从小鼠角膜获取单细胞悬液的实验方案
2026年4月3日
本文介绍一种通过胶原酶A和胰蛋白酶序贯消化从小鼠完整角膜获取高质量单细胞悬液的实验方案。该方法获得的单细胞具有较高的RNA完整性和活性，适用于单细胞RNA测序和流式细胞术等下游应用。y.
本方案主要介绍一种从完整小鼠角膜中获取高质量单细胞的方法。我们的方法可获得具有高RNA完整性的活细胞，适用于单细胞测序及流式细胞术等下游应用。首先，将一只6至8周龄的雌性C57BL6小鼠安乐死后置于无菌解剖台上。
用 PBS 冲洗闭合的眼睑后，使用眼科剪在眼球后极处做一切口，并小心将分离的眼球置于含有冰上预冷的补充激素上皮细胞培养基的培养皿中。用添加了 5% 青霉素-链霉素的 1×PBS 冲洗眼球三次后，使用眼科剪和镊子从后极向角膜缘做一切口。沿角膜缘边界轻轻将角膜从巩膜和结膜上分离，然后使用两把镊子完全移除晶状体和虹膜。
用 PBS 清洗角膜组织三次后，将洁净的组织转移至新管中。加入 1 毫升浓度为 5 毫克/毫升的胶原酶 A 溶液，使用眼科剪将组织剪切成约 0.5 × 0.5 毫米大小的碎片。将含有角膜碎片和胶原酶 A 溶液的试管置于细胞培养孵箱中，在 37 °C 条件下孵育 1 小时。
消化过程中每 10 分钟检查一次组织。当无较大组织碎片残留时，在室温下以 300×g 离心 5 分钟，然后小心吸除上清液。接着将沉淀重悬于 200 µL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液中。
将试管放入设定为 37 摄氏度的细胞培养孵育箱中孵育 10 分钟，以消化残留的组织碎片。最后，使用配有宽口吸头的 P1000 移液器轻轻吹打混合物，以获得单细胞悬液。按照之前的方法离心细胞悬液，并将细胞沉淀重悬于含有 0.04% BSA 的 PBS 中。
使用血细胞计数板对分离的角膜细胞进行计数后发现，从八只角膜中总共获得 1.05 × 10⁵ 个细胞，平均细胞活力为 94.6%，单细胞比例超过 96.3%，证实该细胞悬液适用于后续实验。免疫荧光分析显示，细胞悬液中包含 83.5% 的泛细胞角蛋白（pan-CK）阳性上皮细胞、13.5% 的角蛋白聚糖（keratocan）阳性基质细胞，以及约 3% 的两种标志物均为阴性的细胞。从单细胞悬液中提取的 RNA 其 RNA 完整性数值（RIN）约为 8.8，28S 与 18S 核糖体 RNA 的比值约为 2.15，表明 RNA 质量优良。
获得单细胞后，我们可以表征角膜细胞的功能并探索其表面标志物，这有助于研究细胞间的相互作用。该方法的一个挑战是难以将角膜与其他组织完全分离。
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概述
本文介绍了一种从完整小鼠角膜中分离高质量单细胞悬液的可靠方案。该方法结合了精确的组织解剖与连续的酶消化步骤，能够制备适用于单细胞RNA测序（scRNA-seq）和流式细胞术等下游应用的活细胞。该方案可获得较高的细胞得率、优异的细胞活力，并保持RNA完整性，有助于对角膜细胞异质性进行深入分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 眼科学
- 细胞生物学
- 单细胞分析
背景
- 角膜是眼睛的最外层，对视觉和眼表稳态至关重要。
- 单细胞RNA测序（scRNA-seq）需要高质量的单细胞悬液。
- 角膜组织致密且复杂，使得细胞解离具有挑战性。
- 现有方案常常导致细胞活力低或RNA质量差。
研究目的
- 建立一种可靠的从完整小鼠角膜制备单细胞悬液的方案。
- 确保细胞具有高存活率和高质量的RNA完整性，以满足后续应用需求。
- 实现对主要角膜细胞类型的准确鉴定与定量分析。
使用的方法
- 处死C57BL6小鼠后解剖角膜。
- 使用胶原酶A和胰蛋白酶-EDTA进行连续酶消化。
- 机械剪碎并轻柔吹打以获得单细胞悬液。
- 台盼蓝染色结合血细胞计数板计数评估细胞活力。
- 对泛角蛋白（上皮细胞）和角蛋白聚糖（基质细胞）进行免疫荧光染色。
- 利用生物分析仪进行RNA完整性分析。
主要结果
- 从八个角膜中获得约 1.05 × 105 个细胞。
- 细胞活力高（94.6%），单细胞比例为 96.3%。
- 细胞组成：83.5% 的 pan-CK 阳性上皮细胞，13.5% 的keratocan阳性基质细胞，约 3% 对两种标志物均为阴性。
- RNA 完整性数值（RIN）约为 8.8，28S/18S rRNA 比值约为 2.15，表明 RNA 质量极佳。
结论
- 该方案可稳定地从小鼠角膜中获得高质量的单细胞悬液。
- 所制备的细胞适用于高要求的下游应用，包括单细胞RNA测序（scRNA-seq）。
- 该方法有助于深入研究角膜细胞功能及细胞间相互作用。
常见问题
行业重要性概述
从小鼠角膜获得高质量的单细胞悬液对于推动发现阶段的眼科研究以及实现高分辨率的细胞图谱分析至关重要。本方案解决了从致密的眼部组织中制备具有活性且RNA完整的单细胞这一关键瓶颈问题，直接影响下游单细胞分析结果的可靠性。高质量的细胞制备可提高靶点验证的预测可信度，并支持从发现研究到临床前研究的转化连续性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在单细胞分辨率下解析角膜细胞的异质性。
- 通过保持细胞活力和RNA完整性，支持功能靶点的验证。
- 通过精确的细胞类型鉴定，促进作用机制的去风险化分析。
- 提高早期眼科靶点筛选的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 为检测方法开发提供标准化、高活力的单细胞悬液。
- 确保下游单细胞RNA测序的可重复性和定量输出。
- 制备可用于规模化筛选工作流程的经验证生物学材料。
- 实现对化合物在不同角膜细胞群体中作用效果的可靠评估。
转化与临床前研究
- 通过保留天然角膜细胞多样性，与疾病相关模型保持一致。
- 维持RNA质量，支持转化生物标志物的发现与验证。
- 确保从发现阶段到临床前阶段的数据连续性，支持基于风险评估的推进决策。
- 降低临床前眼科研究中的生物学模糊性。
流程与工作流整合
本方案整合了早期发现与临床前研究的衔接环节，能够实现从组织解离到单细胞分析及后续功能研究的无缝过渡。
- 发现生物学：通过实现高保真单细胞分析，支持假设验证和通路解析。
- 筛选：提供可重复、定量的单细胞悬液，用于检测准备和化合物筛选。
- 分析：提供稳健的细胞活力、细胞类型定量以及RNA完整性指标，用于比较分析。
- 转化研究：保持细胞多样性和RNA质量，用于生物标志物比对和临床前验证。
- 企业级复用：建立可跨眼科研究项目适配的标准化操作流程。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证中的预测可信度，降低机制上的不确定性。
- 操作价值：提供标准化、可重复且可扩展的单细胞制备方法。
- 战略价值：支持在眼科研发中做出科学的“推进/终止”决策，提升资金使用效率。
- 项目组合影响：支持对发现阶段资产进行风险调整后的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备眼组织解剖和酶消化技术方面的专业知识。
- 需要能够使用细胞活力检测、免疫荧光以及RNA完整性分析的相关仪器设备。
- 要求跨团队标准化操作，以确保实验可重复性和数据可比性。
- 经方案优化后，可适用于其他致密组织类型。
- 组织分离的精确性至关重要，以避免污染并确保样本纯度。
