Name: 免疫染色和染料穿透实验，用于定义 果蝇 胚胎上皮中核心褶皱的隔板连接蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-27T14:25:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 学习免疫染色和染料穿透实验方法，用于评估果蝇胚胎上皮中褶皱隔板连接蛋白的组织结构与屏障功能，帮助研究者识别核心连接蛋白组分并解析上皮屏障形成机制。

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我们感谢布卢明顿果蝇品系中心（Bloomington Drosophila Stock Center）为本研究所提供的果蝇品系。我们感谢发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank）为本研究所提供的抗体。我们还感谢凯斯西储大学（Case Western Reserve University）生物系提供其Leica MZ10F荧光体视显微镜，用于基因型鉴定和解剖用胚胎的分期，以及其DMi8倒置荧光显微镜，用于染料注射实验。我们感谢凯斯西储大学医学院遗传学与基因组科学教授Helen Salz提供显微操作仪，并制备了本研究中染料注射实验所使用的部分玻璃微针。本项目得到了美国国家科学基金会（National Science Foundation，项目编号IOS 2111069）向REW提供的资助支持。

1. 胚胎分期
<ol>
	<li>将适当基因型的健康雄性和雌性果蝇进行杂交（示例参见材料表），并将其放入含有新鲜苹果汁培养基且涂有酵母糊的胚胎收集笼中。在开始收集胚胎前，让果蝇在胚胎收集笼中适应一至两天。</li>
	<li>在苹果汁培养基上收集胚胎，并使其发育至16期（在25 °C条件下，约在产卵后13小时至16小时）。让成虫在苹果汁培养基上产受精卵1–2小时，随后将培养基从收集笼中取出，并在25 °C下继续培养至产卵后13–16小时。或者，在25 °C下过夜收集胚胎，然后在固定前或固定及免疫染色后的成像过程中挑选出16期胚胎。 
	注意：可通过肠道形态判断胚胎发育阶段，该结构在紫外光谱下的自发荧光（即DAPI通道）中最易观察。在16期胚胎中，肠道呈现为三条与身体长轴垂直的平行长椭圆形（图1H）。</li>
</ol>
2. 胚胎的固定与免疫染色
<ol>
	<li>使用尼龙网（120 mm 网孔）组装一个胚胎收集篮。用尼龙网覆盖篮口及螺纹部分，然后拧紧盖子。</li>
	<li>用毛笔和胚胎清洗液轻轻将胚胎从苹果汁培养基上分离。将胚胎混合液倒入胚胎收集篮中，并用蒸馏水冲洗胚胎。 
	注意：冲洗时应使水流沿胚胎收集篮内壁流下，避免将胚胎溅到篮壁上，以防胚胎因粘附而丢失。</li>
	<li>将装有胚胎的收集篮浸入盛有50%商用漂白剂（次氯酸钠终浓度为3.75%）的托盘中，以去除卵壳。轻轻摇动使胚胎在漂白剂中旋转，并在室温下浸泡3–5分钟。将收集篮从漂白剂中取出，再次用蒸馏水冲洗胚胎，水流仍应沿篮内壁流下。</li>
	<li>准备固定小瓶：向一个20 mL 闪烁瓶中加入等体积的新鲜4%多聚甲醛溶液和正庚烷。在通风橱中，将适量多聚甲醛溶于热的（约90 °C）1×磷酸盐缓冲液（PBS）中配制多聚甲醛溶液。为加快溶解，每10 mL PBS中加入10 µL 14 N 氢氧化钠，直至多聚甲醛完全溶解，随后加入10 µL 14 N 盐酸将pH调回中性。 
	注意：操作多聚甲醛和正庚烷时必须穿戴实验服、护目镜和手套，并仅在通风橱内进行。多聚甲醛具有致癌性和腐蚀性，正庚烷高度易燃，且对皮肤和眼睛有刺激性。</li>
	<li>拆开胚胎收集篮，将带有去壳胚胎的尼龙网浸入正庚烷中。胚胎会从尼龙网上脱落，并沉降至正庚烷（上层）与固定液（下层）之间的界面处。将固定小瓶置于摇床上，以240转/分钟（RPM）振荡20分钟，完成胚胎固定。</li>
	<li>在通风橱中用巴斯德吸管移除固定液，并将其弃入经批准的危险化学品废物容器中。加入等体积的甲醇，盖紧固定小瓶，剧烈振荡5–10秒。固定后的胚胎会从卵黄膜上撕裂并沉入甲醇层底部（下层）。未撕裂的卵黄膜及附着其上的胚胎将保留在界面处，并在步骤2.7中被去除。 
	注意：操作甲醇时必须穿戴实验服、护目镜和手套，因其具有毒性和易燃性。</li>
	<li>用巴斯德吸管移除正庚烷，并弃入经批准的危险化学品废物容器中。随后移除大部分甲醇，仅保留少量甲醇覆盖胚胎，并将甲醇弃入危险化学品废物容器中。加入5 mL甲醇，轻轻旋转混匀胚胎，静置使其沉降。再次移除大部分甲醇，并重复此洗涤步骤2次。</li>
	<li>将甲醇中的胚胎转移至0.8 mL玻璃培养管中。移除甲醇后加入750 µL封闭液（PBS加1%正常驴血清和0.1% Triton X-100）。用PBS洗涤胚胎3次，然后在摇床上以轻柔振荡方式于室温下在封闭液中孵育30分钟。</li>
	<li>再用PBS冲洗胚胎一次，然后加入封闭液及一抗。使用针对核心pSJ蛋白（如Coracle）和黏着连接蛋白（如E-cadherin）的抗体。将胚胎在4 °C下与一抗孵育过夜，或在室温下孵育3–4小时，同时在摇床上轻柔振荡。</li>
	<li>移除含一抗的封闭液，用PBS冲洗胚胎三次。加入封闭液，在摇床上以轻柔振荡方式于室温下洗涤30分钟。</li>
	<li>再次用PBS冲洗胚胎一次，然后加入封闭液及针对步骤2.9所用一抗的荧光标记二抗。在室温下孵育3–4小时，或4 °C下过夜。</li>
	<li>移除含二抗的封闭液，用PBS冲洗胚胎三次。加入封闭液，在摇床上以轻柔振荡方式于室温下洗涤30分钟。</li>
	<li>最后一次用PBS冲洗胚胎，然后用巴斯德吸管将其转移至显微镜载玻片上。用小条Whatman滤纸吸除多余PBS，注意不要触碰胚胎。用封片剂（可购买商用产品，或由90%甘油、10% 1 M Tris（pH 8.0）和0.5% n-丙基没食子酸酯作为抗淬灭剂配制）覆盖胚胎。加盖适当大小的1.5号盖玻片，并用指甲油密封边缘。</li>
</ol>
3. 免疫染色胚胎的成像与数据分析
<ol>
	<li>为获得最佳结果，使用配备40倍油浸物镜的共聚焦显微镜对胚胎进行成像。利用对照胚胎设置共聚焦显微镜的激光强度和增益，以获得较强的荧光信号，同时避免任何像素过饱和。根据中肠形态，鉴定目标16期胚胎（即不表达平衡染色体编码的GFP以识别突变胚胎）。将扫描聚焦于唾液腺或后肠，因为这些器官具有极性，并拥有较长的侧膜，有利于区分黏附连接、极性紧密连接（pSJ）以及其余侧表面。选择一个z轴位置，使唾液腺或后肠管腔的直径尽可能大，以便观察上皮细胞完整的侧膜。 
	注意：图1C 所示示例是在共聚焦显微镜上拍摄的，使用HC PL APO 40x/1.3 CS2油浸物镜，561 nm激光的激光强度为1.59、增益为3.3，638 nm激光的激光强度为2.0、增益为21.7（见材料表）。</li>
	<li>对至少20个对照组和突变型16期胚胎中的极化组织进行成像。仅记录黏附连接标记物紧密定位于细胞膜顶端侧区域的胚胎数据，以确保胚胎固定和染色适当。随后，记录pSJ标记物在侧膜上的分布情况。在野生型16期胚胎中，应观察到pSJ蛋白在黏附连接基底侧约10–15%的侧膜区域显著富集。 
	注意：即使pSJ蛋白沿侧膜长度方向有10–20%的错位定位，也提示存在pSJ结构异常。所有核心及辅助pSJ突变型胚胎中pSJ结构缺陷均具有高度外显率，因此预期可观察到75–100%的突变胚胎表现出明显错位的pSJ蛋白。</li>
</ol>
4. 染料注射的准备工作
<ol>
	<li>将罗丹明标记的10 kDa葡聚糖溶解于0.5 M磷酸钠（pH 7.5）和5 mM氯化钾溶液中，配制成1 mg/mL的新鲜染料溶液。</li>
	<li>使用拉针仪将毛细管（外径1.0 mm × 内径0.5 mm，含纤维）拉制成玻璃针。 
	注意：不同拉针仪具有各自特性，理想针尖的参数常因每日条件变化而异。良好的针尖应具有平缓的锥形并以尖锐末端收尾，其形态应介于图2A所示的两种形状之间。左侧的针过长，在插入胚胎时可能发生弯曲；可通过在离尖端更远处重新折断针尖来校正。右侧的针虽良好，但初始折断时孔径较大，可能导致注入胚胎的液体量过多。若发生此情况，应更换为更细尖端的新针。当拉针仪条件适宜、能产生理想形状的针时，最好一次性拉制多根针。多余的针可储存于密闭容器中，并使用泡沫块或胶带将各针单独固定，以防碰撞损坏。</li>
	<li>将玻璃针装入显微操作仪的针夹持器中。将显微操作仪置于倒置显微镜旁（图2F），调整针的方向，使其尽可能与显微镜载玻片表面平行，并降低至与载玻片侧面处于相同的z轴平面。</li>
	<li>通过轻触显微镜载玻片侧面的方式折断针尖。随后将针抬升至载玻片水平以上，并取下以进行装液。</li>
	<li>使用最小规格的移液器吸头（P2或P10吸头）将染料吸入毛细管中，或通过毛细作用，将针的尾端插入含有染料的1.5 mL微量离心管中完成填充。</li>
	<li>将装满染料的针重新装入针夹持器，通过向载玻片表面的卤代烃油滴中注射少量葡聚糖溶液来测试其流动情况。 
	注意：制作良好的针在未施加压力时不应漏液，且可通过调节注射器推杆所施加的压力大小来精确控制流动速率。</li>
</ol>
5. 胚胎固定与染料注射
<ol>
	<li>根据中肠形态作为分期标志，挑选第16或17期的胚胎（对照组和突变体）。</li>
	<li>使用22 × 22、厚度为#2的盖玻片在苹果汁培养基上压出一条凹线。将约25个已分期的胚胎沿该线排列，使胚胎后端接触线条，并确保腹面朝上。</li>
	<li>将一段双面胶带贴在22 × 22、厚度为#2的盖玻片上。用胶带接触胚胎排列线，并轻轻按压盖玻片，使胚胎从培养基转移到盖玻片上的双面胶带上（图2B）。</li>
	<li>在载玻片上滴加一滴卤代烃油，利用毛细作用将盖玻片固定在载玻片上。将盖玻片放置在载玻片上靠近无磨砂面的一侧。将胚胎置于干燥剂容器中干燥3–5分钟，或在实验台空气中干燥10–15分钟（图2C-E）。用卤代烃油完全覆盖胚胎。 
	注意：胚胎经干燥后会略微失去膨压，但不应明显萎蔫。图2E所示胚胎在相对湿度42%、温度21.2 °C的环境中空气干燥15分钟。</li>
	<li>将带有胚胎的载玻片安装到倒置显微镜上，使胚胎朝上（远离物镜）。调整显微操作仪，使注射针尖尽可能平行于胚胎方向对准其后端（图2G）。调节显微操作仪的z轴，使针尖对准胚胎中点（沿背腹轴方向）。</li>
	<li>通过快速移动载物台使胚胎进入针尖，使针尖刺入胚胎血腔。使用10、25或50 mL注射器注入少量染料（约0.2–0.5 nL）。迅速抽出针头，移动载物台至下一个胚胎，重复操作。在10分钟内尽可能多地完成注射。 
	注意：针尖应插入胚胎约25%深度，以避免将染料直接注入与前肠和后肠管腔相通的围卵周隙。注入的染料应使胚胎呈现&#34;膨胀&#34;状态，显得更加饱满。过度注射会导致染料与血淋巴混合形成气泡从注射部位溢出，应避免。</li>
	<li>添加额外的卤代烃油，并用22 × 22、厚度为#2的盖玻片覆盖胚胎。额外的卤代烃油可在两片盖玻片之间形成更均匀的油层，防止胚胎被压碎。</li>
</ol>
6. 成像与数据分析
<ol>
	<li>可在荧光复式显微镜或共聚焦显微镜上进行成像（使用10x或20x空气物镜即可获得明确结果）。在共聚焦显微镜上，沿胚胎背腹轴方向对约四分之一深度进行z轴层扫成像，可判断标记的葡聚糖是否已进入气管和后肠管腔（需观察更深的切片或重新调整胚胎方向，使腹面朝上，方可观察到唾液腺）。 
	注意：图3 所示示例是在共聚焦显微镜上拍摄的，使用HC PL APO 10x/0.4 CS2干镜，561 nm激光强度设为2.0，增益设为13.6。共获取24个z轴切片，步长为2.4 nm（参见材料表）。</li>
	<li>将注射后的胚胎静置10分钟，随后检查气管、唾液腺或后肠管腔内是否有标记葡聚糖的积累。记录每个胚胎的基因型、发育阶段，以及任何管状器官中是否出现标记葡聚糖的积累。若发现卵周隙也明显被染料染色，应特别注明，此类胚胎可能被意外注射至该间隙中。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文介绍了一种利用两种相对简单的实验方法鉴定核心及附属pSJ蛋白的方案，这些实验可在具备荧光显微镜设备的普通实验室中完成。第一种方法通过共聚焦成像观察固定后的突变胚胎中成熟极化上皮内pSJ的分子结构。第二种方法通过向16期活体胚胎中注射荧光标记的10 kDa葡聚糖分子，检测pSJ封闭功能的完整性。由于这些方案操作简便，且pSJ结构与功能的缺陷可明确诊断核心或附属pSJ蛋白的突变，因此相较于荧光漂白恢复技术（FRAP）和电子显微镜等更为耗时且技术要求较高的方法具有明显优势。本方案专门适用于研究果蝇（Drosophila）胚胎发育过程中pSJ的结构与功能，不适用于sSJ或发育后期阶段。
所有核心pSJ蛋白在核心和附属pSJ突变体晚期胚胎中的错误定位具有完全的诊断意义。因此，只需在16期对突变体胚胎进行针对核心pSJ蛋白的免疫染色，即可检测任何潜在的pSJ基因。我们在此提供的方案包含一个非常标准的多聚甲醛固定步骤。只要对照组16期胚胎显示出黏附连接和pSJ标记物的预期定位，对该方案的轻微修改也是可行的。多个有用的pSJ抗体可从发育研究杂交瘤库（DSHB）获得，包括Cora、ATP酶α和N...

上皮组织的一个关键功能是将生物体内的不同区域进行区室化。形成这些不同的微环境对于器官功能的实现以及保护生物体免受外界威胁至关重要。上皮细胞之间形成的闭合连接通过阻止溶质在上皮细胞顶侧与基底侧之间的细胞旁通路流动，从而负责建立并维持这些微环境1,2。在脊椎动物中，这种闭合连接被称为紧密连接（tight junction），而在果蝇（Drosophila melanogaster）等无脊椎动物中则称为隔状连接（septate junction, SJ）1,3。节肢动物中存在两种类型的SJ，可根据其组织分布和超微结构加以区分4。皱褶状隔状连接（pleated septate junctions, pSJs）存在于外胚层来源的组织中，例如表皮、唾液腺、气管和后肠。其超微结构特征是在细胞间黏附连接的稍基底侧位置，细胞外间隙中呈现阶梯状排列的电子致密物质3,5。相比之下，光滑状隔状连接（smooth septate junctions, sSJ）则存在于内胚层来源的组织中，如中肠和马氏管，细胞之间不表现出电子致密的隔状结构6。
对果蝇（Drosophila）的遗传学研究已鉴定出30种参与浆膜连接（pSJ）结构与功能的蛋白质，并发现了一些定位于该连接处但似乎在连接的形成或维持过程中无明显功能的蛋白质（综述见7）。根据这些分析，科学家将SJs蛋白分为三类。核心pSJ蛋白定位于连接处，且对连接的建立和维持至关重要。目前已鉴定出17种核心pSJ蛋白，包括Coracle（Cora）、Neurexin IV、Macroglobulin complement-related（Mcr）、Kune-kune和ATPase alpha8,9,10,11,12。另有9种蛋白被归类为辅助性pSJ蛋白，它们对连接的建立和/或维持是必需的，但不一定定位于连接结构中。此类蛋白包括Rab5、Rab11和Coiled13,14。最后，pSJ定位于连接处的蛋白虽能定位于pSJ，但对连接的建立与维持并非必需。该类别中的四个成员示例包括Discs Large和Fasciclin III15,16。
功能完整的极性紧密连接（pSJ）的建立是一个多步骤过程，始于胚胎发育中期，此时所有核心pSJ蛋白均已完全表达。部分核心pSJ基因存在母源性表达，但所有基因在12期时均表现出强烈的合子表达17。在12期，核心pSJ蛋白定位于侧膜全长。在13至16期期间，核心pSJ蛋白被内吞，并通过pSJ区域循环回到侧膜。该过程依赖于pSJ辅助蛋白，包括Rab5和Rab1114。到16期时，核心pSJ蛋白紧密定位于侧膜上的pSJ区域。与这些观察结果一致，连接的完整封闭功能在胚胎发育15期末期实现12。这一点可通过染料通透性实验得到最佳验证。在连接形成之前，带有荧光标记（如罗丹明）的10 kDa葡聚糖颗粒可穿过细胞间的旁细胞间隙。若将标记的葡聚糖注入血腔，它会迅速积聚到管状上皮（如气管、唾液腺和后肠）的管腔内。当pSJ在生理上于15期末达到紧密状态后，注入的葡聚糖被限制在上皮的基底侧，无法在这些器官的管腔（顶膜区）中积聚。
核心pSJ蛋白具有一种共同特征，即每个核心pSJ蛋白的正确亚细胞定位都依赖于所有其他核心pSJ蛋白的存在18,19。这种在pSJ形成过程中的相互依赖性是核心pSJ蛋白的定义性特征，也是本文所介绍实验方案的基础。核心或辅助pSJ基因的突变会导致胚胎致死，并表现为在16期胚胎的侧膜区域中，其他核心pSJ蛋白发生错误定位，而非紧密定位于其正常的顶侧区域。相比之下，pSJ驻留基因的突变不会导致核心pSJ蛋白的错误定位15。在16或17期突变胚胎中，通过观察标记的10 kDa葡聚糖在气管、唾液腺或后肠管腔内的积聚，可揭示核心和辅助pSJ基因突变对pSJ功能的破坏作用。最后，区分核心pSJ蛋白与辅助pSJ蛋白的关键特征在于其亚细胞定位：核心pSJ蛋白一旦形成便紧密地与pSJ结合，而辅助pSJ蛋白虽对连接结构的组装至关重要，但并不一定驻留在连接结构中。Rab5和Rab11是辅助pSJ蛋白的最佳实例，二者均为细胞质蛋白，参与介导货物从质膜转运至早期内体和循环内体，再返回质膜的过程14。为了判断一种新发现的潜在pSJ蛋白属于核心组分还是辅助蛋白，通常可通过制备特异性抗体或表达荧光标记的重组蛋白，以确定该蛋白在pSJ成熟过程中不同阶段的定位情况。
这些实验方案的目的是明确区分潜在的核心和附属pSJ蛋白与pSJ定位蛋白。已有多个研究揭示了pSJ蛋白在发育过程中除封闭功能外的其他非封闭性作用，包括在形态发生和顶-基底极性建立中的作用17,20,21,22。随着人们对pSJ生物学的兴趣日益增加，以及更多潜在pSJ蛋白的鉴定，本文所介绍的这些简单且易于解读的实验方案将有助于研究人员准确表征这些蛋白在pSJ结构组织和封闭功能中的作用。文献中已描述了多种用于表征pSJ蛋白的其他实验方法，包括光漂白后荧光恢复（FRAP）和透射电子显微镜技术6,23。尽管这些方法通常非常有用，但本文所介绍的免疫染色实验能够快速可视化pSJ蛋白的定位，而无需依赖昂贵且耗时的超微结构分析方法；而染料通透性实验则提供了仅靠成像无法获得的pSJ完整性的功能性读数。此外，这些实验可使用常规实验室设备完成，例如高质量的荧光显微镜和基本的显微注射装置。需要注意的是，这些实验方案已针对黑腹果蝇（Drosophila）16期胚胎的分析进行了优化，不适用于评估sSJ的结构或功能。

<table><tbody><tr><td>用于针头的毛细管（Boro 1 X 0.5/Fiber）</td><td>FHC</td><td>30-30-1</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>Stellaris 5&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>用于注射的盖玻片（22 x 22，厚度2）</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540-B</td><td></td></tr><tr><td>用于成像的盖玻片（22 x 30，厚度1.5）</td><td>Corning</td><td>2980-233</td><td></td></tr><tr><td>免疫染色用培养管（6 x 50 mm）&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-958-A</td><td></td></tr><tr><td>胚胎收集笼</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-100</td><td></td></tr><tr><td>荧光体视显微镜</td><td>Leica</td><td>MZ10 F</td><td></td></tr><tr><td>卤代烃油（700）</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-131</td><td></td></tr><tr><td>正庚烷</td><td>Fisher Scientific</td><td>H350-4</td><td></td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜</td><td>Leica</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>去卵膜胚胎用网篮</td><td>Genesee Scientific</td><td>46-101</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Narishige</td><td>MN151</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>拉针仪</td><td>David Kopf Instruments</td><td>model 720</td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>尼龙筛网（120 µm）</td><td>Genesee Scientific</td><td>57-102</td><td></td></tr><tr><td>物镜 HC PL FLUOTR 10X/0.32 PH 1</td><td>Leica</td><td>11506537</td><td></td></tr><tr><td>物镜 HC PL APO 10x/0.40 CS2</td><td>Leica</td><td>15506407</td><td></td></tr><tr><td>物镜 HC PL APO 40x/1.30 CS2</td><td>Leica</td><td>15506358</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（60 x 15 mm）</td><td>Corning</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>平台式摇床</td><td>Globe Scientific</td><td>GTR-FS</td><td></td></tr><tr><td>一抗（Coracle）</td><td>DSHB</td><td>C566.9</td><td></td></tr><tr><td>一抗（Coracle）</td><td>DSHB</td><td>C615.16</td><td></td></tr><tr><td>一抗（E-cadherin）</td><td>DSHB</td><td>DCAD2</td><td></td></tr><tr><td>一抗（Mcr）</td><td>Ward 实验室，CWRU</td><td>豚鼠多克隆</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明标记的10 kDa葡聚糖</td><td>Molecular Probes</td><td>D1824</td><td></td></tr><tr><td>二抗（驴抗豚鼠Cy3）</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-165-148</td><td></td></tr><tr><td>二抗（驴抗小鼠Cy2）</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-225-151</td><td></td></tr><tr><td>二抗（驴抗大鼠Cy5）</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-175-150</td><td></td></tr><tr><td>台式摇床</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>C2 platform shaker</td><td></td></tr><tr><td>对羟基苯甲酸甲酯（Tegosept）</td><td>TCI</td><td>H0216</td><td></td></tr><tr><td>吐温X-100（Triton X-100）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151500</td><td></td></tr><tr><td>固定用小瓶（20 ml WHEATON 液体闪烁小瓶）</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-341-73C</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 3MM&amp;nbsp;层析滤纸</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-716-6H</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;果蝇品系&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;完整基因型&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;品系编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;来源&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>cor4</td><td>w*; P{neoFRT}43D cora4/CyO</td><td>52232</td><td>BDSC</td></tr><tr><td>w1118</td><td>w[1118]</td><td>5905</td><td>BDSC</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;溶液&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;配制方法&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>将90 g NaCl、20 g Na₂HPO₄ 和8.3 g NaH₂PO₄·H₂O 溶于去离子水至1 L，过滤除菌。免疫染色洗涤步骤中用去离子水稀释至1x使用。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% Triton X-100 溶液</td><td>将1 ml Triton X-100 加入9 ml 去离子水中，在平台摇床上混合至溶解。室温保存。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% 次氯酸钠溶液</td><td>去卵膜前，将10 ml 商业漂白剂（含7.5%次氯酸钠）与10 ml 水混合。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>苹果汁培养基</td><td>将15 g 果蝇琼脂加入725 ml 去离子水中煮沸，加入25 g 蔗糖和250 ml 苹果汁，搅拌均匀。待溶液冷却至55 °C 后，加入1.3 g Tegosept 并轻轻混匀。倒入60 x 15 mm 培养皿中，冷却后置于4 °C 保存。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>封闭液</td><td>在15 ml 离心管中，将9.8 ml 1x PBS 与100 µl 10% Triton X-100 和100 µl 正常驴血清混合。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胚胎洗涤液</td><td>将70 g NaCl 和2 ml Triton X-100 加入1 L 去离子水中，配制成10x胚胎洗涤液。使用时用去离子水稀释至1x。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>固定液</td><td>将10 ml 1x PBS 在微波炉中预热。加入0.4 g&amp;nbsp;多聚甲醛，用移液器混匀。加入10 µl 14 N NaOH 以加速溶解。置于90 °C 金属浴中直至完全溶解。当无固体多聚甲醛残留时，加入10 µl 14 N HCl 调节pH至中性。使用多聚甲醛时务必穿戴实验服、手套和护目镜。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>封片剂</td><td>将9 ml 甘油与1 ml 1 M Tris碱（pH 8.0）混合，加入0.05 g 没食子酸丙酯&amp;nbsp;，混匀并加热至溶解。分装至0.5 ml 离心管中。&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>罗丹明葡聚糖溶液</td><td>将罗丹明标记的10 kDa葡聚糖溶于0.5 M 磷酸钠缓冲液（pH 7.5）和5 mM 氯化钾中，配制成1 mg/ml的新鲜染料溶液。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酵母糊</td><td>将50 g 商业酵母（Red Star）与少量蔗糖及适量水混合，制成浓稠糊状。4 °C 保存。</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

免疫染色与染料渗透实验用于确定核心皱褶型紧密连接蛋白 果蝇 胚胎上皮

Immunostaining and Dye Penetration Experiments to Define Core Pleated Septate Junction Proteins in Drosophila Embryonic Epithelia

本实验方案旨在评估黑腹果蝇（Drosophila）胚胎外胚层来源的上皮组织中褶皱型隔膜连接（pleated Septate Junctions, pSJs）的结构组织及其屏障功能。pSJs在包括表皮、唾液腺、气管和后肠等外胚层组织的侧膜上形成一种闭合屏障，其功能类似于脊椎动物组织中的紧密连接。在果蝇中，已有30种蛋白质被确认为pSJs形成所必需。核心pSJ蛋白最初定位于整个侧膜区域，但随着胚胎发育至16期，这些蛋白会显著富集于连接处顶端侧膜区域，即黏附连接的基底侧。到胚胎发育晚期15期时，这些组织已具备完全功能的闭合连接。本文将介绍可用于研究对照组和突变体胚胎中pSJs结构与功能的免疫染色及染料通透性实验方案。成功应用这些方法可验证pSJs的闭合功能，并可用于检测未知基因是否编码该连接结构的核心组分。

本文所述方案用于研究16期果蝇胚胎外胚层组织中初级皮层连接（pSJs）的结构与功能。这些方案仅适用于pSJs，不能用于研究次级皮层连接（sSJs）。若某个基因发生突变，导致其他pSJ蛋白无法在16期胚胎的pSJ区域正常定位，并且无法在16期形成闭合连接，则该基因要么属于核心pSJ基因，要么属于辅助性pSJ基因。两者的主要区别在于：其所编码的蛋白是否在野生型胚胎形成功能性连接后，定位于pSJ的亚细胞位置。若能定位，则该蛋白被归类为核心pSJ蛋白。为阐明这一原则，我们首先展示在野生型胚胎中，核心pSJ蛋白从胚胎发育13期到16期的定位成熟过程（图1A-D）。此处我们聚焦于唾液腺，它是一种上皮管状结构，其顶面朝向腺体腔。在胚胎发育13至16期期间，唾液腺由高柱状细胞组成，使得在胚胎共聚焦光学切片中可直接观察其侧膜。使用针对核心pSJ蛋白Macroglobulin complement-related（Mcr；见图A-C）的抗体，我们发现Mcr在13期胚胎中均匀分布于整个侧膜。至14期，Mcr在侧膜的顶区（即黏附连接下方，通过黏附连接蛋白E-cadhe...

这些实验方案阐述了如何在对照组和突变型果蝇胚胎上皮中表征折叠型隔膜连接的结构及其封闭功能。

这些方案的目的是评估外胚层来源的组织中褶皱型隔膜连接（pSJs）的结构组织及其屏障功能。

我们的研究探讨了隔膜连接蛋白在发育过程中的非封闭性功能，重点是鉴定并表征参与其结构与生物学功能的新组分。本实验方案旨在表征黑腹果蝇（Drosophila）胚胎外胚层上皮中褶皱型隔膜连接的组织结构及其封闭功能。首先，将具有适当基因型的健康雄性和雌性黑腹果蝇进行杂交，并将其放入配备新鲜苹果汁培养基（表面涂抹酵母糊）的胚胎收集笼中。让成虫在苹果汁培养基上产下受精卵。将培养基从收卵笼中取出，在25摄氏度下使胚胎发育13至16小时，以达到16期。随后将16期胚胎置于适当的固定液中固定，并用目标抗体进行免疫染色。为获得最佳结果，应使用配备40倍油浸物镜的共聚焦显微镜对胚胎进行成像。聚焦于目标胚胎后，调节激光强度和增益，以获得较强的荧光信号，同时避免任何像素过饱和。根据中肠形态，鉴定不表达平衡染色体编码的绿色荧光蛋白的16期胚胎。将扫描聚焦于唾液腺或后肠，并调整Z轴扫描范围，以包含管腔尽可能大的直径，从而观察上皮细胞完整的侧膜。设置适当的扫描线平均值，并对至少20个对照组和20个Cora 4突变型16期胚胎中的极化组织进行成像。仅记录那些黏附连接标记物紧密定位于膜顶端-侧向区域的胚胎数据。在野生型16期胚胎中，检测褶皱型隔膜连接蛋白在侧膜顶端区域靠近黏附连接处的富集情况。记录该褶皱型隔膜连接标志物在突变体中沿整个侧膜持续分布的现象。配制新鲜染料溶液：将罗丹明标记的10千道尔顿葡聚糖溶解于pH 7.5的0.5摩尔磷酸钠溶液（含5毫摩尔氯化钾）中，浓度为1毫克/毫升。使用拉针仪，将一根外径为1毫米、内径为0.5毫米并带有纤维的毛细管拉制成玻璃针。接着，将玻璃针装入显微操作仪的针夹持器中，并将显微操作仪放置在倒置显微镜旁。调整玻璃针的方向，尽可能使其与显微镜载玻片平行，并将其降低至与载玻片侧面相同的Z平面。通过将针尖撞击载玻片侧面来折断针尖。将针抬高至载玻片水平以上，取出针进行装样。接着，使用最小的移液器吸头将染料注入毛细管中。将装满液体的针头重新装入针头架中。通过向显微镜载玻片表面的一滴卤代烃油中注入少量10千道尔顿的葡聚糖，测试其流动情况。使用22 × 22毫米、厚度为2号的盖玻片，在苹果汁平板上划出一条凹痕。在苹果汁培养基上，将约25个对照组和Cora 4突变体胚胎（16或17期）依次排列整齐，确保它们的后端对齐于一条直线，并使腹面朝上。然后将一片双面胶带贴在22 × 22毫米的2号盖玻片上。将胶带接触胚胎线，并轻轻按压盖玻片，使胚胎从培养板转移到双面胶带上。接着，在显微镜载玻片上滴加一滴卤代烃油，通过毛细作用使盖玻片与载玻片粘合固定。将盖玻片朝向载玻片上无磨砂区域的一侧放置。将胚胎置于干燥剂容器中干燥3至5分钟，并用卤代烃油完全覆盖胚胎。将带有胚胎的载玻片安装到倒置显微镜上，使胚胎朝上且背向物镜。调整显微操作仪，使针头对准胚胎的后端，角度尽可能与胚胎平行，并调节显微操作仪的Z轴，使针尖与胚胎背腹轴中点对齐。接下来，通过快速移动载物台使胚胎接触针头，让针尖进入血腔。使用10-25或50毫升的注射器注入约0.2至0.5纳升的染料。迅速抽出针头，并将载物台移至下一个胚胎以进行染料注射。然后在胚胎上方加入更多的卤代烃油。用一块22 × 22毫米、厚度为2号的盖玻片覆盖胚胎，以在盖玻片之间形成均匀的油层，并防止压碎样本。在注入葡聚糖染料后，使用荧光复合显微镜或共聚焦显微镜进行成像。在共聚焦显微镜下，沿胚胎背腹轴方向获取约四分之一胚胎深度的Z轴层扫图像，以评估气管管腔。观察气管、唾液腺或后肠管腔中是否存在标记葡聚糖的积累。记录每个胚胎的基因型、发育阶段，以及标记葡聚糖是否在任何管状器官中积累。注意那些胚周隙被染料强烈染色的胚胎，因为这可能代表染料意外注入了该区域。在野生型胚胎中，大球蛋白补体相关蛋白（macroglobulin complement-related，Mcr）在13期均匀定位于侧膜，在14期富集于侧膜的顶端区域，到16期则强烈定位于粘附连接下方的顶-侧区域。皮层抗体染色显示，在16期野生型胚胎中，成熟的褶皱隔膜连接的定位模式与Mcr相似。在Cora 4突变体胚胎中，Mcr在16期未能实现明显的顶端定位，仍沿侧膜分布。E-钙黏蛋白在野生型和Cora 4突变体16期胚胎中的定位相似。在注射了罗丹明标记的10千道尔顿葡聚糖的野生型17期胚胎中，染料围绕气管分布，但未进入管腔内部。在Cora 4突变体17期胚胎中，染料在注射后10分钟内即在气管腔内聚集。该方案可使研究人员明确判断某个基因是否编码果蝇胚胎组织中褶皱型隔膜连接的核心组分或辅助组分。在执行该技术时，胚胎分期极为关键，因该实验必须使用16期胚胎。隔膜连接会随着时间逐渐成熟，直至在16期完全形成。我们认为，该方案可有效应用于基于RNA干扰品系的开放式遗传筛选，以鉴定新的褶皱型隔膜连接基因。

immunostaining-dye-penetration-experiments-to-define-core-pleated

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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整体免疫染色 果蝇 用于大精母细胞三维共聚焦分析的睾丸组织

在此，我们描述了一种用于检测与定位的实验方案 黑腹果蝇 从收集到预包埋和包埋、免疫染色以及 mRNA 检测的胚胎蛋白与 RNA 原位...

一种用于免疫组织化学与RNA的实验方案 原位 早期分布 果蝇 胚胎

本实验方案详细介绍了黑腹果蝇（Drosophila）蛹背胸片固定组织的制备与观察方法。该方法适用于完整或损伤的组织，且能保持组织原有的结构特征。本文描述了组织解剖、固定和染色的全部操作步骤。...

解剖、固定与可视化 果蝇 蛹背片

本文介绍了一种用于可视化神经肌肉接头和肌细胞中微管网络的详细方案。结合黑腹果蝇（Drosophila...

使用 果蝇 幼虫神经肌肉接头与肌细胞中微管网络的可视化

本方案描述了定制的基于抗体的荧光标记及其向早期Drosophila胚胎中的显微注射，以实现对低丰度蛋白或翻译后修饰的活体成像，这些目标分子使用传统的GFP/mCherry标签方法难以检测。...

在活体中可视化低丰度蛋白质及翻译后修饰 黑腹果蝇 胚胎 通过 荧光抗体注射

学习免疫染色和染料穿透实验方法，用于评估果蝇胚胎上皮中褶皱隔板连接蛋白的组织结构与屏障功能，帮助研究者识别核心连接蛋白组分并解析上皮屏障形成机制。

免疫染色与染料渗透实验用于确定核心皱褶型紧密连接蛋白果蝇胚胎上皮

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免疫染色与染料渗透实验用于确定核心皱褶型紧密连接蛋白 果蝇 胚胎上皮

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