Name: 通过瑞利分解气溶胶进行mRNA多脑复合体的鼻腔内递送：一种体 外 鼻腔沉积和功能测试方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 50 s
Description: 了解利用瑞利分解技术进行mRNA多脑复合体鼻腔内递送的方法，该技术通过AINI模型评估区域沉积，并在A549和HEK293T细胞中实现成功转染，为呼吸道递送系统提供安全有效的非破坏性方案。

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作者感谢伦敦国王学院提供的国王本科研究奖学金（KURF）和学生机会基金的经费支持。

注意：在进行 PEI-mRNA 转染前，将 HEK293T 和 A549 细胞系培养于完全培养基中，该培养基由添加了 10% 胎牛血清（FBS）和 2% 青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）组成。当细胞达到汇合状态时，每约 48 小时传代一次。以每平方厘米 40,000 个细胞的密度接种细胞，并培养约 48 小时。转染前立即用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞并去除培养基，以清除残留血清并标准化转染条件。所有细胞培养瓶、24 孔板、PBS、移液管和枪头在使用前均需高压灭菌。
1. PEI-mRNA 复合物的制备
<ol>
	<li>形成PEI-mRNA复合物（用于 体外 转染 
	注意：仅当使用 PEI 增强细胞培养中的转染效率时，才需要执行此步骤。
	<ol>
		<li>根据所需的N:P摩尔比计算所需的PEI量。 
		注意：使用 N:P = 24（表示每摩尔mRNA上的带负电荷的磷酸基团对应24摩尔带正电荷的胺基）。&#160;10 µg mRNA 需要约 31 µg PEI，以在此 N/P 比例下形成 PEI-mRNA 复合物。</li>
		<li>配制稀释的PEI溶液（例如，1 mg/mL的水溶液），并进行高压灭菌。</li>
		<li>将mRNA稀释至适当浓度（例如，0.2 µg/µL）。</li>
		<li>将PEI溶液加入mRNA溶液中，同时轻轻混匀（切勿涡旋震荡）。 
		注意：混合液可能位于小管中；请小心反复吹打混匀&#160;或轻轻弹击管壁以混匀。</li>
		<li>室温孵育约 20 分钟，使 PEI 与 mRNA 通过静电结合。 
		注意：如果不使用PEI，裸mRNA可直接气溶胶化。额外添加PEI可显著增强A549细胞中的基因表达，但此步骤为可选，实际应用中可能不使用。 体内 由于毒性因素限制了给药。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 纳米颗粒表征（粒径与泽塔电位）
注意：在使用分析仪测量粒径或泽塔电位之前，需在软件中设置测量参数，并保存为方法。方法的设置是仪器运行所必需的，参数的选择取决于测量环境、所用比色皿以及样品的性质。
<ol>
	<li>气溶胶化前动态光散射（DLS）
	<ol>
		<li>使用粒径分析仪，将配制好的样品稀释液加入一次性比色皿中（例如，500 µL，浓度为 0.2 µg/µL）。</li>
		<li>打开分析仪，并在连接的计算机上启动配套软件13。</li>
		<li>点击窗口顶部的 测量 按钮。</li>
		<li>点击窗口顶部蓝色的 文件 图标，以选择预设的粒径分析方法。</li>
		<li>将该方法协议重命名为与样品名称一致。</li>
		<li>按下分析仪上的 盖板 按钮以打开样品室。</li>
		<li>将比色皿插入样品室中。</li>
		<li>点击软件窗口顶部的绿色 运行 按钮，等待测量完成13。</li>
		<li>点击软件窗口顶部的 分析 按钮，然后在结果页面上点击 粒径 按钮13。</li>
		<li>从 统计表 中获取平均流体动力学直径（Z-平均值）和多分散指数（PDI）。</li>
		<li>按下分析仪的盖板按钮打开样品室，取出比色皿后关闭盖板。</li>
		<li>丢弃使用过的比色皿，并用无RNA酶水和70% v/v乙醇冲洗雾化器，以实现消毒并促进在不同粒径测量之间的干燥。 
		注意：对于Rayleigh雾化器，需确保喷嘴中无盐类沉积物或残留物，因为这些残留物可能影响喷雾性能。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>气溶胶化前Zeta电位测定
	<ol>
		<li>使用同一仪器（或Zeta电位分析仪），将配制好的样品稀释液加入折叠毛细管池中（例如，700 µL，浓度为 0.2 µg/µL）。</li>
		<li>打开分析仪，并在连接的计算机上启动配套软件13。</li>
		<li>点击窗口顶部的 测量 按钮。</li>
		<li>点击窗口顶部蓝色的 文件 图标，以选择预设的Zeta电位分析方法。</li>
		<li>将该方法协议重命名为与样品名称一致。</li>
		<li>按下分析仪上的 盖板 按钮以打开样品室。</li>
		<li>将比色皿插入样品室中。</li>
		<li>点击软件窗口顶部的绿色 运行 按钮，等待仪器完成运行13。</li>
		<li>点击软件窗口顶部的 分析 按钮，然后在结果页面上点击 Zeta 按钮13。</li>
		<li>通过查看 统计表 获取Zeta电位（表面电荷）。</li>
		<li>按下分析仪的盖板按钮打开样品室，取出样品后关闭盖板。</li>
		<li>用无RNA酶水和70% v/v乙醇冲洗比色皿和雾化器，以实现消毒并促进在不同Zeta电位测量之间的干燥。 
		注意：对于Rayleigh雾化器，需确保喷嘴中无盐类沉积物或残留物，因为这些残留物可能影响喷雾性能。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 瑞利断裂气溶胶化与鼻腔沉积
<ol>
	<li>雾化器与理想化鼻腔入口（AINI）装置设置
	<ol>
		<li>组装瑞利断裂式鼻腔雾化器装置和阿尔伯塔理想化鼻腔入口（AINI）模型。 
		注：AINI模型由代表人体鼻腔不同区域解剖结构的中空部分组成（例如，鼻孔前庭、鼻甲区、嗅觉区、鼻咽部）。</li>
		<li>使用前确保所有AINI组件清洁且干燥（残留物可能改变沉积结果）。通过去离子水清洗9，随后用乙醇或有机溶剂清洗以完成清洁。</li>
		<li>将AINI连接至下一代撞击器（NGI），NGI出口连接真空泵，以在鼻腔通道中产生气流。</li>
		<li>将气流速率设定为7.5 L/min——该流速代表成人缓慢深鼻吸气的典型值6。在NGI的进气口连接经校准的流量计（或转子流量计），调节泵直至流量计读数为7.5 L/min。 
		注：使用流量计测量测试所需流速下的气流速率&#160;。</li>
		<li>在整个喷雾过程中维持此气流速率。使用Parafilm将装置与AINI之间密封严实。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>雾化器定位
	<ol>
		<li>将瑞利断裂式雾化器的喷嘴以45°角插入AINI鼻孔入口（前庭段）。</li>
		<li>固定雾化器，确保其在运行过程中不发生位移（所有连接件、模型段及通向泵的管路均应保持气密）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加载样品
	<ol>
		<li>轻轻混匀已制备的PEI-mRNA悬浮液，确保其均匀性（避免产生气泡）。</li>
		<li>将样品吸入雾化器储液室。 
		注：根据装置设计，可能需要将样品装入连接至雾化器的注射器或移液器吸头中。</li>
		<li>将样品装入装置中。 
		注：例如，取下雾化器的中央盖帽或腔室，用移液器加入样品，然后重新牢固组装装置。确保无泄漏，并在需要时正确预充装置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生成气溶胶
	<ol>
		<li>按照装置说明书，在启动喷雾前或同时开启空气泵的气流（AINI中气流为7.5 L/min）。</li>
		<li>启动瑞利断裂式雾化器以开始雾化过程。 
		注：对于手动注射器驱动的雾化器，应平稳下压注射器活塞，使液体通过喷嘴。尽可能一次性连续喷出全部样品体积。应平稳下压活塞以产生稳定的操作压力，因为配方需在升高的压力下被加压，并在微孔内部经受壁面剪切速率后才能实现雾化14。快速移动活塞会改变压力，从而影响剪切速率和剪切暴露时间14。</li>
		<li>确保整个过程中气流速率保持在7.5 L/min。气溶胶液滴应根据其空气动力学粒径穿过鼻腔模型，并在不同区域沉积。</li>
		<li>及时关闭空气泵，防止已沉积的液滴被进一步吸入或不均匀干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从AINI收集样品
	<ol>
		<li>小心地将AINI模型拆解为各个解剖段，以便从每个区域收集沉积的纳米颗粒。 
		注：拆解前应记录或标记各段方向，以便识别。</li>
		<li>从六个区域收集沉积物：(i) 雾化器装置，(ii) 鼻前庭段，(iii) 鼻甲段，(iv) 嗅觉区，(v) 鼻咽部段，以及 (vi) 任何下游捕获物（例如，连接的NGI各阶段或代表肺部穿透组分的最终滤膜）。</li>
		<li>对每个区域，使用定量体积的细胞培养基冲洗出沉积物质。 
		注：例如，为收集鼻甲沉积物，拆下鼻甲段，用一次性移液器以5 mL杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）彻底冲洗其内表面。轻柔清洗所有表面后，将冲洗液倒入已标记的15 mL离心管中（可使用漏斗辅助转移）。冲洗过程中，将该段水平或略微倾斜放置，以确保内部表面充分接触液体并防止液体溢出。对前庭段、嗅觉区、鼻咽部及其他各段重复相同操作，每段使用5 mL新鲜DMEM，并分别收集至标记好的独立离心管中。</li>
		<li>回收雾化器装置中的残留样品。 
		注：对于注射器型装置，将注射器和喷嘴冲洗至离心管中。</li>
		<li>若AINI连接了NGI以捕获细小颗粒，则从NGI（级联撞击器）各阶段回收液体（例如，用DMEM冲洗各阶段）。</li>
		<li>将收集液体的离心管盖紧。 
		注：避免液体在实验台表面滴落或因蒸发而损失。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集后处理
	<ol>
		<li>收集完成后立即分别将PEI-mRNA样品加入细胞进行转染。 
		注：PEI-mRNA样品可在冰箱中&#160;保存约1–2小时（最长不超过6小时）后再用于转染。从每份收集的PEI-mRNA样品中取出一定体积（最多1 mL）用于表征气溶胶化后的载体（即进行动态光散射DLS和Zeta电位测量）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>装置清洗
	<ol>
		<li>每次实验运行后，彻底清洗雾化器和AINI模型，以防止后续实验发生交叉污染。</li>
		<li>先用去离子水冲洗所有AINI段和雾化器部件以去除培养基和纳米颗粒，再用70%乙醇冲洗以消毒并促进干燥。 
		注：若装置或模型具有微小孔径，应使用注射器进行冲洗。</li>
		<li>将所有部件完全晾干（或置于低温干燥柜中）后再重新组装。对于瑞利雾化器，需确保喷嘴内无盐分沉积或残留物，以免影响喷雾性能。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 细胞成像
注意：转染后，移除转染培养基，并更换为新鲜的完全培养基以终止暴露。培养细胞48小时，以允许报告基因表达和细胞恢复。当细胞融合度达到约80%时，使用4%多聚甲醛固定细胞8分钟，然后用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；300 nM）染色细胞核5分钟，接着用PBS洗涤两次，再进行成像。
<ol>
	<li>荧光成像
	<ol>
		<li>使用配备DAPI和GFP滤光片组的荧光显微镜。</li>
		<li>首先使用蓝色通道（激发波长 = 385 nm，发射波长 = 477.5 nm）观察DAPI染色的细胞核。</li>
		<li>切换至绿色通道（激发波长 = 488 nm，发射波长 = 525 nm）观察GFP阳性细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本方案中，气溶胶化制剂之前，mRNA 通过与 PEI 支化以增强细胞摄取。这可作为 LNP-mRNA 递送的替代方法 体外 验证10,15PEI-mRNA 保留了 LNP 制剂的大部分功能，包括重要的生物学和功能特性10带正电荷的PEI胺基通过静电相互作用与带负电荷的mRNA结合，形成小于200 nm的纳米级复合物。PEI-mRNA缩合物具有足够的稳定性，可实现细胞转染并进行翻译。 体外PEI-mRNA 也表现出较高的细胞摄取率，并具有清晰可辨的表达谱10，这使其具有较强的稳健性 体外 用于检测细胞中GFP表达的报告系统，以进一步研究气溶胶化后PEI-mRNA的生物学功能。尽管已有研究表明PEI-mRNA可作为疫苗使用 体内 剂量低于 50 ng 时未见毒性迹象10本研究中，PEI 制剂仅用作信号放大的实验...

将疫苗递送至鼻黏膜（许多呼吸道病原体的入侵门户）可引发强烈的局部免疫反应，从而在感染源头阻断感染。鼻内流感疫苗的成功以及近期获批的鼻内 COVID-19 疫苗凸显了鼻腔递送途径在诱导黏膜免疫和全身免疫反应方面的有效性1。因此，mRNA 疫苗的鼻内递送作为一种预防呼吸道病毒感染的策略正受到广泛关注。然而，一个主要的技术挑战是将脆弱的 mRNA 多聚复合物转化为可吸入气溶胶，同时不损害其稳定性。
瑞利断裂气溶胶化技术基于不同的物理原理，提供了一种温和的替代方法。在瑞利断裂装置中，加压的液体流经微尺度孔口，形成连续的微射流。由于 Plateau-Rayleigh 不稳定性2，该射流会自然断裂为尺寸均匀的液滴。表面张力使液柱在特征波长处断裂，该波长约为喷嘴直径的两倍。与超声雾化不同，此过程几乎不产生湍流剪切力；液滴是由射流自身的不稳定性自然形成的，而非由外部破碎力产生。因此，纳米颗粒制剂所受应力极小。已有研究表明，采用瑞利断裂技术对脂质纳米颗粒（LNP）mRNA 进行气溶胶化，其喷雾前后的粒径、表面电荷及包封效率均无显著变化3,4,5。在该方法中，PEI-mRNA 在气溶胶化后仍保持完整且具有功能，而相比之下，其他更剧烈的雾化技术则会导致其性能下降。
瑞利断裂的另一个优势在于对液滴尺寸的控制。所产生的液滴相对较大（约为20–30 µm），这一尺寸非常适合鼻腔给药：颗粒 &#62;空气动力学直径为10 µm的颗粒物倾向于沉积在鼻腔和上呼吸道，而非进入肺部3通过产生大部分高于此阈值的液滴，瑞利雾化器可自然地将药物沉积靶向至鼻腔。通过使用阿尔伯塔理想化鼻腔入口（AINI）模型优化给药技术，可进一步增强靶向性。AINI 是一种3D打印的鼻腔气道复制品，能够准确预测 体内 喷雾沉积模式6使用该模型发现，以45°角向鼻孔喷雾可显著增加药物在鼻甲部位的沉积7注射角度显著影响沉积分布模式7在鼻咽部或肺部等非靶向区域的沉积是不希望发生的，因为它可能引起喉咙刺激、味觉不良或全身性副作用8在本方案中，通过复制这些条件（45° 喷雾角度和受控的吸入气流）以最大化 mRNA 气溶胶在鼻甲部位的沉积3先前的数据表明，在最佳条件下，超过一半的递送mRNA质量可集中于鼻甲区域，而 &#60;10%到达鼻咽部或更远部位3这种靶向递送有望通过将剂量集中于免疫诱导位点（这些位点血管丰富，富含免疫细胞）来提高疫苗效力，同时最大限度减少脱靶沉积，从而避免浪费或不良反应。
本文方法学文章详细描述了通过瑞利断裂法雾化mRNA的实验流程，评估了mRNA在AINI模型中的区域沉积情况，并检测了沉积后mRNA的生物学活性 体外使用编码GFP的报告mRNA来可视化人细胞中的转染结果。选用HEK293T细胞来检测气溶胶化复合物的功能性。为增强细胞对气溶胶化mRNA的摄取 体外mRNA 在加入细胞前与 PEI 结合形成 PEI-mRNA 多聚复合物。PEI 是一种阳离子聚合物转染试剂，可提高 mRNA 递送效率，本实验采用的氮磷比（N:P，即氮与磷酸基团的摩尔比）为 24:1，该比例基于前期基因递送优化结果确定。本研究中，PEI 仅用于细胞培养验证步骤，不用于实际鼻腔的气溶胶递送体内 将仅依赖LNP-mRNA，但在细胞培养中，这有助于最大化基因表达以利于检测。
本方案介绍了一种用于鼻内mRNA疫苗递送的新方法，可解决mRNA气溶胶化过程中的稳定性问题。瑞利断裂（Rayleigh breakup）技术最近才在少数研究中被应用于核酸递送3,4,5,9，而本研究提供了实施该技术的详细方法学指南。通过遵循本逐步操作流程，研究人员可重现mRNA纳米载体的温和气溶胶化过程，并评估其沉积特性与转染效果。以下“方案”部分按顺序分为三个部分：（1）PEI-mRNA制剂制备；（2）气溶胶化前后纳米颗粒的表征（粒径与zeta电位）；（3）瑞利断裂雾化器的操作及ANI鼻腔沉积程序。文中指出了影响实验成功的关键因素，例如维持无RNase环境及设备的正确对准。结果与讨论部分包括代表性实验结果、该方法相较于传统方法的优势、潜在应用（如流感或COVID-19的鼻腔疫苗10,11,12），以及局限性和故障排除建议。本综合方法旨在实现可重复的鼻内mRNA递送实验，推动无针型黏膜RNA疫苗的开发进程。

<table><tbody><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Sigma-Aldrich Company Limited</td><td>CLS430829-500EA</td><td></td></tr><tr><td>50&amp;ndash;1000 &amp;mu;L 移液器吸头</td><td>Sigma-Aldrich Company Limited</td><td>Z740031-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>A549 细胞系</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC CRM-CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>空气流量计</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>可使用通用空气流量计。</td></tr><tr><td>Alberta 理想化鼻腔入口（AINI）模型</td><td>TSI Incorporated (通过 Copley Scientific, 英国)</td><td>0001-01-8540</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌指示胶带</td><td>Sigma-Aldrich Company Limited</td><td>Z744090</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich Company Limited</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>11966025</td><td></td></tr><tr><td>纯乙醇</td><td>Sigma-Aldrich Company Limited</td><td>32221-M</td><td>通过 Merck 购买</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Sigma-Aldrich Company Limited</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T 细胞系</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus HERAsafe HS 12 生物安全柜</td><td>Heraeus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>下一代撞击器</td><td>MSP's, TSI 的一个部门</td><td>0170-01-1000</td><td>该产品也出现在 Copley 目录中，部件号为 5201。</td></tr><tr><td>Nikon DS-Qi2 单色显微镜相机</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 细胞培养处理多孔板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Nunc EasYFlask 细胞培养处理烧瓶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>156340</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Sigma-Aldrich Company Limited</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）片剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich Company Limited</td><td>764965-1G</td><td>通过 SLS 购买</td></tr><tr><td>Rayleigh Jet 鼻腔喷雾器</td><td>Resyca BV Enschede</td><td>软性鼻喷适配器</td><td></td></tr><tr><td>无 RNA 酶水</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J60610.EQC</td><td></td></tr><tr><td>粒径测定比色皿</td><td>Malvern Panalytical</td><td>ZEN0040</td><td></td></tr><tr><td>折叠毛细管池</td><td>Malvern Panalytical</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Pro</td><td>Malvern Panalytical</td><td>Zetasizer Pro</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Ultra-Pro ZS Xplorer 软件</td><td>Malvern Panalytical</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

通过瑞利断裂气溶胶经鼻递送mrna多聚复合物：一种 体外 鼻腔沉积与功能检测方法

Intranasal Delivery of mRNA Polyplexes via Rayleigh Breakup Aerosols: An In Vitro Method for Nasal Deposition and Functional Testing

鼻内递送mRNA治疗药物是一种有前景的疫苗接种和治疗呼吸系统疾病的方法，可直接在病原体入侵部位激活免疫反应。然而，传统的气溶胶化方法（如超声或高压雾化器）会因过强的剪切力破坏非病毒性mRNA载体，导致mRNA失去结构完整性和生物学活性。本研究采用瑞利断裂式鼻用雾化器，将聚乙烯亚胺（PEI）-mRNA载体轻柔地雾化为均一液滴。编码绿色荧光蛋白（GFP）的mRNA被制备成阳离子多聚复合物，并在雾化前后进行表征。瑞利断裂过程形成连续的微射流液滴，剪切力极小，从而有效保持了纳米颗粒的理化特性。雾化前后均观察到稳定的粒径、低多分散指数和稳定的zeta电位，证实通过瑞利断裂进行雾化可良好保留mRNA多聚复合物的理化性质。利用鼻腔气道的阿尔伯塔理想化鼻腔入口（AINI）模型，实现了PEI-mRNA气溶胶的递送。雾化后的mRNA主要沉积于鼻甲区域，仅有微量分布于鼻咽部或相当于肺部的区域。此外，雾化后的mRNA多聚复合物成功递送至A549人肺上皮细胞，并检测到GFP表达。该方案展示了一种基于瑞利断裂雾化技术的非破坏性鼻内mRNA递送方法，可有效维持非病毒性mRNA载体的理化特性和生物学功能，将水相雾化为适合靶向鼻腔沉积的适当尺寸液滴。本方案揭示了一种高效雾化mRNA并评估其在鼻腔内区域沉积的新方法。

作为一篇以方法学为重点的稿件，详细的实验结果并非主要目的；然而，本文提供了代表性发现，以说明本方案各个部分的预期结果。下文提到的图示展示了支持该方法有效性的示例数据（如图表或图像），但不包含超出演示目的的新定量分析。
液滴尺寸与沉积模式： 
Rayleigh断裂雾化器保持了mRNA多聚复合物的理化性质，气溶胶化前后测量值仅有微小差异，如图1所示。该装置产生均匀的细雾液滴，主要沉积于鼻腔模型的预期区域。成功的mRNA多聚复合物通常直径在100–150 nm范围内5，且多分散系数（PDI）较低（&lt;0.3）4，表明其粒径分布较为均一。如图1所示，稳定的zeta电位值表明纳米颗粒具有胶体稳定性，不易立即发生聚集。如图1所示，Z-平均直径在预期范围内保持稳定（气溶胶化前约为1...

本方案将瑞利断裂（Rayleigh breakup）作为一种温和的方法，用于非病毒mRNA载体的气溶胶化。通过阿尔伯塔理想化鼻腔入口（Alberta Idealized Nasal Inlet, AINI）模型评估气溶胶化mRNA载体的区域沉积情况。人肺细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的表达表明，气溶胶化后的mRNA载体仍保持其理化及生物学功能。

通过瑞利断裂气溶胶经鼻递送mRNA多聚复合物：一种 体外 鼻腔沉积与功能检测方法

鼻内递送mRNA治疗药物是一种极具前景的疫苗接种和治疗呼吸系统疾病策略，可实现呼吸道局部的直接免疫激活……

我们研究并验证了一种通过瑞利断裂气溶胶化方式递送鼻腔mRNA疫苗的非破坏性且温和的方法。现有的雾化器会损伤脆弱的mRNA载体。本方案展示了一种低剪切力的气溶胶化方法，可保持mRNA的完整性和活性。开始装置设置时，将瑞利破碎鼻部雾化器装置与阿尔伯塔理想化鼻腔入口（AINI）模型组装在一起。将所需组件放入下一代撞击器后，将校准过的流量计连接到下一代撞击器上。接下来，使用Parafilm将装置与下一代撞击器之间妥善密封。将撞击器的出口连接至真空泵，以使气流通过鼻腔通道。调节泵的控制装置，直至流量计读数为 7.5 升/分钟。检查气泵的气流是否以 7.5 升/分钟的流量通过 AINI，然后关闭气泵。取下已校准的流量计，并将AINI组件安装至其位置。确保所有连接处、模型各段以及通向泵的管路均密封不漏气。然后轻轻混匀已制备的聚乙烯亚胺RNA悬浮液，以确保其均匀性，同时避免产生气泡。将制备好的样品吸入雾化器储液池中，并将其装入雾化装置。打开气泵后，将注射泵连接至雾化器，再以45度角将瑞利断裂雾化器喷嘴插入ANI鼻孔入口。启动瑞利断裂雾化器，开始气溶胶化。喷雾后应立即关闭气泵，以防止沉积的液滴被进一步抽吸至下游或不均匀干燥。然后小心地将AINI模型拆分为各个解剖段，以收集每个区域沉积的纳米颗粒。接下来，识别并准备从六个区域收集沉积物，包括雾化装置、鼻前庭段、鼻甲段、嗅觉区、鼻咽段，以及任何下游收集装置，如连接的下一代撞击器（Next Generation Impactor）各级或末端滤膜。针对每个隔室，使用定量体积的细胞培养基冲洗出沉积物，并将样品收集到单独的容器中。对装置的所有部分重复样品收集步骤。如果使用了下一代撞击器（Next Generation Impactor），则用 DMEM 冲洗各级撞击器阶段，以回收液体并捕获细小颗粒。聚乙烯亚胺mRNA复合物的Z平均直径在气溶胶化前保持在136至160纳米的预期范围内，气溶胶化后为145至162纳米，表明瑞利断裂未引起显著的粒径变化。气溶胶化前后，泽塔电位及基于强度的峰1平均直径基本保持不变。在鼻甲区域的细胞中观察到大量蓝色染色的细胞核，表明A549细胞的DAPI染色成功。在暴露于气溶胶化信使RNA后，A549细胞孔中观察到绿色荧光细胞，表明转染成功。A549细胞中DAPI与绿色荧光蛋白信号的叠加证实了转染的可行性，并验证了mRNA的细胞摄取。在暴露于气溶胶化mRNA的HEK293T细胞中也观察到绿色荧光蛋白信号，表明该方法在另一种作为阳性对照的上皮细胞系中亦可产生可检测的报告基因表达。我们证明了瑞利断裂能够保持mRNA纳米颗粒的完整性，同时实现靶向鼻甲沉积和功能性基因表达。我们的研究通过建立一种完全验证且非破坏性的鼻内mRNA气溶胶化框架，推动了该领域的发展，为更安全、更有效的呼吸道递送研究提供了支持。

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通过瑞利分解气溶胶进行mRNA多脑复合体的鼻腔内递送：一种体 外 鼻腔沉积和功能测试方法

来源：Ullah, I., et.al. 一种用于小鼠经鼻递送siRNA至中枢神经系统时固定体位的装置。J. Vis. Exp. (2019)本视频展示了一种精确的经鼻给药技术，用于通过特制的定位装置将靶向神经元的肽-siRNA 复合物递送至小鼠脑部。将麻醉后的小鼠固定于头朝下并前倾的位置，以优化 siRNA 的吸入效果并防止其流入肺部。靶向肽可促进神经元中受体介导的摄取，从而实现脑内 siRNA...

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经插管介导的气管内（IMIT）试剂灌注是一种研究呼吸系统疾病以及将治疗性试剂直接递送至肺部的优良非侵入性方法。该方法快速且具有高度可重复性，适用于临床前测试。...

经插管气管内（IMIT）灌注：一种非侵入性、肺部特异性的递送系统

目前对于疫苗的作用机制总体上仍缺乏深入了解。本文提出结合反向遗传学与骨髓嵌合小鼠模型，以深入研究疫苗诱导的早期宿主免疫应答，特别关注树突状细胞与T细胞免疫反应。...

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利用微流控混合装置开发了一种自组装肽-泊洛沙胺纳米颗粒（PP-sNp），用于包封与递送 体外 转录的信使RNA。所述mRNA/PP-sNp可有效转染培养细胞 体外.

高效转染 体外 使用肽-泊洛沙胺纳米颗粒在培养细胞中转录mRNA

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鼻用自组装纳米乳肿瘤疫苗的制备、特性、毒性及有效性评价 体外 和 体内

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