Name: 使用微型化 Montal–Mueller 平面脂双层系统进行单通道膜片钳记录合成 K2P 通道 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-10-09T13:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 学习使用微型化Montal–Mueller平面脂双层系统进行单通道膜片钳记录合成K₂P通道。该平台可减少试剂消耗并简化操作，适用于离子通道的单分子水平功能研究。

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感谢Sofia Diletta Guzzeloni在细胞转染实验操作中的协助。感谢Elements公司的员工Leon Juarez博士和Michelangelo Paci博士。本研究工作得到了意大利帕维亚大学分子医学系在“卓越部门计划”（2023–2027年）框架下的支持，以及Cariplo基金会（项目编号#2019-1809）和PNRR研究计划CN00000013“国家高性能计算、大数据与量子计算中心”对M.L.的资助。

F.T. 和 A.P. 分别是 Elements S.r.l. 的首席执行官和员工。其余所有作者均声明不存在竞争利益。

在本研究中，我们采用 PLB 技术在单分子水平上评估一种合成的 K2P 通道的电生理特性。在科学文献所描述的多种平面脂质模型中，我们重点关注双层脂膜（BLM）的形成，即在垂直非极性表面的孔洞上涂抹脂质，该孔洞直径介于 50 至 140 µm 之间，并分隔两个水相隔室。该构型可模拟细胞膜环境，同时能够控制实验参数，包括脂质膜的制备和电解质组成（如离子强度和 pH）3。我们采用 Montal–Mueller（折叠）法5重建双层脂膜，该方法通过升高水位，使先前铺展在两个水溶液气-水界面的脂质单层在孔洞上方自发融合，从而实现膜的自组装。
本文介绍的膜制备方案非常直观；然而，若干关键步骤会显著影响实验的成功。为确保 BLMchipMM 与放大器之间形成良好的电连接，必须避免插入 PCB 插座的 Ag/AgCl 导线端部发生氯化。在 BLMchipMM 组装过程中，若导线位置不当，可能导致其与放大器外壳接触，从而引起短路和信号饱和。孔径预处理步骤是另一个关键因素：施加预处理溶液时用力过大可能损坏聚酰亚胺隔膜，而对电解质溶液操作不当——特别是浸泡孔径区域——可能阻碍膜的形成。此外，仔细清洁 BLMchipMM 记录室对实验可重复性至关重要。使用 100% 异丙醇清洗，随后充分冲洗并彻底干燥，可确保残留物不会干扰后续实验。
该方案可进行多种修改。虽然通过浸泡漂白剂进行氯化是一种实用且广泛使用的方法，但也可采用其他方法，如电镀法43。同样，预处理和脂质制备步骤也可进行调整。标准的预处理溶液通常由长链烷烃溶解于挥发性烃类溶剂中组成36；尽管常用的是正己烷中1%的十六烷溶液，但其他溶剂也可能适用。脂质组成也可根据实验需求进行调整。虽然DPhPC脂质可提供最佳的膜稳定性，但也可使用其他脂质混合物，包括天然或合成的脂质组成36。通过折叠法形成的垂直脂双层的一个关键优势是能够构建不对称膜，即每层脂质单层由不同的脂质种类组成5,22，这一特性已知会影响膜蛋白的功能。
膜形成问题的排查通常涉及对水相液位的调整。如果初始时未能形成膜，可反复降低和升高一个隔室中的缓冲液液位，以促进双层膜的组装。若此方法无效，可在孔洞上方施加一个气泡，以促进脂质重新分布并诱导膜的形成。若仍持续无法成膜，通常表明存在预处理不当或污染问题，此时建议清洗记录室并重新开始实验。
该装置的核心组件包括 eNPR 100 kHz 紧凑型放大器和 BLMchipMM。该放大器是一种紧凑型低噪声电压钳系统，无需额外的外部设备（包括外部法拉第笼），因为放大器外壳本身即可提供有效的电磁屏蔽。BLMchipMM 是一种预组装的微型记录室，集成了印刷电路板（PCB），可直接与放大器连接。它由两个 C 形隔室组成，中间由聚酰亚胺隔膜分隔，隔膜上设有锥形激光钻孔孔径，用于形成人工膜。系统尺寸减小，隔室容积约为 110 µL，显著降低了试剂消耗，并减少了固有电容，从而提高了信号质量。此外，在遵循适当的清洗程序时，该装置可在不拆卸的情况下多次重复使用，减少了实验变异性，提高了实验可重复性。
尽管具有这些优势，但仍需考虑一些局限性。当前的装置未包含温度、压力或灌注控制的集成模块。已有研究报道，细胞膜的本征张力会影响机械敏感性通道（如TREK144,45,46）；然而，本实验装置未实现对膜张力的可控调节，因此本文未得出任何关于机制的结论。总体而言，该平台为在人工膜中记录离子通道活性提供了一个稳定且易于实现的系统。在本研究中，我们探究了一种合成的K2P通道ancTREK1，它是通过计算方法推导出的TREK亚家族的祖先通道。记录的数据表明，将纯化的ancTREK1重组到平面脂双层（PLBs）中后，其表现出与已报道的TREK1样电导特性一致的单通道行为。在无Mg2+、对称的200 mM钾离子条件下，该通道呈现出可测量的电流-电压（I–V）关系，在+80 mV时电流幅值约为13 pA，在−80 mV时为−19 pA。此外，ancTREK1表现出TREK1通道特有的高电导模式，在负电位下的电导较高（约205.6 pS），而在正电位下的电导较低（约112.8 pS）。值得注意的是，ancTREK1在正电位下表现出更高的NPo值（80 mV时为0.78），而在负电位下NPo值降低（−80 mV时为0.53，−120 mV时为0.28），这与在切除膜片构型中的观察结果不同42。这些结果支持将该系统用于重组膜蛋白单通道记录的概念验证研究。

将离子通道重建到人工脂双层膜（也称为黑脂膜，BLM）中，是进行单分子水平离子通道电生理表征的成熟技术之一1。BLM 的优势源于其结构：事实上，平面脂双层（PLB）是在非极性表面的小孔内形成的，将两种液体溶液分隔开来。因此，通过模拟生物膜，可在高度可控的条件下记录离子通道的活性，包括膜脂组成以及电解质或化学化合物的浓度，同时保持两侧均可接触。这种可及性还允许直接插入离子通道，例如通过胶束溶液或脂质体介导的融合方式2,3。
首个被描述的人工膜系统是采用涂膜技术构建的4，该方法使用画笔将溶解于非挥发性有机溶剂中的脂质液滴涂抹在小孔上。随后在小孔两侧加入水溶液，即可自发形成脂双层。然而，该方法的一个显著缺点是残留的溶剂痕迹可能影响膜的性质。为了减少脂双层中残留的有机溶剂含量，人们开发了折叠法5，从而能够形成“无溶剂”双层脂膜（BLM）。在此方法中，将脂质的挥发性溶剂溶液铺展在水面上形成两个单分子层，然后通过逐步升高水相液面至小孔上方，使这些脂质单分子层在小孔处折叠形成双层结构。然而，尽管所获得的BLM被称为无溶剂，成功形成双层膜仍需预先在小孔上涂覆一层非挥发性溶剂。这些实验所需的核心组件是一个记录室，其由一个带有小孔（直径为50–250 µm）的疏水隔膜分隔成两个水相腔室（通常称为cis和trans腔室）（图1）。银/氯化银（Ag/AgCl）电极插入每个腔室中。当浸入电解质溶液时，这些电极建立起脂双层与记录装置之间的电化学连接。后者包含一个电压钳放大器，可精确控制跨膜电位，并同时测量穿过嵌入的成孔蛋白的离子电流。
<img alt="脂双层离子通道示意图；膜片钳实验装置；闭合/开放通道状态分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig1.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figure 1"> 
图1：平面脂双层（PLB）膜片钳实验装置示意图。 该图展示了进行平面脂双层实验所需的核心组件。记录室由两个水相隔室（顺式和反式）组成，两者之间由含小孔的疏水性隔膜分隔，脂双层即形成于小孔处。银/氯化银（Ag/AgCl）电极浸入各隔室的电解质溶液中。其中一个电极施加电压刺激（如正弦波、方波或三角波），另一个电极接地，并连接至电流-电压转换器，将离子电流转换为成比例的电压信号。该信号经放大、可选滤波、数字化后被记录，用于实时监测与分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
此外，还建立了其他形成双层脂膜（BLM）的方法。其中一种常用方法是在膜片钳移液管尖端形成悬浮的脂质双层膜。相应地，尖端浸入法6可通过将移液管尖端反复穿过空气-水界面的脂质单层，从而在直径约为4 µm的玻璃微移液管开口处形成无溶剂的悬浮脂质双层膜，每次穿过时捕获一个单层。膜片钳技术也已用于脂质双层膜中的单通道测量。例如，在穿出法7中，使用直径为10至80 µm的玻璃移液管，对原本涂覆在记录室开口上的大面积膜进行封接。另一种方法是脂质体-膜片法，该方法利用预先形成的纳米至微米级囊泡作为无溶剂的双层脂膜8,9。特别是，巨大单层囊泡已广泛应用于不同膜片钳构型下的单通道记录，包括细胞附着式和游离膜片式10,11。
近年来，也出现了多种可并行且自动化形成多个双层膜的平台。其中一种方法是液滴界面双层膜（droplet interface bilayer, DIB）技术12，该技术将水相液滴置于脂质-溶剂混合物中。在此方法中，脂质单层膜会自发地在液滴周围组装，当两个液滴相互接触时即形成双层膜。在某些实验装置中，可在水凝胶上形成DIB，以提高膜的稳定性13。另一种基于玻璃移液管尖端形成DIB的方法是接触气泡双层膜（contact bubble bilayer, CBB）法14，该方法使用两根微移液管将水相气泡引入油相中。与DIB方法类似，当两个包覆脂质的气泡接触时，脂质双层膜会自发形成。另一种平台是阵列式BLM系统，其由定义明确的微米至纳米级孔洞按网格状排列组成。在这些系统中，悬浮脂质双层膜可通过手动方式形成——例如涂抹法或折叠法，或通过脂质体囊泡破裂法15,16,17；也可通过与微流控通道结构联用，依次注入脂质溶液和缓冲液实现自动化成膜18,19。
尽管已有多种方法可用于形成无溶剂双层脂膜（BLM），但本研究聚焦于在微型化且集成化的平台上采用折叠法，以研究嵌入人工脂双层中的膜蛋白的单通道行为。实验使用Elements装置进行，该装置由两部分组成：Elements纳米孔读取器（eNPR放大器）和BLMchipMM（图2A 和 图2B）。前者是一种紧凑型低噪声电压钳放大器，通过构成完整且独立的单元简化了实验操作空间，无需额外的外部设备。BLMchipMM是为Montal–Mueller技术设计的预组装微型系统，作为实验接口使用。它包含一个透明的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）记录室，并与印制电路板（PCB）集成，PCB上设有两个插槽，用于固定Ag/AgCl导线作为电极，可直接连接至放大器。记录室的核心结构由一片聚酰亚胺隔膜密封于两个透明PMMA部件之间构成。隔膜厚度为50 µm，仅在中央一小区域（3.78 mm2）减薄至25 µm，以促进双层膜的形成。在此较薄区域的中心，通过激光钻孔形成一个锥形孔道，以增强脂双层的机械稳定性20,21。提供四种孔径（50、75、100和140 µm），可调节膜电容（表1）。每个PMMA部件均设有一个C形腔室，体积为110 µL，在聚酰亚胺隔膜两侧形成两个流体腔室，用于容纳电解质溶液。每个PMMA块的相对两侧均钻有倾斜的流体通道：其中一个通道用于插入Ag/AgCl电极，另一个则可通过移液手动调节储液池中的缓冲液液位。
<img alt="模块化腔室的微流控装置；示意图显示PMMA侧、电极和用于分析的PCB。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig2.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="图 2"> 
图 2：集成式Elements纳米孔读取器与BLMchipMM系统。 （A）BLMchipMM插入专用的Elements纳米孔读取器（eNPR）放大器插槽中的实物照片。 （B）BLMchipMM组件的示意图，包括聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）记录腔室、含有微孔的聚酰亚胺隔膜，以及带有Ag/AgCl电极插座和腔室对准插槽的印刷电路板（PCB）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>孔径 (µm)</td>
			<td>50</td>
			<td>75</td>
			<td>100</td>
			<td>140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>孔厚度 (µm)</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>典型膜电容 (pF)</td>
			<td>20–40</td>
			<td>40–60</td>
			<td>60–90</td>
			<td>90–140</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：现有BLMchipMM光阑规格的特性。 具有50、75、100和140 µm光阑的BLMchipMM装置的孔径直径、光阑区域隔膜厚度以及典型的膜电容值。膜电容值针对由1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱脂质形成的双层膜给出。
通常，实验室中使用的记录室为自制装置或市售设备。对于前者，构建系统需要组装多个组件，并开发一种可靠的方法在隔膜上制备开口，这可能会限制许多实验室的使用。即使使用市售设备，也通常需要在每次实验前手动整合多个组件。相比之下，BLMchipMM 已预先组装完成，在常规清洗过程中无需在实验间拆卸。只要所用溶剂与设备材料相容，同一装置即可清洗后重复用于多次实验，且不影响膜的形成质量。这减少了由操作者引起的变异性，并最大限度降低了因手动密封元件导致的泄漏风险。使用外部可更换且可再生的银丝电极进一步延长了系统的使用寿命，特别是在加速电极消耗的实验条件下。
此外，自制设备通常具有较大的腔室体积，增加了实验所需的生物和化学组分用量。相比之下，BLMchipMM 的微型化设计可显著减小实验体系体积，从而大幅降低试剂、蛋白质及其他化合物的消耗。当研究难以表达或产量较低的膜蛋白，或待测化合物合成成本较高而显著增加实验总成本时，这一优势尤为突出。重要的是，BLMchipMM 能够形成溶剂用量最少的双层膜，并支持不对称膜结构的构建，即膜的每一侧脂质单层可由不同种类的脂质分子组成。5,22，有助于在受控条件下研究膜蛋白功能。
传统上，电流测量使用专为膜片钳实验设计的放大器进行，这类放大器通常需要连接独立的数字化仪，以通过图形界面实现数据采集和控制。这些系统不仅体积庞大且价格昂贵，而且对于非专业用户而言，其设置过程往往不够直观。此外，由于记录腔室的尺寸以及标准放大器的设计——通常缺乏内置屏蔽以保护前置放大器输入端免受静电干扰——通常需要使用外部法拉第笼。此类法拉第笼的质量及其接地状况会显著影响系统的噪声水平。BLMchipMM 与紧凑型集成放大器配合使用时，通过减少对外部组件的需求简化了系统配置。信号的数字化在设备内部完成，系统外壳提供屏蔽，降低了对环境电磁干扰的敏感性。
为了展示该平台的适用性，我们采用了计算推导出的TREK亚家族祖先成员ancTREK1（一种K2P样通道），补充图1），用作测试蛋白以验证成功重组及单通道记录。K2P 通道形成二聚体钾漏通道，可调节静息膜电位和细胞兴奋性，其中TREK通道是已被充分表征的一个亚家族。

<table><tbody><tr><td>1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱 (DPhPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850356P</td><td>人工脂双层的形成</td></tr><tr><td>2-丙醇 (&amp;ge;99.5%)</td><td>Honeywell</td><td>24137-5L</td><td>BLMchipMM 装置的清洗</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP160-500</td><td>琼脂糖凝胶的制备</td></tr><tr><td>琼脂糖凝胶水平电泳系统</td><td>BTLabSystems</td><td>BT102</td><td>DNA 片段的分离</td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1760-25</td><td>转化细菌的筛选</td></tr><tr><td>抗-GFP 纳米抗体 Sepharose 树脂（自制）</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>GFP 标签蛋白的亲和纯化</td></tr><tr><td>Anza 碱性磷酸酶</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN2208</td><td>载体去磷酸化</td></tr><tr><td>Anza EcoRI</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN0116</td><td>限制性酶切</td></tr><tr><td>Anza NotI</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN0014</td><td>限制性酶切</td></tr><tr><td>Anza Red Buffer (10&amp;times;)</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN2008</td><td>限制性酶切缓冲液</td></tr><tr><td>抑肽酶蛋白酶抑制剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>15996008</td><td>防止蛋白质降解</td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>EP5420000164</td><td>细胞沉淀和样品制备</td></tr><tr><td>BLMchipMM</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>平面脂双层的形成</td></tr><tr><td>胆固醇半琥珀酸酯 (CHS)</td><td>Anatrace</td><td>CH210</td><td>膜蛋白的稳定</td></tr><tr><td>考马斯亮蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1125530025</td><td>蛋白质染色</td></tr><tr><td>家用漂白剂</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>银丝的氯化处理</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td>降低裂解液黏度</td></tr><tr><td>双蒸水</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>缓冲液和溶液的配制</td></tr><tr><td>乙醇（纯，99.9%）</td><td>Girelli Alcool s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Ag/AgCl 电极丝的清洗</td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1116080030</td><td>DNA 染色</td></tr><tr><td>超细砂纸</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>去除电极丝上的 Ag/AgCl 涂层</td></tr><tr><td>eNPR 100 kHz 放大器</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>电生理记录</td></tr><tr><td>从琼脂糖中提取 DNA 的 Gel-Out 试剂盒</td><td>A&amp;A Biotechnology</td><td>023-250</td><td>DNA 纯化</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb DNA 标准分子量标记</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM0311</td><td>DNA 片段大小参照</td></tr><tr><td>FreeStyle&amp;trade; 293-F</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R79007</td><td>ancTREK1 蛋白的表达</td></tr><tr><td>HEPES (&amp;ge;99.5%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td>缓冲剂</td></tr><tr><td>十六烷 (&amp;ge;99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6703-100ML</td><td>孔洞预处理</td></tr><tr><td>正己烷 (&amp;ge;99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>139386-100ML</td><td>脂类溶剂</td></tr><tr><td>自制 5&amp;times; DNA 上样染料</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>DNA 样品制备</td></tr><tr><td>自制 6&amp;times; Laemmli SDS 缓冲液（还原型）</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>蛋白质样品制备</td></tr><tr><td>自制脱色液</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>SDS-PAGE 凝胶脱色</td></tr><tr><td>自制 HRV-3C 蛋白酶</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>融合蛋白的切割</td></tr><tr><td>自制 SDS-PAGE 电泳缓冲液 (10&amp;times;)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>SDS-PAGE 电泳缓冲液</td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10221</td><td>His 标签蛋白的洗脱</td></tr><tr><td>批次式纯化柱</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>蛋白质纯化流程</td></tr><tr><td>Innova44 摇床培养箱</td><td>New Brunswick Innova</td><td>M1282</td><td>细胞培养生长</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Honeywell</td><td>31248-1KG</td><td>电解质和缓冲液配制</td></tr><tr><td>LB 培养基（Lennox）</td><td>Condalab</td><td>1231</td><td>细菌培养</td></tr><tr><td>亮抑蛋白酶肽蛋白酶抑制剂</td><td>Thermo Scientific</td><td>78435</td><td>防止蛋白质降解</td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Acros Organics</td><td>447700010</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>Nanodrop 分光光度计</td><td>DeNovix</td><td>DS-11</td><td>DNA 和蛋白质定量</td></tr><tr><td>n-十二烷基-&amp;beta;-D-麦芽糖苷 (DDM)</td><td>NeoBiotech</td><td>NB-19-0056-25G</td><td>膜蛋白增溶</td></tr><tr><td>Ni Sepharose 高性能树脂</td><td>Cytiva</td><td>17526801</td><td>IMAC 纯化</td></tr><tr><td>笔记本电脑</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>仪器控制和数据采集</td></tr><tr><td>Optima LE-80K 超速离心机</td><td>Beckman</td><td>365668</td><td>膜组分分离</td></tr><tr><td>戊烷 (&amp;ge;99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236705-100ML</td><td>脂类溶剂</td></tr><tr><td>胃蛋白酶抑制剂 A (Pepstatin A)</td><td>Thermo Scientific</td><td>78436</td><td>防止蛋白质降解</td></tr><tr><td>Phusion GC 缓冲液 (5&amp;times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F519</td><td>PCR 缓冲液</td></tr><tr><td>Phusion 高保真 DNA 聚合酶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td>PCR 扩增</td></tr><tr><td>PMSF 蛋白酶抑制剂</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td>裂解过程中蛋白质保护</td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺 (PEI)</td><td>Clinisciences</td><td>24765-100</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>ProteinEle 预制 Tris-甘氨酸凝胶 (4&amp;ndash;20%)</td><td>TransGen Biotech</td><td>DG101-01-V2</td><td>蛋白质分离</td></tr><tr><td>SDS-PAGE 凝胶电泳系统</td><td>Bio-Rad</td><td>1658002FC</td><td>蛋白质电泳</td></tr><tr><td>丁酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11079</td><td>蛋白表达增强剂</td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0011</td><td>DNA 连接</td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶缓冲液 (10&amp;times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B69</td><td>连接反应缓冲液</td></tr><tr><td>PCR 仪（Mastercycler Nexus）</td><td>Eppendorf</td><td>6331000025</td><td>PCR 扩增</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td>缓冲液配制</td></tr><tr><td>含卵磷脂和吐温 80 的胰蛋白胨大豆琼脂</td><td>HiMedia</td><td>M449-5KG</td><td>细菌涂布</td></tr><tr><td>两根银丝</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>电生理实验电极</td></tr><tr><td>超滤离心浓缩管（截留分子量 50 kDa）</td><td>Merck Amicon</td><td>UFC8050</td><td>蛋白质浓缩</td></tr><tr><td>pEG BacMam 表达载体</td><td>Addgene</td><td>160687</td><td>蛋白质表达</td></tr><tr><td>USB 数据线</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>放大器与计算机之间的连接</td></tr></tbody></table>

使用微型化 montal–mueller 平面脂双层系统进行单通道膜片钳记录合成 k2p 通道

Single-Channel Electrophysiology Using a Miniaturized Montal&#8211;Mueller Planar Lipid Bilayer System for Recording a Synthetic K2P Channel

将离子通道功能重构到平面脂双层中，为在单分子水平上研究通道活性提供了一种策略。然而，传统的 Montal–Mueller 脂双层系统通常需要庞大的实验装置、手动组装记录腔室以及相对较大的记录体积，这不仅增加了试剂消耗，还可能因延长的布线和外置前置放大器而引入额外的电噪声。本文介绍了一种微型化、即用型的脂双层平台（BLMchipMM），该平台集成了紧凑型放大器，能够实现稳定的单通道记录，同时减少试剂消耗并简化操作流程。本方案详细描述了利用该系统进行单通道电生理测量的操作方法。通过该系统，我们成功重构了一种合成的 K2P 通道（ancTREK1），并以其作为原理验证的测试蛋白，用于验证通道的重构与单通道记录。单通道记录结果显示，在不含 Mg2+ 的对称 K+ 溶液中，该通道呈现电流–电压关系，其电导值与文献报道的 TREK1 通道一致。成功重构此类 K2P 类通道表明，该系统可用于人工膜中的单通道分析。

PLB 膜的电流-电压（I–V）特性
双层膜的固有疏水性质使其对带电物质具有不可渗透性。然而，施加外部电场可诱导形成纳米级的瞬时孔隙，从而影响膜的通透性和电导率33。为了评估由1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱脂质形成的人工双层膜的质量，在未插入蛋白质的情况下测定了膜的电容、电阻以及电流-电压（I–V）特性。施加一系列从±20至±200 mV（以±20 mV为增量）的电压阶跃，并记录相应的跨膜电流。数据以5 kHz采样，经2.5 kHz低通滤波处理。
膜电容（Cm）和膜电阻（Rm）是评估双层膜质量的关键参数。磷脂双分子层（PLB）可用一个等效的电阻-电容（RC）电路来描述，其中膜表现为一个与电阻并联的电容34。电容成分反映了膜储存电荷的能力，而电阻成分则反映了离子通透性。施加三角波电压会生成方形的电容性电流响应，该响应与膜电容成正比，关系如下：
<img alt="电容电流公式 I_c=C_m(dv/dt)，用于说明电路分析。" src="/files/ftp_upload/69903/69903eq1.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Equation 1">    (1)
其中，Cm 为膜电容，V 为施加电压，t 为时间。膜形成后，由于双层膜逐渐变薄，电容值可能随时间增加35。若将膜视为平行板电容器，则电容与膜面积和厚度的关系如下：
<img alt="脂质电容公式、方程、教学示意图、介电常数。" src="/files/ftp_upload/69903/69903eq2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="方程 2">    (2)
其中，εlipids 为脂质核心的介电常数（约 2），ε0 为真空介电常数，A 为膜面积，d 为膜厚度36,37。
利用欧姆定律测定膜电阻33：
<img alt="电动势方程 Ir=V/Rm 公式，用于电阻的教育示意图。" src="/files/ftp_upload/69903/69903eq3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Equation 3">    (3)
其中，V 为施加的电压，Rm 为膜电阻。在无离子通道的情况下，膜电流保持在接近 0 pA 的水平，对应的电阻值处于千兆欧姆（GΩ）范围33。
在75和100 µm孔径的BLMchipMM器件中，电流-电压（I–V）关系在0至±200 mV范围内表现出线性（欧姆）行为。对数据进行线性拟合后，得到75 µm孔径膜的电阻值为847 ± 16 GΩ（n = 6）（图8A，圆圈），100 µm孔径膜的电阻值为980 ± 32 GΩ（n = 7）（图8A，方块）。在电流轨迹的3秒时间段内测得的RMS噪声值，100 µm孔径为3.1 ± 2 pA（n = 7），75 µm孔径为2.6 ± 0.1 pA（n = 6）。通过在约2分钟的时间间隔下持续1小时测量电阻，评估膜的稳定性（图8B）。形成的良好膜通常可稳定维持超过1小时，足以满足大多数电生理实验的需求。这些膜通常可耐受高达±200 mV的施加电位而无不稳定迹象，而膜破裂则发生在±220至±300 mV之间，具体数值取决于个别双层膜。当75 µm孔径的电容值在40至60 pF之间、100 µm孔径的电容值在60至90 pF之间，且在100 mV下的电流值≤0.5 pA时，认为该膜适合用于蛋白质插入。
<img alt="电压-电流和电阻-时间图，双层膜芯片研究，数据分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig8.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="图 8"> 
图 8：平面双层膜的电学表征。（A）在 75 µm 和 100 µm 孔径上形成的双层膜的电流–电压（I–V）关系，显示在 ±200 mV 范围内呈线性（欧姆）行为。线性回归得到的膜电阻值分别为 847 ± 16 GΩ（n = 6）和 980 ± 32 GΩ（n = 7）。（B）通过在 1 小时内以每 2 分钟间隔监测电阻来评估膜的稳定性。膜在 ±200 mV 电压下保持稳定，并在 ±220 至 ±300 mV 之间的电压下发生破裂。数据以均值 ± 均值标准误（SEM）表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
ancTREK1 单通道行为的初步表征
合成的ancTREK1被纯化并重组到PLB中，使用电压阶跃程序在−120至120 mV范围内（以20 mV为增量）监测单通道活性。单通道记录（图9A和图9B）显示出K2P通道特有的闪烁行为38。在80 mV时，平均电流幅度为13.02 ± 0.78 pA（n = 5），而在−80 mV时电流幅度增加至−18.72 ± 0.25 pA（n = 5）（图9C）。所得的I–V关系曲线表明，在无Mg2+、对称200 mM钾条件下，正负电位均能检测到单通道电流（图9D）。由于电流幅度是根据以5 kHz采样、2.5 kHz低通滤波的记录数据构建的全点直方图估算得出，因此该I–V关系主要用于描述性原理验证，而非详尽的生物物理表征。
<img alt="离子通道活性分析；在 +80 mV 和 -80 mV 下的电流轨迹图及振幅直方图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig9v2.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="图9"> 
图9：合成ancTREK1的单通道活性。（A 和 B）分别在 80 mV 和 −80 mV 下记录的代表性单通道电流轨迹。虚线表示通道关闭水平。（C）正电位（左）和负电位（右）下的全点振幅直方图。（D）在对称的 200 mM 钾离子（K+）条件下且无二价阳离子时 ancTREK1 的电流-电压（I–V）关系。曲线采用四阶多项式拟合，电导值由 ±80 mV 处的斜率得出。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig9largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
尽管与哺乳动物TREK1通道相比，ancTREK1缺少延伸的N端和C端区域，但在重组后仍保持功能活性。与哺乳动物TREK1在正电位下表现出高电导和低电导模式（分别为132 ± 5 pS和41 ± 5 pS）不同39，ancTREK1仅表现出大电导模式。在正电位下的单通道电导为112.8 ± 10.8 pS（80 mV，n = 5），与在对称钾离子条件下报道的TREK通道电导值（85–130 pS）一致38,39,40,41。在负电位下，电导增加至205.6 ± 2.05 pS（−80 mV，n = 5），这与先前报道的TREK1行为相符39。值得注意的是，与使用切除式膜片钳记录获得的TREK1数据相比，ancTREK1表现出更高的归一化开放概率（NPo）42。NPo–电压关系显示，在正电位下通道活性增加，在80 mV时达到0.78 ± 0.02（n = 5）。相反，在负电位下NPo降低，在−80 mV时为0.53 ± 0.04，在−120 mV时为0.28 ± 0.03（图10）。
<img alt="离子通道电生理实验结果，NPo 与电压（mV）关系图、柱状图比较、数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig10.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="图 10"> 
图 10：ancTREK1 单通道活性的电压依赖性分析。 标准化开放概率（NPo）随膜电位的变化关系（左图），以及在 +80 mV 与 −80 mV 时 NPo 的比较（右图），显示在正电位下通道开放概率增加。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1. 合成的祖先双孔域钾离子（K2P）通道（ancTREK1）的氨基酸序列。 用于膜片钳电生理记录的ancTREK1全长氨基酸序列。该序列通过祖先序列重建方法推断获得，所用数据集为经过人工筛选的TREK/TRAAK家族成员序列，包括从UniProt和NCBI数据库收集的直系同源序列，经保守孔区基序筛选、序列比对，并采用最大似然法构建系统发育树进行分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了使用集成放大功能的微型 Montal–Mueller 平面脂双层系统进行稳定的单通道记录的方法。通过重组纯化的合成 K2P 通道以验证系统性能，展示了该方法的应用。

使用微型化 Montal–Mueller 平面脂双层系统进行单通道膜片钳记录合成 K2P 通道

将离子通道功能重建于平面脂双层中，为在单分子水平上研究通道活性提供了一种策略。

我们的研究致力于通过整合结构生物学与电生理学技术，阐明离子通道和转运蛋白的功能机制。传统的双层膜实验装置需要复杂的仪器和手动组装，而本平台则是一种微型化、即用型系统，集成了紧凑型放大器。首先，通过仪器校准并准备银或氯化银电极，来搭建电生理实验装置。将两根未氯化的银丝末端插入印制电路板（PCB）插座中。将银丝的氯化端放入聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）组件上钻出的流体通道内。轻轻旋转黑色脂质膜芯片（BLMchipMM），并通过将PMMA记录室底部的齿状结构嵌入专用插槽，将其安装到PCB上。确保导线到达流体通道的末端。准备100微升含1%（体积比）正十六烷的100%正己烷溶液，用于隔膜孔的预处理。将1,2-二植酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPhPC）脂质溶于100%正戊烷中，终浓度为15 mg/mL。在室温下配制电解质记录溶液：将3毫升1摩尔氯化钾储备液与150微升1摩尔HEPES储备液混合，再加入重蒸水定容至15毫升，该溶液可在4摄氏度保存最多一周。使用移液枪头，在隔膜孔的两侧各加入2 µL体积分数为1%的十六烷正己烷溶液进行预处理。在23至25°C、相对湿度45%至50%的条件下，让溶剂蒸发5分钟。将组装好的BLMchipMM插入放大器中。通过USB线缆将放大器连接至计算机，然后打开数据采集软件。将电流量程设置为2 nA，并启动电阻-电容估算工具以监测膜的电容和电阻。使用0.2 µm的注射器滤器过滤记录溶液。向每个腔室加入30 µL记录溶液，液面填充至孔口下缘为止，避免润湿周围区域。将约2.5 µL脂质溶液逐滴加入每个腔室的水相表面，随后静置2分钟使溶剂蒸发。将移液枪头以约90度角置于一个腔室底部，加入约80 µL记录溶液，并对第二个腔室重复此操作。关闭法拉第屏蔽罩盖子，监测电流信号。施加幅值为100 mV、频率为10 Hz的三角波电压，以评估膜电容。以20 mV为步长，施加±200 mV范围内的阶跃电压，以评估膜电阻。采用5 kHz采样率和2.5 kHz低通滤波器监测电流及噪声水平。使用克隆和转化方法制备ancTREK1表达载体。利用含有GFP和His8标签的载体在293F细胞中表达ancTREK1。使用含去垢剂的裂解缓冲液溶解膜蛋白。采用镍-次氮基三乙酸和抗GFP亲和层析方法纯化ancTREK1蛋白。将纯化的ancTREK1蛋白浓缩后于-80摄氏度保存。将ancTREK1用记录液稀释至约2微克/毫升。取1微升稀释后的蛋白溶液加入靠近隔膜孔的顺式室中。记录前关闭法拉第笼盖子。以±20毫伏为步长施加电压，直至±120毫伏。监测离散的电流跃迁，以确认离子通道插入事件的发生。在75和100微米孔径条件下，电流-电压关系在±200毫伏范围内均呈线性行为，且膜电阻较高。在±200毫伏范围内，均方根（RMS）噪声保持较低水平，膜稳定性持续超过一小时，未出现不稳定现象。

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