.stl文件。</li>
		<li>在&#34;切片&#34;选项卡中选择先前创建的配置。</li>
		<li>点击&#34;使用CuraEngine切片&#34;。切片后的三维模型将在软件界面中显示。</li>
		<li>点击“保存到文件”以将G代码文件保存至指定位置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于类球体生物组装的甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶支架的三维打印 
	注意： 三维打印必须在无菌条件下进行。因此，在开始打印前，需确认容纳打印机的生物安全柜已开启，气流正常运行，并确认柜体防护玻璃的高度与设备传感器标记高度一致。
	<ol>
		<li>解除生物打印机的安全锁。</li>
		<li>松开金属夹，从打印平台取下玻璃板。</li>
		<li>使用金属夹将适当形状的丙烯酸导板固定在打印平台上，以支撑培养板的安装。</li>
		<li>将打印机连接至电源。注意该设备支持双电压（110/220 V）。</li>
		<li>将打印机USB线连接至计算机。</li>
		<li>按下开关按钮启动打印机。</li>
		<li>打开Repetier-Host V2.3.2软件，用于查看三维模型并执行打印。</li>
		<li>在软件界面中点击“连接”选项。</li>
		<li>使用软件的手动控制功能，选择挤出机（1或2），并将打印头移至原点位置（X = 0, Y = 0, Z = 0）。</li>
		<li>使用Repetier软件中的适当手动控制工具，调整所选挤出机以正确安装注射器。</li>
		<li>小心将已装有水凝胶并连接挤出喷嘴的注射器插入挤出机（本研究中使用内径为0.41 mm的锥形聚丙烯喷嘴）。</li>
		<li>将培养板安装至打印床上的丙烯酸导板中。</li>
		<li>使用位于生物打印机左侧的Z轴限位螺丝调整Z轴原点位置（Z = 0），即设定挤出喷嘴与打印表面之间的理想距离。理想情况下，喷嘴应轻微接触基底，本研究中为培养板。</li>
		<li>将打印头返回原点位置。</li>
		<li>加载先前生成的G代码文件。</li>
		<li>使用软件中的适当手动控制工具，从注射器中挤出部分水凝胶，以确保材料能顺利通过喷嘴。</li>
		<li>启动打印过程。</li>
		<li>打印完成后，使用配备两个395–400 nm LED的三维生物打印机紫外光系统对所得支架进行光交联。将支架暴露于紫外光下5分钟（光强20 mW/cm2）。</li>
		<li>使用与制备微模具相同的已解聚2%琼脂糖溶液，将3D打印支架固定在12孔培养板的孔中。将支架牢固固定在孔底对于提供更大稳定性、防止类球体接种及培养期间发生位移至关重要。 
		注意： 执行步骤4.16时，应检查水凝胶在挤出过程中是否形成连续丝状结构。通常，明胶溶液在仍处于液态（约37 °C）时被装入注射器。在室温（22–25 °C）下数分钟内，该生物材料开始转变为凝胶状。挤出过程中材料不应滴落，否则会影响打印质量。挤出过程中形成连续丝状结构表明水凝胶已达到适合打印的最佳稠度。溶于DMEM的GelMA和LAP溶液呈轻微橙色。经紫外光诱导光交联后，通常可观察到颜色变化，材料变为乳白色或半透明，如图3D,E所示。操作紫外光系统时，必须佩戴安全眼镜，以充分保护眼睛免受紫外线辐射。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打印保真度分析 
	注意： GelMA支架的三维打印保真度分析考虑以下参数：支架直径、孔径和支架厚度。使用ImageJ Version 1.54软件进行测量。
	<ol>
		<li>首先，使用体视显微镜拍摄支架图像，并使用尺子或卡尺作为参考。</li>
		<li>在分析图像前，需在ImageJ中校准并设置比例尺以进行测量。</li>
		<li>使用直线工具进行测量。</li>
		<li>由于支架和孔均为圆形，统计分析时采用支架和孔直径的算术平均值。</li>
		<li>进行打印保真度分析时，将ImageJ测得的打印支架数据与Tinkercad生成的三维模型中定义的数值进行比较。 
		注意：实测打印支架厚度应与Tinkercad中投影的孔深与底部厚度之和进行比较。</li>
		<li>对所得数据进行统计分析。本案例中，为比较实测支架值与预期值，可采用Mann-Whitney U检验（非参数检验）。使用Shapiro-Wilk检验评估数据正态性。当p &#60; 0.05时，认为差异具有统计学显著性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. hADSCs 的制备与球体形成
注意：使用商品化的人脂肪来源的间充质干细胞（hADSCs），按照生产商的建议，在细胞特异性生长培养基中培养，并在细胞融合度达到80%–90%时进行传代。本实验方案中使用的细胞传代次数不超过第7代。所有生物废弃物在丢弃前必须经过适当去污染或灭菌处理，并依照机构生物安全指南进行操作。为后续共聚焦显微镜观察，应在形成球状体之前，按照生产商建议用荧光染料对单层细胞进行标记并孵育。标记后30分钟即可开始球状体的形成。
<ol>
	<li>ASC 单层细胞的胰酶消化
	<ol>
		<li>在生物安全柜中打开培养瓶，将内容物转移至废液容器中。</li>
		<li>用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤单层细胞两次，并弃去洗涤液。</li>
		<li>加入足量的 0.125% 胰酶/EDTA 溶液以覆盖单层细胞。盖紧瓶盖，于 37 °C 湿润培养箱中孵育最多 5 分钟。</li>
		<li>加入等体积的含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基以终止胰酶/EDTA 的消化作用。</li>
		<li>用血清移液管收集细胞悬液，或转移至离心管中。在室温（20–25 °C）下以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>小心弃去上清液。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于 DMEM 培养基中并混匀。取部分细胞悬液用于细胞计数和活力检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类球体培养（见 图 2B）
	<ol>
		<li>将每种模具所需数量的细胞分装至 15 mL 离心管中。对于 hADSCs，每个含有 81 个凹孔的琼脂糖模具应接种 1 × 106 个细胞——每个微孔中形成一个类球体，每块微模具可生成 81 个类球体。</li>
		<li>加入 1× PBS，于室温下以 500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液后再次加入 1× PBS。重复此步骤两次。</li>
		<li>第三次离心后，小心弃去上清液，并用无菌纱布擦拭管口，然后将离心管恢复至垂直位置。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于 120 µL 三维培养基中用于类球体培养，并充分混匀。如有需要，可补充三维培养基将悬液体积调整至 200 µL。 
		注：每个含 81 个凹孔的模具容量为 200 µL。</li>
		<li>吸取 200 µL 细胞悬液，小心地加至模具中央，避免产生气泡。 
		&#8203;注：此步骤可使用自动化移液系统完成，方法如前所述22。</li>
		<li>将培养板置于生物安全柜中静置 5 分钟，使细胞沉降至凹孔内。</li>
		<li>将培养板放入湿润培养箱中孵育 40 分钟。</li>
		<li>孵育结束后，小心向每个孔中加入 2 mL 三维培养基。将培养板放回 37 °C 湿润培养箱中继续培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类球体测量与统计分析
	<ol>
		<li>使用配备数码相机和 10× 物镜的倒置光学显微镜，拍摄沿琼脂糖微模具两条对角线呈“X”形排列的类球体图像。在测量直径前，使用 100 µm 的比例尺校准图像尺度。</li>
		<li>使用软件中的“直线”工具测定每个类球体的最大和最小直径，对每个成像的类球体进行两条相互垂直的测量，两者夹角约为 90°。</li>
		<li>将两次垂直测量所得直径的算术平均值作为每个类球体的平均直径。将每个类球体的最大直径与最小直径的比值定义为球形度，比值越接近 1，表示类球体越均匀、越接近理想球形。</li>
		<li>利用所获得的直径和球形度数值进行统计学分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 在 GelMA 支架上接种类球体以实现类球体融合与生物组装
<ol>
	<li>在球体形成24小时后，使用带有宽口吸头的移液器从琼脂糖微模具中收集球体，并转移至2 mL微量离心管中。</li>
	<li>当球体沉降至微量离心管底部时，弃去上清液。</li>
	<li>用50 µL 3D培养基重悬球体。</li>
	<li>使用带有宽口吸头的移液器收集球体，并轻柔地将其嵌入GelMA支架的孔隙中。 
	注意：在直径约5.50 mm、深度为2 mm的GelMA支撑孔中，将约480至640个球体（相当于6–8个琼脂糖微模具，每个模具生成81个直径为200至400 µm的球体）接种于50 µL体积中。该估算基于孔隙体积和球体平均直径，通过转移的完整微模具数量而非单个球体计数进行量化，以确保孔隙内球体密度的实用性和可重复性。</li>
	<li>将球体接种至GelMA支撑孔后，静置20–40分钟，使球体沉降，随后向每孔加入1 mL 3D培养基。</li>
	<li>24小时后，向每孔再添加1 mL 3D培养基。</li>
	<li>通过相差显微镜和体视显微镜监测球体在GelMA支架孔隙内的融合情况。从第0天（接种后立即开始）至第3天（72小时），每隔24小时采集一次图像。</li>
	<li>在培养72小时后，使用4%多聚甲醛固定生物构建体，以便进行共聚焦显微镜观察。由于多聚甲醛具有毒性和刺激性，操作时必须在经认证的化学通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、手套和眼部防护），废弃物应按照机构化学安全指南处理。为进行共聚焦观察，细胞应在单层培养阶段、形成球体前用荧光染料预先标记。 
	注意：若需将构建体从GelMA孔中取出用于分析或体内应用，应使用精密镊子或合适尺寸的活检打孔器小心取出。</li>
</ol>

<ol>
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M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+multicellular+spheroids.">Engineering multicellular spheroids.</a> Adv Healthcare Mater. 9 (12), 2000608 (2020).</li><li>Zhang, J., Yun, S., Du, Y., Zannettino, A., Zhang, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel-based+preparation+of+cell+aggregates.">Hydrogel-based preparation of cell aggregates.</a> Appl Mater Today. 20, 100747 (2020).</li><li>Khajehmohammadi, M., Azizi Tafti, R., Nikukar, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+porosity+on+bioprinted+scaffolds.">Effect of porosity on bioprinted scaffolds.</a> J Biomed Mater Res A. 111 (2), 245-260 (2023).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+nutrient+transport+in+engineered+cartilage+constructs.">Enhanced nutrient transport in engineered cartilage constructs.</a> Acta Biomater. 58, 1-11 (2017).</li><li>Chariyev-Prinz, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC+response+to+hydrostatic+pressure+in+chondrogenesis+supportive+environments.">MSC response to hydrostatic pressure in chondrogenesis supportive environments.</a> J Biomech. 154, 111590 (2023).</li></ol>

作者声明无利益冲突。

本研究展示的结果突出了将质量控制指标成功整合到标准化生物制造工作流程中，以确保可重复性。使用基于预先建立设计的3D打印支架为类球体生物组装提供结构支持19,23。作为概念验证，设计了一种实心支架，其中包含两个中心多孔区域，尺寸经过优化，可支持高密度类球体装载和引导生物组装。
作为首个质量控制检查点，在将类球体接种到基于3D打印明胶甲基丙烯酰基（GelMA）的支架之前，需对其尺寸进行评估。利用琼脂糖微模塑水凝胶，24小时后可生成形态均一的类球体（图2D）。形态计量学分析显示其直径一致且球形度高（图2E、F）。这些参数在生物制造中至关重要，可用于估算生物组装过程中最终构建物的尺寸，并据此计算占据每个3D打印支架孔隙所需的类球体数量5。
<p class="jove...

生物组装与生物打印是组织工程中互补的生物制造方法，其重点是利用自动化技术在宏观尺度上构建复杂的组织和器官1,2,3,4。
类球体作为生物组装方法中的基本单元，已被引入生物制造领域5。类球体被视为微组织，能够模拟体内细胞与其周围组织微环境之间的相互作用。in vivo。在用于形成类球体的细胞来源中，脂肪来源的干细胞（ADSCs）因其易于分离、可长期培养以及具有分化潜能而尤为突出6,7,8。
由于球状体具有形成更大聚集体的内在能力，因此在采用生物组装方法时，可生成更为复杂的组织结构。这种由融合驱动的组织方式能够增强干细胞球状体的再生能力和分化潜能9,10。
类球体生物组装可由生物材料提供支撑甚至引导11，这使得该策略适用于可扩展且自动化的生物制造12,13。
现有的生物制造策略 broadly 可分为无支架类球体组装方法和水凝胶包埋式生物打印系统2,5,14。无支架方法完全依赖细胞的自发自组装及类球体间的融合，利用细胞间的内在相互作用。然而，由于缺乏外部结构引导或几何限制，这些方法的空间控制能力较差，结构可预测性较低5,15。相比之下，基于水凝胶的包封方法将细胞嵌入整体基质中，以提供结构支撑和预定义的架构16,17，但可能在早期融合阶段部分限制细胞间的直接接触，并影响细胞迁移动力学18。在此框架下，可打印生物材料如甲基丙烯酰化明胶（Gelatin Methacryloyl, GelMA）具有细胞黏附基序，可作为支架促进类球体的生物组装19。人们假设，3D 打印的 GelMA 支架可为类球体提供几何限制和空间引导，从而通过融合形成更大、结构明确的构建体，实现可控的组织形成。该方法旨在通过将支架引导的组织结构与在特定水凝胶架构内发生的类球体融合相结合，提高类球体生物组装过程中的空间控制性和结构可重复性。然而，当前的工作流程侧重于工艺标准化和结构性生物制造参数，未涉及组织的长期成熟、功能分化或大规模自动化生产。
生物标准化不仅对于确保可重复性和可扩展性至关重要，而且对于维持生物制造组织的功能完整性也必不可少19,20。因此，对工程参数、几何参数和结构参数进行精确控制至关重要，因为这些因素直接影响生物学性能，包括组织功能和成熟度5,21。本文提出了一种标准化且可重复的生物制造工作流程，涵盖以下关键步骤：（1）ASC单层培养；（2）ASC球体形成；（3）GelMA支架的3D打印；以及（4）球体生物组装（图1）。在此工作流程中，建立了客观的质量控制指标，包括球体的均一性和球形度、打印保真度以及支架形状的完整性。

<table><tbody><tr><td>1x 磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>实验室配制</td><td></td><td>-</td></tr><tr><td>593iCAN 3D 生物打印机，型号 593 iCan2X 打印头</td><td>593iCAN</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16500-500</td><td>-</td></tr><tr><td>抗坏血酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A4544-100MG</td><td>-</td></tr><tr><td>卡尔蔡司显微系统有限公司 Primovert&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td>415510-1101-000</td></tr><tr><td>Celldiscover&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td>LSM 900 配备 Airyscan 2</td></tr><tr><td>Celltracker</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>C7025</td><td>-</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>5702</td></tr><tr><td>II 级生物安全柜</td><td>Streamline</td><td>-</td><td>型号 SC2-4E3</td></tr><tr><td>细胞培养用 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>-</td><td>Series 8000 WJ&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>锥形聚丙烯喷嘴 0.41 mm</td><td>593iCAN</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔低糖培养基&amp;rsquo;s&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D2902-10L</td><td>-</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>E9884</td><td>-</td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>12657-029</td><td>-</td></tr><tr><td>甲基丙烯酰化明胶，凝胶强度 300 g Bloom，取代度 60%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900622</td><td>批号：MKCS2673。每批次的相关文件，包括安全数据表 (SDS) 和分析证书 (CoA)，可从制造商&amp;rsquo;s 网站获取。</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6.0 软件</td><td>GraphPad Inc</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>磁力搅拌加热板</td><td>IKA</td><td>Z671797</td><td>型号 C-MAG HS7</td></tr><tr><td>人血清白蛋白 100 mg/ml</td><td>FUJIFILM Irvine Scientific</td><td>9988</td><td>-</td></tr><tr><td>ITS（胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠）添加剂 100x&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3146-5ML</td><td>-</td></tr><tr><td>苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次磷酸锂 (LAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900889</td><td></td></tr><tr><td>Luxoeo 4Z 体视变倍显微镜&amp;nbsp;</td><td>Labomed</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>MicroTissues&amp;reg; 3D 培养皿&amp;reg; 微模具球状体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z764019</td><td>-</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 100x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15140122</td><td>-</td></tr><tr><td>Poietics&amp;trade; 人脂肪来源干细胞 (ADSC)</td><td>Lonza&amp;nbsp;</td><td>PT-5006</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠 (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71382-500G</td><td>-</td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>27250018</td><td>-</td></tr></tbody></table>

基于人源asc的生物制造中用于可重复大尺度组织构建物的生物学标准化

Biological Standardization of Human ASC-Based Biofabrication for Reproducible Macroscale Tissue Constructs

不同实验室之间缺乏标准化操作流程，严重阻碍了实验结果的可比性以及生物制造技术的高效转化。严格的生物学标准化不仅能够提高实验的可重复性，还有助于与国家及国际监管框架接轨，这对于组织工程策略的临床转化至关重要。本研究提出了一种标准化的生物制造工作流程，包括人脂肪源性间充质干细胞（hADSCs）的单层培养、类球体形成、明胶甲基丙烯酰胺（GelMA）支架的3D打印以及类球体的生物组装。通过整合质量控制指标以确保可重复性。所设计的3D打印GelMA支架包含两个中心孔道，每个孔道可容纳数百个类球体。通过将支架实际尺寸与CAD模型进行比较，验证了打印的保真度，仅存在微小且无统计学意义的偏差。hADSCs在琼脂糖微模具中24小时内即可形成均一的类球体。当接种至支架孔道中后，类球体在72小时内持续融合，共聚焦成像证实形成了宏观尺度的组织结构。支架的设计与打印精度提供了必要的结构支撑，而类球体的均一性则确保了组织构建过程的可预测性。类球体在支架孔道内的融合最终形成了适用于移植的组织构建物，无论是否保留支架，均体现出该生物组装策略的灵活性。研究结果强调了生物学标准化在推动活体组织构建物可重复制造方法发展中的关键作用，为再生医学未来的临床应用提供了广阔前景。

人脂肪来源的干细胞（hASCs）在单层培养条件下（图2C）接种至琼脂糖微模后，于24小时内成功诱导形成球体（图2D）。所形成的球体呈现出致密且形态清晰的结构。形态计量分析显示，24小时时球体的平均直径为239.8 µm ± 87.0 µm（图2E），球形度接近1（0.947 ± 0.123）（图2F），表明球体具有高度均一性和对称性。
3D 打印支架的 CAD 模型设计包含两个孔，占据支架总直径的约三分之一（图 3A,B）。对该模型进行切片并生成相应的 G 代码。G 代码文件生成后，可将其载入打印软件 Repetier Host 中，以可视化切片后的 3D 模型（图 3C）。成功打印出 GelMA 水凝胶支架（图 3D,E</strong...

本研究展示了一种使用脂肪来源干细胞球体与3D打印GelMA支架的可重复生物制造工作流程。该方法实现了空间控制、融合能力及质量控制指标，最终构建出具有再生医学应用潜力的可移植宏观组织结构。

基于人源ASC的生物制造中用于可重复大尺度组织构建物的生物学标准化

实验室之间缺乏标准化操作流程，对实验结果的可比性以及研究效率构成了重大障碍。

本研究展示了一种标准化的生物制造工作流程，该流程利用3D打印的水凝胶模板引导类球体组装成高密度细胞微组织。本研究所采用的方法，即可移植组织的无支架或有支架生物制造，推动了再生医学领域的生物制造技术发展。首先，将含有hADSCs单层细胞的培养瓶置于生物安全柜中，移除培养基并转移至废液容器。用1×PBS洗涤单层细胞两次，并弃去洗涤液。如有需要，使用合适的荧光染料对细胞进行标记。加入足量的0.125%胰蛋白酶-EDTA溶液以覆盖单层细胞，随后盖紧培养瓶。将培养瓶置于37 °C、湿润的培养箱中孵育最多五分钟。孵育结束后，加入等体积含10% FBS的DMEM培养基以终止胰蛋白酶消化作用。用移液管收集细胞悬液，转移至离心管中，在室温下以400 g离心五分钟。弃去上清液后，用DMEM重悬细胞沉淀，并取部分细胞悬液用于细胞计数和活力评估。将1 × 10⁶个制备好的hADSCs分装至15毫升离心管中。为洗涤细胞，向管中加入PBS，于室温下以500 × g离心5分钟。弃去上清液，加入新鲜PBS。重复洗涤步骤两次。第三次离心后，小心弃去上清液。用无菌纱布擦干管口，将离心管垂直放置。用120微升3D培养基重悬细胞沉淀。必要时可额外添加3D培养基，将悬液总体积调整至200微升。取含81个圆形凹孔的琼脂糖模具。吸取200微升细胞悬液，置于模具中央，避免产生气泡。将模具置于生物安全柜中静置5分钟，使细胞沉降至凹孔内。随后将模具放入37摄氏度的湿润培养箱中孵育40分钟。孵育结束后，向每个孔中小心加入2毫升3D培养基，再将模具放回培养箱继续培养约24小时。使用倒置光学显微镜的10倍物镜，拍摄位于琼脂糖微模具两个对角线位置的类球体图像。在测量直径前，使用100微米比例尺校准图像尺度。利用软件的直线工具测定每个拍摄图像中类球体的长径；通过在与第一次测量方向大致呈90度的位置进行第二次测量，获得短径。计算类球体的球形度及平均类球体直径。为准备支架制造，将打印头移至原点位置，并加载先前生成的 G 代码文件。使用软件的手动控制功能，从注射器中挤出少量水凝胶，以确保材料能持续通过喷嘴，然后启动打印过程。打印完成后，使用 3D 生物打印机的紫外光系统照射支架，进行 5 分钟的光交联，光照强度为 20 毫瓦每平方厘米。利用体视显微镜拍摄支架图像，并在图像中包含尺子或卡尺作为参照，以评估打印质量和支架结构。对图像进行校准，精确测量 3D 打印支架及其孔径尺寸。使用 2% 琼脂糖去聚合溶液将 3D 打印支架固定于 12 孔培养板的各孔中。将支架牢固地附着在孔底，以防止在类球体接种及后续培养过程中发生位移。使用带宽口吸头的移液器从琼脂糖微模具中收集类球体，并转移至2毫升微量离心管中。待类球体沉降至管底后，吸除上清液。用50微升3D培养基重悬类球体。使用带宽口吸头的移液器吸取类球体，并轻柔地将其嵌入 GelMA 支

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Research

科研

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Bioengineering

生物工程

基于人类ASC生物制造的生物标准化，适用于可复制的宏观组织构造

为了构建高度有序的复杂组织结构，必须将多种材料和细胞类型组装成一个整体复合物。这种组合设计结合了器官特异性的分层细胞片，以及两种不同的生物来源材料，后者包含强韧的纤维基质基础和内皮细胞，以促进新生血管的形成。...

组织工程：构建用于递送分层细胞片的多细胞三维支架

本论文描述了利用表面标志物表达和细胞分选技术构建明确组成的工程化心肌组织的方法。这些明确组成的心肌组织随后可用于多组织生物反应器，以研究心脏细胞治疗的机制，从而提供一个具有功能性且可控的人类心脏模型系统。...

构建定义明确的人源工程化心肌组织以研究心肌细胞治疗机制

我们描述了一组联合使用的方案，可共同制备出具有组织模拟特性的水凝胶生物墨水，用于生物打印功能完整且存活的三维组织结构 体外...

使用组织特异性水凝胶生物墨水打印细胞化结构

我们提供一种基于微流控生物打印策略的通用方案，用于构建微纤维血管床，其中可进一步将第二种细胞类型接种于该微纤维结构的间隙空间，以生成带血管化的组织和类器官。...

用于构建血管化组织和类器官的微流控生物打印技术

本方案描述了一种利用定制的3D打印塑料模具制备不同尺寸自组装组织环的平台。将PDMS倒入3D打印模具中固化形成阴模，然后将琼脂糖注入固化的PDMS阴模中成型。将细胞接种至所得的琼脂糖孔中，细胞在其中聚集形成组织环。...

使用3D打印模具制备定制琼脂糖孔用于细胞接种和组织环自组装

本文介绍了一种快速、简便且低成本的方法，用于制备定制的聚二甲基硅氧烷模具，该模具可用于制造具有复杂几何结构的基于水凝胶的工程化组织。我们还描述了采用该技术制备的工程化心肌组织的力学性能和组织学评估结果。...

基于激光蚀刻母模定制的组织培养模具

本方案描述了一种基于网状模具的方法，用于构建具有满意结构完整性和同步搏动行为的三维无支架心肌组织。...

一种基于网状模具的无支架三维心脏组织构建方法

本文介绍一种易于使用的3D自组装心脏微组织阵列制备方法，该阵列由预先分化的人诱导多能干细胞来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞组成。这种操作简便且所需细胞量少的心脏微组织制备技术，可用于疾病建模及药物研发的早期阶段。...

利用人iPSC来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞构建三维心脏微组织阵列

本方案描述了利用标准荧光显微镜对球状体的氧合状态和细胞死亡进行多参数分析，从而实现用于生物打印的高通量球状体制备。该方法可用于控制球状体的活力并实现标准化，这对于构建三维组织、肿瘤微环境以及成功进行（微）组织生物制造具有重要意义。...

低成本氧气显微镜辅助的多细胞球体生物制造

本文介绍了一种利用自动化移液系统接种细胞悬液，实现脂肪来源基质/干细胞（ASC）球体大规模生产的方法，从而确保球体大小和形状的均一性。这些ASC球体可作为三维生物打印技术的构建单元。...

大规模自动化生产脂肪源性干细胞球用于3D生物打印

本方案描述了利用嵌入甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶并添加脱细胞外基质的人类成骨细胞构建三维骨组织的方法。该方法成本低、可扩展，并且兼容基础实验室设备，为研究肌肉骨骼疾病过程提供了一个具有转化潜力的平台。...

一种利用人成骨细胞和脱细胞细胞外基质建立骨骼肌肉疾病模型的三维骨培养平台

学习基于人源脂肪干细胞的标准化生物制造流程，利用3D打印GelMA支架和球状体组装技术构建可重复的大尺度组织构建物。该方法通过质量控制确保再生医学应用的可重复性与临床转化潜力。

基于人源ASC的生物制造中用于可重复大尺度组织构建物的生物学标准化

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