免疫染色和染料穿透实验，用于定义 果蝇 胚胎上皮中核心褶皱的隔板连接蛋白

我们的研究探讨隔板连接蛋白的发育非闭塞功能，重点是识别和表征参与其结构及生物作用的新成分。该方案旨在表征果蝇胚胎外胚层上皮中褶皱隔板连接的组织和闭塞功能。首先，将健康且符合相应基因型的雄性和雌蝇交配，并将其放入胚胎采集笼中，配上涂抹酵母膏的新鲜苹果汁盘。

让成虫在苹果汁盘上产下受精卵。将卵子收集箱中的平板取出，产卵后以25摄氏度进行13至16小时的陈化，达到第16阶段。然后将第16期胚胎固定在合适的固定溶液中，并用所需抗体进行免疫染色。

为了获得最佳效果，建议用40倍油浸物镜在共聚焦显微镜上拍摄胚胎。聚焦目标胚胎后，将激光强度和增益调高，以实现强烈的荧光信号且不使像素过饱和。通过中肠形态学识别不表达平衡剂编码绿色荧光蛋白的第16期胚胎。

将扫描重点放在唾液腺或后肠，并将Z扫描定位到尽可能大的腔径，以便直观观察上皮细胞的完整侧膜。设定合适的线平均值，并在至少20个对照胚胎和20个Cora 4突变体16期胚胎中成像极化组织。仅记录粘附连接标记紧邻膜顶端外侧区域的胚胎数据。

在野生型第16期胚胎中，评估侧膜顶端靠近附着连接处的褶皱隔板连接蛋白富集情况。记录突变体侧膜上褶皱隔断连接标记的持续分布。将标记为10千道尔吨右旋糖酐的10千道尔吨右旋糖酐溶解在0.5摩尔磷酸钠、pH值7.5、5毫莫拉氯化钾中，制成新鲜染料溶液。

使用拔针器，将外径1毫米、内径0.5毫米的毛细管和纤维拉入玻璃针中。接着，将玻璃针放入微型机械臂的针架，并将微型机械臂与倒置显微镜并排。将针头尽可能与显微镜载玻片平行，并降低到与载玻片侧面相同的Z平面。

用针尖敲击显微镜载玻片侧面，折断针尖。将针抬高于滑套水平，取出以便装填。接着，使用最小的移液器尖端将染料填充毛细管。

将填充好的针重新装入针架。通过在显微镜载玻片表面的一滴卤碳油中注入少量10千道尔吨右旋糖酐的流动。用22 x 22毫米的2号厚度封面套，在苹果汁盘上画一条凹陷线。

将对照组和Cora 4突变体各排25个胚胎，分别在16或17阶段，放在苹果汁盘上。确保它们的后端沿线对齐，腹面朝上。然后在22 x 22毫米的2号封面套片上贴上一块双面胶带。

将胶带接触胚胎管线，轻轻摩擦盖片，将胚胎从平板转移到双面胶带上。接着，在显微镜载玻片上滴一滴卤碳油，并通过毛细作用将盖片粘结到载玻片上。将套滑套朝向滑套侧面，靠近任何结霜部分的对面。

将胚胎在干燥剂容器中干燥三到五分钟，并用盐碳油完全覆盖胚胎。将载玻片与胚胎一起安装到倒置显微镜上，胚胎朝上并背对物镜。将微操作器对准，使针头朝向胚胎后端，角度尽可能接近胚胎，并调整微操作器的Z轴，使针尖沿背腹轴与胚胎中点对齐。

接着，快速将胚胎插入针头，使针尖进入血腔。使用10-25或50毫升注射器注射约0.2至0.5纳升的染料。迅速拔针，将培养皿移至下一个胚胎进行造影剂注射。

然后在胚胎上加额外的卤碳油。用22 x 22毫米的2号封套覆盖胚胎，使封面套片之间形成均匀的油膜，防止压碎。注射右旋糖酐染料后，使用荧光化合物显微镜或共聚焦显微镜进行成像。

在共焦显微镜上，沿背腹轴拍摄胚胎深度约四分之一处的Z叠，以评估气管腔。检查气管腔、唾液腺或后肠是否有标记的右旋糖酐积聚。记录每个胚胎的基因型和发育阶段，以及标记右旋糖酐是否在任何管状器官中积累。

注意胚胎周围腔被强烈染料染色，这可能代表无意注射进入该腔。在野生型胚胎中，巨球蛋白补体相关（Mcr）在第13期均匀分布于侧膜沿侧膜，第14期在侧膜顶端富集，到第16期则强定位于顶端外侧区域，紧邻附着者连接处基部。皮层抗体染色定义了16期野生型胚胎中成熟的褶皱隔膜连接处，类似于Mcr。

在Cora 4突变胚胎中，Mcr在第16期未能实现强的顶端定位，仍分布在侧膜上。E-cadherin定位在野生型和Cora 4突变16期胚胎中相似。在注射标记为10千道尔顿右旋糖酐的野生型第17期胚胎中，染料包围气管但未穿透腔内。

在Cora 4突变期17胚胎中，染色剂在注射后10分钟内积累在气管腔内。该方案使研究人员能够自信地确定该基因编码的是果蝇胚胎组织中褶皱隔板连接的核心还是附属部分。胚胎分期在执行此技术时至关重要，因为这需要第16期胚胎。

隔板连接会随着时间成熟，直到在第16阶段完全建立。我们相信该方案可通过RNA干扰线有效应用于开放式遗传筛选，以识别新的褶皱隔隔连接基因。