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作者感谢&#160;Abiodun Bodunrin、Cynthia Shu、Ajitha Cristie-David、Andrew Prantner 和 Errile Pusod 在本研究的数字滴液聚合酶链式反应（ddPCR）实验、癌细胞处理以及癌细胞分离实验中提供的帮助。

伦理声明：
血液样本来自经授权的研究用途来源，所有供体在样本采集前均签署了书面知情同意书。所有涉及人血样本的实验方案均经血液供应商 Discovery Life Sciences（美国阿拉巴马州）的机构审查委员会审查并批准。所有涉及人血样本的操作均遵循机构研究委员会的伦理标准以及《赫尔辛基宣言》的规定。
1. 使用半自动细胞分离系统富集癌细胞
注意： 本部分介绍使用半自动细胞分离平台富集循环肿瘤细胞（CTCs），随后通过微滴数字PCR检测EGFR突变。采用模型CTC样本以验证方法可行性，在临床应用前建议进行检测方法的验证。实验使用了两种非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系：NCI-H1975（EGFR L858R/T790M突变）和A549（EGFR野生型），后者作为突变检测的阴性对照。
<ol>
	<li>血液样本
	<ol>
		<li>在采集血液前，须确保已从献血者/患者处获得知情同意。涉及人类样本（包括血液）的研究，如需获得机构审查委员会（IRB）批准，应事先取得批准。</li>
		<li>为可行性测试，从经授权的3号获取血样rd 仅供科研使用的第三方供应商。</li>
		<li>在乙二胺四乙酸（EDTA）管中采集外周血，并在48小时内通过Genesis富集方案处理样本。 
		注意：对于后续分析和Genesis富集实验流程，建议使用EDTA管。Streck管和EDTA管均可用于载片免疫染色结合Genesis计数流程（直接法/间接法）。</li>
		<li>将使用EDTA管采集的血样在2–8 ˚C下保存至使用。用于Genesis细胞分离时，无需预处理，富集方案中最多可使用10 mL全血。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>循环肿瘤细胞样本/临床样本制备模型
	<ol>
		<li>在10 µL适当的细胞培养基或磷酸盐缓冲液（PBS）中制备浓度为100–1,000个细胞的细胞储备液。若使用临床样本，则跳过此步骤。 
		注意：本研究中使用的加标浓度高于临床中通常观察到的循环肿瘤细胞（CTC）水平，仅用于方法演示目的。</li>
		<li>将10 µL细胞储备液加入至多10 mL健康供体全血中，以制备模拟循环肿瘤细胞（CTC）样本。对于临床样本，切勿将任何癌细胞加入患者全血样本中。</li>
		<li>将血样与等体积的PBS（1x）混合，在室温下于血液摇床中轻轻振荡，直至使用。若储存时间超过一小时，应置于4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CTC 富集
	<ol>
		<li>打开Genesis细胞分离系统的电源，等待系统初始化完成。此过程可能需要长达5分钟。</li>
		<li>将废液罐放置在工作站舱体底部的指定位置，并将废液罐管路连接至废液罐。</li>
		<li>将管路压入夹管阀，直至听到咔嗒声表示已卡入到位，并将Genesis System管路连接至废液瓶出口。</li>
		<li>通过按下“运行自检开始” 从主屏幕点击‘自测’ 在屏幕上。</li>
		<li>当自检完成后，选择 2.0 试剂盒富集 从选定的方案选项中。</li>
		<li>按照屏幕上的说明操作，填写所需的数据输入字段，并完成引液与组装程序。使用70%乙醇和1×PBS进行引液可获得最佳的细胞捕获效率和DNA提取回收率。引液过程约需20分钟完成。</li>
		<li>确保在开始运行前已选择正确的富集程序（2.0 Kit Enrichment），并正确固定所有管路连接和载片位置。加样时应避免引入气泡，以免影响流体稳定性及捕获效率。</li>
		<li>轻柔地将从步骤1.2.3（模型CTC样本/临床样本制备）制备的模型样本加入入口漏斗中，然后按下“继续”以执行富集程序&#160;系统屏幕</li>
		<li>当CTC捕获完成后，半自动细胞分离系统将提示用户取下废液瓶并重新连接预灌注储液槽。</li>
		<li>将 Genesis System 管路从废液瓶上拆下，移取 4 mL 稀释缓冲液至引物储存室。</li>
		<li>将防回流接头连接至引流通路储液槽，并重新连接到 Genesis 系统管路。在屏幕上按下“继续”以延续富集程序。通过施加反向流，将微流控芯片中捕获的细胞释放至进样漏斗。</li>
		<li>用移液器将回收的细胞从入口漏斗转移至5.0 mL离心管中。确保收集入口漏斗中的全部水相样品，体积通常超过4 mL。</li>
		<li>将回收的样品在600 × g下离心 g 5 分钟离心以沉淀捕获的细胞，然后进行细胞裂解。</li>
		<li>小心移除上清液，然后进行DNA提取实验步骤（第1.4节）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA提取 
	注意：DNAzol BD 接触皮肤或摄入后有害。避免与皮肤和眼睛接触。仅可在化学通风橱环境中使用，切勿吸入雾气/蒸气/喷雾。若皮肤接触，应立即用水冲洗。
	<ol>
		<li>将1 mL DNAzol BD直接加入步骤1.3.14的试管中。</li>
		<li>将全部样品转移至新的 Eppendorf DNA LoBind 1.5 mL 微量离心管中，并剧烈振荡。</li>
		<li>将试管在室温下孵育5分钟。剧烈振荡试管，并在室温下孵育至少4分钟。</li>
		<li>在裂解和沉淀步骤中确保充分混匀，以最大化DNA回收率。如果存在RNA污染的担忧，可选择性地加入RNase处理。</li>
		<li>向DNAzol BD细胞裂解液样品混合物中直接加入400 µL异丙醇。</li>
		<li>将试管在10,000 × g下离心 g 6分钟以沉淀DNA。</li>
		<li>离心后，弃去上清液，向沉淀的DNA中轻轻加入0.5 mL DNAzol BD。</li>
		<li>涡旋振荡试管，直至DNA沉淀完全分散。</li>
		<li>将混合物在10,000 × g下离心 g 5 分钟。</li>
		<li>移除上清液，然后用移液器加入1 mL 75%乙醇洗涤DNA沉淀。</li>
		<li>重复步骤 9–10，共洗涤两次。</li>
		<li>使用微量移液器移除管底残留的乙醇。 
		注意：确保沉淀物不会完全干燥。</li>
		<li>加入 20 µL 无 DNase/RNase 的去离子水（DI 水）以溶解 CTC 样品中的 DNA。</li>
		<li>使用双链DNA（dsDNA）定量检测试剂盒或平台（如Qubit 1x dsDNA High Sensitivity Assay Kit或Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis）对样本中的双链DNA进行定量。</li>
		<li>将提取的DNA样本储存于4 °C或-20 °C，以防止降解。 
		暂停点：提取的DNA样本可在进行下游分析前于-20 °C短期保存，或于-80 °C长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用数字滴落式PCR进行EGFR突变分析
数字PCR是一种适用于高灵敏度、高精确度检测稀有突变的方法。单管提供的ddPCR突变检测体系通常包含一个靶向突变等位基因的FAM标记探针和一个靶向野生型等位基因的HEX标记探针。
<ol>
	<li>反应体系设置与液滴生成
	<ol>
		<li>将ddPCR超级混合液（ddPCR Supermix）和ddPCR突变检测试剂（ddPCR Mutation Detection Assays）置于冰上解冻。</li>
		<li>涡旋振荡每根试管，确保内容物均匀，因为在-20 °C储存期间可能形成浓度梯度。</li>
		<li>短暂离心，使内容物沉降至管底，然后将试管置于冰上。</li>
		<li>在按照表1中的配方配制反应体系前，将提取的DNA样本调整至所需浓度。</li>
		<li>为所有待测样本配制预混液，包含超级混合液、检测试剂、限制性内切酶及水，然后将样本DNA作为最后一个组分单独加入。确保DNA样本的终浓度为50 fg–100 ng。 
		注意：建议在液滴生成前通过限制性酶切对DNA进行片段化处理，以提高检测准确性、降低黏度并增强模板可及性。建议在ddPCR体系构建过程中直接加入2–5 U的限制性内切酶进行酶切。对于EGFR点突变检测试剂（T790M/L858R），推荐使用MseI；在自定义前请参考试剂数据表以确认兼容的酶。各试剂的数据表可从Bio-Rad数字检测试剂门户（Bio-Rad Droplet Digital PCR Assays | Home）下载。</li>
		<li>至少设置一个阴性对照孔，其中仅含野生型模板，其浓度应与未知样本浓度相近。</li>
		<li>涡旋振荡反应管以充分混匀，并短暂离心使所有样本沉降至各反应管底部。将反应管在室温下平衡2分钟。</li>
		<li>将每份反应体系20 µL加入微流控芯片（DG8 Cartridge）的样本孔中，随后在油孔中加入75 µL探针用液滴生成油（Droplet Generation Oil for Probes）。</li>
		<li>将密封垫盖在芯片上，并将其放入QX200液滴生成仪中。</li>
		<li>按下液滴生成仪顶部的按钮以关闭盖子。当盖子关闭后，液滴生成将自动开始。该过程通过微流控芯片内的微通道将样本与油相混合，为每个样本生成约20,000个纳升级别的液滴乳液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR扩增（热循环条件）
	<ol>
		<li>按照表2中推荐的条件，在热循环仪上设置热循环程序。</li>
		<li>当液滴生成完成后，仪器上所有指示灯均变为稳定的绿色。再次按下液滴生成仪上的按钮打开仪器，取出芯片支架和芯片。</li>
		<li>移除一次性密封垫，并用移液器吸取45 µL液滴，注意移液枪头应保持轻微倾斜角度，以避免液滴破裂。</li>
		<li>将液滴转移至ddPCR 96孔板中，并使用PX1 PCR板封膜仪配合PCR板热封膜对板进行密封。</li>
		<li>密封含有液滴的96孔板后，小心将其转移至已在步骤2.2.1中准备好的热循环仪中，并启动热循环程序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>液滴读取与数据分析
	<ol>
		<li>启动ddPCR液滴读取仪（QX200 Droplet Reader或QX600 Droplet Reader）以及已安装并配置好QX Manager软件的连接计算机。</li>
		<li>热循环步骤完成后，将密封的96孔板转移至液滴读取仪。</li>
		<li>打开QX Manager软件，根据实验设计配置新的板布局。点击“添加板（Add Plate）”选项卡，软件将启用“配置板（Configure Plate）”按钮。点击“配置板（Configure Plate）”以分配样本信息至板上各孔。</li>
		<li>填写板和孔的信息详情，选择相应孔位，指定样本条件、实验类型、靶标名称（s）、靶标类型（s），以及通道：ch1对应FAM，ch2对应HEX。</li>
		<li>点击“应用（Apply）”以加载孔信息，完成后选择“确定（OK）”。</li>
		<li>当所有样本的板布局配置完成后，选择“运行（Run）”以启动液滴读取过程。</li>
		<li>数据采集完成后，在“分析（Analyze）”下的孔选择器中选择样本，并为ddPCR突变检测试剂设置适当的阈值，以区分突变型与野生型信号。</li>
		<li>对于本方案中使用的双重突变检测，可使用QX Manager软件的默认设置自动设定阈值（参见结果中的图示）。</li>
		<li>或者，也可使用十字线或套索法手动设定阈值，确保阈值或套索边界能够分离阳性和阴性簇，并基于每次运行中包含的阳性和阴性对照所定义的簇位置进行设置。 
		注意：应使用阳性和阴性对照在同一批次内一致地设定阈值，以确保突变检测结果的可重复性。</li>
		<li>报告的浓度为每µL最终1x ddPCR反应体系中的拷贝数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

实体瘤患者血液中循环肿瘤细胞的存在已作为研究课题被探讨了60多年7，早在2010年首次被纳入“液体活检”这一统称之前，循环肿瘤细胞就被认为是主要的液体活检来源8。然而，循环肿瘤细胞数量稀少，且难以从全血中选择性地分离出来9。尽管如此，已有多种用于捕获和富集循环肿瘤细胞的方法，如下述综述所述10,11，涵盖了基于物理/微流控的方法以及基于细胞表面标志物筛选的技术。这些方法中的许多操作耗时较长、劳动强度大，并且通常需要多个步骤或系统才能实现所需的特异性。
本方案中，循环肿瘤细胞（CTCs）的捕获依赖于其尺寸（&#62; 8 µm）以及与正常表型的红细胞和白细胞相比缺乏变形能力，后者可顺利通过微流控细胞捕获载片中的微流控孔道。因此，正确的样本加样、载片的充分预处理以及防止堵塞是维持捕获效率和样本回收率的关键步骤。
要使工作流程成功，血液样本管理是关键因素；必须确保使用新鲜血液进行样本处理，并维持正确的运输和储存条件，以防止溶血。红细胞或白细胞的降解将分别影响循环肿瘤细胞（CTC）捕获的质量以及任何稀有基因组变异检测的灵敏度。若观察到溶血、凝结或明显的样本降解现象，则不应进行样本处理，因为这些情况可能会降低CTC的回收率以及后续突变检测的灵敏度。
由于循环肿瘤细胞（CTCs）在全血中的浓度可能低于每1000万个白细胞中1个CTC，因此在富集过程中尽可能采集允许范围内的最大血量至关重要。微流控细胞捕获载片可容纳10 mL血液，与Streck和EDTA等标准采血管的容量（通常为约7.5–10 mL血液）一致。采集血量的减少将直接影响CTC的捕获灵敏度以及后续基因组变异的检测。对于正在接受治疗的患者，采集超过此常规体积的血液在临床和伦理上均具有挑战性。目前，Genesis平台尚不支持通过采集超过10 mL的血量或利用诊断性白细胞分离样本以增加白细胞/CTC数量之外的其他方式来进一步提高检测灵敏度12。
该方案按照标准SOP所述步骤进行，但在操作中特别注意确保采集新鲜血液、采血时EDTA与血液充分混匀，以及采集后血液在使用前的妥善保存，表明该方案有潜力应用于重视常规标准操作流程的临床环境中。然而，由于本方案演示时使用的是人工制备样本，因此在常规临床应用前，尚需使用临床患者样本进行验证。
在循环肿瘤细胞（CTC）群体中检测突变的敏感性，取决于标准全血样本中是否存在CTC，以及随后在该CTC群体中检测体细胞突变的能力，而后者又依赖于突变在CTC亚群中的频率。这两个混杂因素最终将限制从捕获的CTC群体中检测突变的整体敏感性；在早期检测样本中影响更为显著，相比之下，晚期样本通常具有较高的CTC数量和较高比例的携带突变的CTC群体。
目前基于血液的液体活检研究主要集中于血浆中循环肿瘤DNA（ctDNA）作为肿瘤存在的指示标志。通常，ctDNA的检测依赖于肿瘤特异性基因组标志物的存在，例如单核苷酸变异（SNVs）、结构变异、微卫星不稳定性高（MSI-H）、肿瘤突变负荷（TMB）以及全面基因组谱分析（CGP）。相比之下，循环肿瘤细胞（CTCs）作为液体活检中使用较少但同样有效的生物标志物，已知会从生长中且可能正在转移的肿瘤脱落进入血液循环8。对CTCs的分析主要集中在用于捕获CTCs或捕获后验证的细胞表面标志物，通常采用已建立或定制的抗体组合，例如广谱细胞角蛋白（pan-Cytokeratin）、波形蛋白（Vimentin）、PD-L1、EpCAM等。然而，由于从全血中选择性富集和捕获CTCs的技术挑战，以及后续对CTCs亚群进行精确分析的困难，CTCs的分子分析在实际应用中仍受到限制。本方法采用标准化的工作流程，结合已确立的CTCs捕获方案，并利用商业化现成的数字滴液PCR（ddPCR）检测技术，对人工构建的全血样本中已知具有病理相关性的基因组突变进行分子分析。该方法的意义在于能够直接从富集的CTCs中进行突变谱分析，从而补充基于血浆ctDNA的液体活检策略。
利用当前方法，可同时检测全血中稀有循环肿瘤细胞（CTC）的存在及其群体内具有病理学意义的基因组标志物。研究表明，评估癌症患者的循环肿瘤DNA（ctDNA）谱以及与ctDNA并行循环的CTC储库具有重要价值13，对这两种突变来源的联合分析可扩展个体患者整体的分子图谱。这有望在转化研究领域内初步建立病理检测新范式，并最终应用于临床实践。该新范式将同时整合CTC的存在作为癌症存在或进展的指征，以及捕获的CTC细胞内存在的病理性突变，后者可能提示克隆扩增或治疗耐药性14。这意味着转移灶的形成与克隆扩增，以及随之而来的药物耐药性，可在ctDNA水平和CTC水平上协同监测，从而直接影响晚期癌症患者的治疗方案选择。
未来的应用可能包括将此工作流程扩展至其他与癌症相关的突变，并在纵向临床样本中验证其性能。

随着液体活检在转化研究中的不断深入，以及近期多项研究明确揭示了循环肿瘤DNA（ctDNA）监测在治疗方案选择中的临床价值1，液体活检正逐步走向成熟。与传统的组织活检方法相比，液体活检为癌症的监测和预后评估提供了一种替代性、侵入性更小的方法。大量研究聚焦于血液中发现的片段化DNA（即无细胞DNA，cfDNA），特别是其中来源于肿瘤的部分，称为循环肿瘤DNA（ctDNA）。在过去二十年中，ctDNA已被广泛研究，证实其含有肿瘤特异性的基因突变，例如单核苷酸变异（SNVs）和结构变异，以及甲基化标志物，并且在片段分布模式上与非肿瘤来源的cfDNA存在明显差异。这些ctDNA特有的生物学特征目前已被用于监测癌症患者的分子状态，涵盖早期检测、治疗反应、微小残留病灶（MRD）以及治疗耐药性评估等多个方面。同样，从原发肿瘤脱落进入血管系统的循环肿瘤细胞（CTCs）近年来也逐渐成为具有前景的生物标志物，其在血液中的存在与否及数量已被证明与疾病进展和复发潜力密切相关。尽管早期对CTCs的研究主要依赖于其蛋白标志物的表达及计数2， 近年来在分子水平上对CTCs的研究已取得实质性进展，包括在乳腺癌中检测雌激素受体1（ESR1）基因的基因组突变，以及在多种癌症中检测表皮生长因子受体基因（EGFR）突变。
EGFR突变对于肺癌的发病机制和预后判断具有重要意义，同时也影响着患者治疗方案的选择3。目前EGFR突变的常规检测方式包括在诊断或疾病进展时进行实体瘤组织活检，或近年来 increasingly 采用的对复发/难治性肺癌患者血浆中ctDNA的取样分析4。然而，与基于ctDNA的方法不同，对循环肿瘤细胞（CTC）来源的基因组物质进行分析能够直接评估完整肿瘤细胞及其突变谱。结合ctDNA的微小残留病（MRD）研究，对稀有CTC中EGFR基因突变的检测可进一步加深对治疗方案潜在疗效的理解，并为患者预后提供更多信息，尤其是在非小细胞肺癌（NSCLC）中。由于CTC数量稀少，且目前尚缺乏利用临床友好型仪器的标准化操作流程，限制了该技术的广泛应用。这一局限性凸显了建立一种标准化且易于实施的工作流程的必要性，以实现CTC的高效富集及后续分子分析。因此，本研究旨在建立一种可重复的工作流程，通过整合细胞分离与数字PCR技术，实现循环肿瘤细胞的富集及EGFR突变的检测。
基于循环肿瘤细胞（CTCs）比主要的白细胞和红细胞群体体积更大且变形能力更低的特性，Genesis细胞分离系统结合微流控细胞捕获载片可通过半自动化流程高效捕获CTCs，同时保持较高的细胞活力和捕获效率5,6。捕获的CTCs可通过反向冲洗从微流控细胞捕获载片上回收，用于后续基因组分析。为检测捕获细胞基因组DNA中特定的EGFR突变，使用针对EGFR T790M和L858R的检测方法对CTC来源的基因组DNA进行了数字滴定PCR（ddPCR）分析。
本方案利用模型循环肿瘤细胞（CTC）样本和市售的数字滴落式PCR（ddPCR）检测方法，旨在为循环肿瘤细胞中癌症相关突变的靶向检测提供一个入门范例。该方案为检测循环肿瘤细胞中的癌症相关突变提供了实用的技术路径，并可能支持液体活检应用的进一步研究。

<table><tbody><tr><td>Genesis细胞分离系统</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>12019822</td><td>仪器（以下简称&quot;半自动细胞分离系统&quot;）</td></tr><tr><td>QX200液滴生成仪</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1864002</td><td>仪器</td></tr><tr><td>QX200液滴读取仪或QX600液滴读取仪</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1864003 或 12013328</td><td>仪器（以下简称&quot;液滴读取仪&quot;）</td></tr><tr><td>PX1 PCR板封膜仪</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1814000</td><td>仪器</td></tr><tr><td>C1000 Touch梯度PCR仪，配备96&amp;ndash;深孔反应模块</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1851197</td><td>仪器</td></tr><tr><td>Qubit 4荧光计</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>Q33226</td><td>仪器</td></tr><tr><td>Celselect载玻片</td><td></td><td></td><td>耗材（以下简称微流控细胞捕获载玻片）</td></tr><tr><td>Celselect载玻片富集试剂盒2.0</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>17009455</td><td>耗材</td></tr><tr><td>DNAzol BD</td><td>Molecular Research Center, Inc.</td><td>DN129</td><td>试剂</td></tr><tr><td>MseI限制性内切酶</td><td>New England Biolabs</td><td>R0525S</td><td>试剂</td></tr><tr><td>ddPCR突变检测试剂盒：EGFR T790M</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>试剂盒编号 dHsaMDV2010019</td><td>检测试剂盒</td></tr><tr><td>ddPCR突变检测试剂盒：EGFR L858R</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>试剂盒编号 dHsaMDV2010021</td><td>检测试剂盒</td></tr><tr><td>Qubit 1X dsDNA高灵敏度检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>Q33230</td><td>检测试剂盒</td></tr><tr><td>QX200液滴生成仪用DG8微流控芯片</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1864008</td><td>耗材</td></tr><tr><td>探针用液滴生成油</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1863005</td><td>耗材</td></tr><tr><td>探针用自动化液滴生成油</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1864110</td><td>耗材（可选）</td></tr><tr><td>探针用ddPCR预混液（不含dUTP）</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1863023</td><td>试剂</td></tr><tr><td>PCR板热封膜</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1814040</td><td>可穿刺铝箔封膜</td></tr><tr><td>DNA低吸附微量离心管，1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>022431021</td><td>耗材</td></tr><tr><td>ddPCR 96孔板</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>12001925</td><td>耗材</td></tr></tbody></table>

利用细胞分离系统和微滴数字pcr对循环稀有细胞中表皮生长因子受体dna突变进行分析

Profiling Epidermal Growth Factor Receptor DNA Mutations in Circulating Rare Cells Using a Cell Isolation System and Droplet Digital PCR

在表皮生长因子受体基因（EGFR）中发现的突变对于确定肺癌患者最有效的治疗方案至关重要。常规的EGFR突变检测可通过肿瘤活检或对肺癌患者血浆中的循环肿瘤DNA（ctDNA）进行分析来实现。尽管对肺癌患者的血液样本进行检测已常规用于通过ctDNA或循环肿瘤细胞（CTC）检测来评估肺癌的存在或复发情况，但通常并不包括对捕获细胞的后续分子分析。对稀有循环肿瘤细胞（CTCs）中EGFR基因内特定突变的检测，可进一步提供有关靶向治疗潜在疗效的信息，并有助于评估患者预后，尤其是在非小细胞肺癌（NSCLC）中。然而，由于循环肿瘤细胞极为稀少，且缺乏高效流程以获取其基因组信息，使得此类检测面临重大挑战。
本实验方案的目的是展示从全血中捕获循环肿瘤细胞（CTCs）并利用数字液滴PCR（ddPCR）分析其分子成分的实际潜力。采用半自动化的基于细胞大小的分离平台捕获循环肿瘤细胞，并将其回收用于后续分子分析。为检测捕获细胞基因组DNA中特定的EGFR突变，使用针对EGFR pT790M和EGFR pL858R的检测方法进行ddPCR分析。
两种不同的肺癌细胞系（A549 和 H1975）从全血中被主动富集，并利用数字滴定聚合酶链式反应（ddPCR）对 H1975&#160;细胞系中存在的突变进行了准确定量。

采用微流控细胞捕获载片的Genesis细胞分离系统，在浓度为25–250个细胞·mL-1的血液样本中，平均捕获了84%的 spiked 癌细胞（图3A）。如此高的捕获效率表明，该富集步骤在从全血样本中分离稀有循环肿瘤细胞方面具有显著效果。利用该系统的计数方案对微流控细胞捕获载片中捕获的细胞进行可选的免疫染色，可通过两种针对细胞角蛋白的阳性抗体、DAPI（用于识别有核细胞）以及一种针对CD45的阴性抗体来实现稀有细胞的鉴定，其中CD45在大多数白细胞上表达，但在CTC上通常不表达&#160;（图3B）。该染色模式可确认成功识别循环肿瘤细胞，同时排除背景中的白细胞干扰。
通过ddPCR突变检测实验，实现了对富集癌细胞中EGFR突变的识别与分析。本研究展示了利用Genesis平台初步富集细胞后，结合ddPCR及突变检测实验对细胞内基因组DNA（gDNA）突变进行检测的方法。针对两种测试的EGFR突变，对A549（EGFR野生型）和H1975（L858R/T790M）两种癌细胞系进行ddPCR分析（图4），结果表明，在将H1975细胞掺入全血并经Genesis平台富集后，ddPCR能够灵敏地检测出该细胞系中存在的突变。在H1975细胞中观察到明显的阳性突变信号，而在A549细胞中未检测到任何突变信号，证实了该检测方法的特异性。使用对照细胞系A549掺入的样本中未出现携带突变的液滴，进一步确认在L858R和T790M位点检测到的突变信号特异性地来源于H1975细胞系。本研究展示了在Genesis平台上实现循环肿瘤细胞（CTC）分离后，结合ddPCR进行分子分析的可行性，为液体活检研究及利用临床样本开展的疾病进展监测和个体化治疗的临床前研究提供了一种强有力的分子诊断工具。总体而言，这些结果表明，联合使用细胞富集与ddPCR的工作流程可稳定、可靠地检测并定量循环肿瘤细胞中的EGFR突变。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70016/70016fig1.jpg" /> 
图1：通过液体活检对肺癌中EGFR DNA突变进行分析的工作流程。（A）肿瘤异质性示意图，显示使用传统组织活检和液体活检中的循环肿瘤细胞（CTCs）检测到的不同EGFR突变谱。（B）利用液体活检对循环肿瘤细胞中EGFR DNA突变进行分析的示意图工作流程。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70016/70016fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70016/70016fig2.jpg" /> 
图2：使用模拟样本进行EGFR DNA突变谱分析的示意图。 （A）通过将具有已知EGFR突变状态的肺癌细胞系加入健康供体的全血中，制备模拟循环肿瘤细胞（CTC）样本。 （B）利用市售平台对循环肿瘤细胞中EGFR DNA突变进行检测的工作流程。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70016/70016fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70016/70016fig3v1.jpg" /> 
图3：无需标记的循环肿瘤细胞分离与鉴定。（A）利用半自动稀有细胞分离平台，从健康供体全血样本中加标肺腺癌细胞系（A549 和 H1975）后的捕获效率。&#160;（B）捕获细胞的免疫荧光染色结果，显示细胞角蛋白阳性的肿瘤细胞。比例尺 = 10 µm。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70016/70016fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70016/70016fig4.jpg" /> 
图4．基于液滴数字PCR的EGFR突变谱分析。 二维振幅图显示了在癌细胞经富集、细胞裂解和DNA提取后，EGFR突变的检测结果。A549细胞（野生型）未显示突变特异性信号，而H1975细胞则显示出EGFR L858R和T790M突变的阳性信号。该检测方法可实现对突变型和野生型DNA群体的高灵敏度检测与定量。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70016/70016fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>每反应体积 (µl)</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)</td>
			<td>10</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x 目标 (FAM) 和野生型 (HEX) 引物/探针</td>
			<td>1</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>稀释后的限制性内切酶 (Msel)</td>
			<td>1</td>
			<td>2-5 U/反应</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>目标样品和/或无DNase水 (NTA)</td>
			<td>可变</td>
			<td>可变</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>20</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：基于液滴的数字PCR突变检测反应体系设置。&#160;用于检测癌症细胞来源DNA样本中罕见EGFR突变的试剂组成及其终浓度。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">热循环*步骤</td>
			<td>温度</td>
			<td rowspan="2">时间</td>
			<td>斜率速率</td>
			<td rowspan="2">循环次数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(&#186;C)</td>
			<td>(&#186;C/sec)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>酶激活</td>
			<td>95</td>
			<td>10 min</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>变性</td>
			<td>94</td>
			<td>30 秒</td>
			<td>2</td>
			<td>40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>退火/延伸</td>
			<td>55</td>
			<td>1 分钟</td>
			<td>2</td>
			<td>40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>酶失活</td>
			<td>98</td>
			<td>10 min</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>冷却</td>
			<td>4</td>
			<td>30 min</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>（可选）保持</td>
			<td>4</td>
			<td>&#8734; （无限）</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">使用加热盖，温度设置为105&#186;C 并将样品体积设置为 40&#956;l C1000 Touch 梯度PCR仪 
			使用 96-Deep Well 反应模块。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：数字PCR扩增的热循环条件。&#160;使用配备96孔反应模块的热循环仪对EGFR突变靶标进行扩增所用的热循环参数。

本文介绍了一种从模拟全血并掺入肺癌细胞的样本中分离稀有癌细胞的实验方案。该方案采用一种半自动、无标记的细胞分离平台。随后，对富集的细胞通过微滴数字PCR分析表皮生长因子受体突变。

利用细胞分离系统和微滴数字PCR对循环稀有细胞中表皮生长因子受体DNA突变进行分析

表皮生长因子受体基因（EGFR）中的突变对于确定肺癌患者最有效的治疗方案至关重要。

profiling-epidermal-growth-factor-receptor-dna-mutations-circulating

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科研

JoVE Journal

Cancer Research

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