肝炎E病毒荧光减少中和测试用于测量中和抗体滴度

基于荧光还原的中和试验的主要目的是量化疫苗候选物和抗HEV抗体的中和潜力。HEV已知的细胞病理性质限制了PRND测定。该方案侧重于基于免疫的PRND训练，以便观察感染细胞，随后观察我的细胞——首先，统计新鲜分裂的HuH-7细胞。

然后，将显微镜级玻璃盖片放入12孔板中，在1毫升完整DMEM中播种20万个细胞，补充10%FBS。在37摄氏度与5%二氧化碳的温度下孵育细胞过夜。次日，向种子细胞中添加500微升无血清培养基，含1.8乘以10的幂次，按四个纯化g1-HEV基因组的幂次方。

在37摄氏度与5%二氧化碳下孵育一小时。使用500微升DPBS清洗电池三次。向孔中加入2毫升DMEM，并补充2%FBS。

将细胞与5%二氧化碳在37摄氏度下孵育72小时。用500微升DPBS洗涤细胞三次，每次洗涤间隔在室温下培养五分钟。向细胞中加入500微升4%对甲醛，并在室温下培养20分钟。

然后，按照之前的演示，用DPBS清洗细胞。洗涤后，在室温下用DPBS孵育30分钟。在DPBS中加入250微升阻断液，含5%普通山羊血清、0.5%牛血清白蛋白和0.3%Triton X100。

在室温下放入摇杆孵化一小时。去除阻隔液，用500微升DPBS清洗一次。然后以1比500稀释加入250微升初级抗体溶液。

在四摄氏度下孵育细胞一夜。第二天，按照之前的步骤，用DPBS清洗细胞三次。加入100微升二级抗体，稀释比例为1：1,000，并在室温下在腐殖箱中孵育一小时。

按照之前演示的洗涤孵育周期进行。在玻璃载玻片上加入10微升的DAPI防褪入剂。将盖片装上，电池面向试剂，同时避免气泡。

用指甲油封住封面，以便共聚焦显微镜观察。数数新鲜分裂的HuH-7细胞。然后，将显微镜级玻璃盖片放入12孔板中，每孔用一毫升完整DMEM播种20万个细胞。

次日，在无血清培养基中制备抗ORF2和兔子免疫球蛋白G抗体的十倍序列稀释，起始抗体浓度为每毫升25微克，最终稀释至10微克的负五次方。最终稀释液的体积应为100微升。然后，将4份纯化g1-HEV基因组的幂次加1.8乘以10，对每次抗体稀释。

将抗体病毒混合物与5%二氧化碳在37摄氏度下孵育一小时。用500微升的DPBS清洗细胞。将抗体病毒混合物加入细胞中。

在37摄氏度与5%二氧化碳下孵育一小时。用500微升缓冲液清洗细胞。加入含2%FBS的DMEM后，在37摄氏度、含5%二氧化碳的环境下培养72小时。

如前所述，对细胞进行免疫荧光染色处理。获取荧光图像后，打开ImageJ软件。选择文件，打开图片。

然后，选择图像，类型，点击8位，将RGB图像转换为8位格式。通过选择图片并选择调整，再选择阈值，将下级设置为40，上级设置为255来调整阈值。选择分析，选择分析粒子，并启用显示结果、清除结果、总结、排除边缘和复合感兴趣区域。

然后点击确定以获取荧光斑点计数。计算中和百分比和NT50作为Log10 NT50的反对数，使用提供的公式。绘制所有字段均值和标准差的图表。

与模拟感染细胞相比，感染细胞中检测到的g1-HEV核糖核酸水平显著。使用抗ORF2抗体进行免疫荧光测定，确认感染的HuH-7细胞中ORF2表达。抗ORF2抗体的50%中和滴度估计为2.1乘以10的3次方。

代表性图像显示，在荧光还原中和测试中出现了模拟感染和g1-HEV感染的HuH-7细胞。该方案使研究人员能够研究抗HEV抗体的中和潜力，并测量其50%中和滴度。该方案的关键步骤是分离传染性E型肝炎病毒，并进行适当的细胞染色和高分辨率图像获取。

可用RT-qPCR和ELISA等替代方法测定中和滴度，但存在一些局限性。