Name: 基于行为实验的斑马鱼幼体MPTP诱导帕金森样行为表型的表型分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-15T12:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 了解基于多参数行为实验的斑马鱼幼体帕金森病表型分析方法。该方法整合六种互补行为检测，用于评估MPTP诱导的运动与非运动症状，支持高通量药物筛选和环境神经毒性研究。

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本工作得到了国家自然科学基金（编号：21906095）、山东大学青年学者未来计划资助、山东省自然科学基金（编号：ZR2019BB018）、山东大学基本科研业务费专项资金（编号：2017GN0030）、中国博士后科学基金（编号：2018M640640）的资助。同时获得数字福建老年康复与护理大数据研究所2025年开放研究基金（项目编号：BDRI202502）和南开大学教育部生物活性材料重点实验室2025年开放研究基金（项目编号：SWHX-202503）的支持。济南微生态生物医学山东省实验室科研项目（项目编号：JNL-2023002KF）。&#160;作者谨此感谢山东大学齐鲁医院实验动物中心以及山东大学齐鲁医院临床检验科孙承希博士在实验过程中提供的帮助。

本项涉及斑马鱼的研究严格遵循机构关于动物护理和使用的指导原则，并已获得山东大学药学院伦理委员会批准（编号：YXDW2025-0056）。所用试剂和设备列于材料表中。
1. MPTP 的制备
<ol>
	<li>通过将100× E3储存液与超纯水按1:100稀释来配制1× E3培养基（例如，将5 mL的100× E3与495 mL超纯水混合，得到500 mL的1× E3培养基）。 
	注意：E3培养基需在使用当天新鲜配制。</li>
	<li>通过将5.0 mg MPTP粉末加入50 mL离心管中，并加入E3培养基至终体积为25 mL，配制1 mM MPTP储存液（可使用离心管作为混合容器，但无需离心）。将该溶液标记为1 mM MPTP储存液，并避光保存。</li>
	<li>配制50 µM MPTP溶液：取2.5 mL的1 mM MPTP储存液转移至洁净容器中，加入47.5 mL E3培养基稀释，最终体积为50 mL，终浓度为50 µM MPTP。剩余的储存液继续避光保存。 
	警告：MPTP是一种强效神经毒素，操作时必须格外小心。务必穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括手套、实验服和护目镜。MPTP废弃物应按照机构生物安全指南进行处理。</li>
</ol>
2. 斑马鱼胚胎的制备与分组
<ol>
	<li>选取性成熟的成年雄性和雌性斑马鱼，使用带有可拆卸隔板的繁殖缸进行受控繁殖。在晚上8:00，按2:3的比例将雄性和雌性斑马鱼分别放入繁殖缸中，并用隔板隔开。</li>
	<li>次日早上8:00移除隔板，使斑马鱼交配，从而启动产卵。受精1小时后收集胚胎，并用清洁的系统水清洗三次。</li>
	<li>将胚胎置于含新鲜E3培养基的100 mm培养皿中，在28 °C条件下，按照14小时光照/10小时黑暗的周期（光照时间为早上08:00至晚上10:00）进行培养。 
	注意：每皿中胚胎数量不得超过50个（培养基体积为20 mL），以确保胚胎正常发育。</li>
	<li>在受精后1天（1 dpf），使用巴斯德移液管小心移除未受精、畸形或异常的胚胎，并更换含有斑马鱼胚胎的溶液。对于野生型（WT）组，用新鲜的E3胚胎培养基替换原有培养基；对于MPTP处理组，用50 µM MPTP溶液替换培养基（图1A），然后将两组均放回培养箱。</li>
	<li>对于两组均需每24小时更换一次溶液，并移除任何死亡或状态不良的胚胎。MPTP处理组需从1 dpf早晨开始，每天更换MPTP溶液，直至4 dpf早晨（图1A）。随后，从5 dpf早晨起将MPTP处理组转为E3培养基继续培养，直至实验结束。 
	注意：使用巴斯德移液管轻柔地更换溶液。从培养皿边缘缓慢吸出旧培养基，并沿培养皿壁缓慢加入新鲜溶液，以尽量减少对胚胎的扰动。</li>
</ol>
3. 睡眠-觉醒调节监测
<ol>
	<li>在4 dpf时，于下午6:00从每组中选取斑马鱼幼鱼，使用剪去尖端的改良3 mL巴斯德移液管将其转移至96孔板中，每孔一条幼鱼（图1B）。前四行为野生型（WT）组，后四行为MPTP处理组（每组48条斑马鱼）。 
	注意：为避免刺激或损伤斑马鱼，可通过剪除巴斯德移液管尖端约10 mm，使其具有比4 dpf斑马鱼幼鱼更大口径的宽口（幼鱼体长超过3.7 mm27,28）。</li>
	<li>使用体视显微镜观察每个孔，确保每条斑马鱼幼鱼外观健康，鳍展开且规律摆动，身体直立， swim bladder（ swim bladder）充气正常29。确认各孔中斑马鱼均处于健康状态后，向每孔加入E3培养基。 
	注意：向每孔加E3培养基至接近满溢，保持液面张力。加液时应小心操作，避免产生气泡或液体溢出至相邻孔。</li>
	<li>将鱼和液体转移至96孔板后，将其放入Zebrabox检测室中，适应环境30分钟，随后开始睡眠-觉醒行为检测。 
	注意：在将96孔板放入Zebrabox检测室前，需仔细清洁板底，避免污物影响视频追踪结果。</li>
	<li>打开Zebralab视频追踪软件，选择定量分析模式，并确保96孔板居中放置于Zebrabox检测室底部。</li>
	<li>设置光照程序为晚上10:00关灯、早上8:00开灯，与斑马鱼饲养时的光照条件一致。白天白光强度通常约为1000 lux。软件参数设置如下29：检测阈值为40；爆发运动阈值（on movement）为25；静止阈值（freeze，on movement）为4；时间分段（bin size）为60 s；总监测时间为52 h（从第一天晚上8:00至第三天中午12:00）。睡眠-觉醒实验于晚上8:00开始。 
	注意：实验开始后，整个过程中应禁止外界噪音和振动，以免影响斑马鱼正常的睡眠-觉醒节律。为防止长期监测过程中水分蒸发，应用透明塑料封口膜覆盖96孔板。</li>
	<li>52小时后，停止睡眠-觉醒实验，保存数据文件，并将96孔板从ZebraBox中取出。 
	注意：使用MATLAB和Excel软件，从数据文件中提取并分析必要参数，包括睡眠片段数（睡眠片段定义为持续至少1分钟的静止期）29、平均睡眠片段长度（睡眠片段的平均持续时间）、总睡眠时长（监测期间所有睡眠片段的总持续时间）、睡眠潜伏期（从光照变化到首次睡眠片段开始的时间）、平均活动量（定义为整个监测期间的运动活性）以及觉醒期活动量（定义为仅在清醒期间的运动活性，排除睡眠片段）。 
	<ol>
		<li>采用Student's t检验比较野生型（WT）组与MPTP处理组之间的差异。此外，使用MATLAB软件绘制斑马鱼在52小时内的睡眠曲线、觉醒期活动曲线和平均活动曲线。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 光运动反应范式
注意：光运动反应范式（包括频闪光）是一种高通量行为检测方法，用于量化5天龄幼鱼在光照突然变化时的感知运动和反射性运动反应。该实验使用96孔板进行，包含两个范式：（1）光照条件从1分钟黑暗转为1分钟恒定光照（1000 lx）；（2）频闪光反应，即从1分钟黑暗转为1分钟频率为10 Hz的频闪光照。
<ol>
	<li>将5 dpf的幼鱼放入96孔板中（每孔1条幼鱼）图1B），并向每个孔中加入E3培养基。将总共96条幼鱼平均分为野生型（WT）组和MPTP组。</li>
	<li>恒定黑暗-持续光照范式：
	<ol>
		<li>将含有5 dpf幼鱼的96孔板放入Zebrabox中，于暗处适应5分钟，然后开始实验。</li>
		<li>打开在线分析追踪模式。</li>
		<li>设置光照转换程序如下：0-60 秒：黑暗，60-120 秒：恒定光照（1000 lx）。</li>
		<li>开始实验方案，在120秒测定过程中每6秒采集一次相关运动参数。</li>
		<li>在120处停止实验方案th s，导出数据文件。将幼虫置于完全黑暗环境中5分钟，以适应环境，为后续的暗-闪光刺激实验做准备。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>暗闪光范式：
	<ol>
		<li>设置光照转换程序如下：0–60 秒：黑暗，60–120 秒：10 Hz 频闪闪光（1000 lx）。 
		注意：10 Hz 的闪光表示每秒10次光脉冲。在 ZebraLab 中，通过每隔100 ms将光照强度在0至1000 lx之间交替变化来实现。</li>
		<li>完成5分钟暗适应后，开始暗光转闪光刺激实验。在整个120秒的实验过程中，每6秒采集一次运动参数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析：实验结束后，导出数据文件。使用 MATLAB 软件提取每 6 秒的游泳距离。绘制两个实验条件下 2 分钟内每 6 秒平均游泳总距离的变化曲线。通过从光照条件下 1 分钟内的总移动距离中减去黑暗条件下 1 分钟内的总移动距离，计算冻结指数30. 
	注：冻结指数 &lt; 0 表示冻结行为；冻结指数 &gt; 0 表示逃避；僵直指数 = 0 表示无反应。采用学生 t 检验和双因素方差分析（two-way ANOVA）比较野生型组与 MPTP 处理组之间的差异。每组共使用 48 条斑马鱼幼鱼（n = 48）。</li>
</ol>
5. 触壁行为的评估
<ol>
	<li>选取两个6孔板，每孔加入4 mL E3培养基。</li>
	<li>在5 dpf时，收集野生型（WT）组和MPTP处理组的斑马鱼幼鱼，并分别放入两个6孔板中（一个为WT组，另一个为MPTP处理组，每孔1条幼鱼）（图1C）。 
	注意：确保幼鱼初始位置位于孔的中心。</li>
	<li>在进行趋触性评估前，应提前15分钟将6孔板放置于Zebrabox中的合适位置，以适应环境。</li>
	<li>数据采集与分析：使用绘制区域功能，在每个孔的观察区域内绘制两个同心圆（中心圆的半径占孔半径的1/2）（图1C），其余参数设置与运动能力评估相同。启动程序进行5分钟的趋触性评估，并进行平行实验。 
	注意：程序结束后，Zebralab软件将生成斑马鱼幼鱼在5分钟内的运动轨迹及各种相关运动参数。在数据文件中，an1表示每个孔的整个区域，an2表示每个孔的内圈区域。因此，total dis(an1)和total dur(an1)分别表示在整个孔内的总游动距离和总停留时间，而total dis(an2)和total dur(an2)则分别表示在内圈区域的游动距离和停留时间。
	<ol>
		<li>使用以下公式计算趋触性： 
		计算在外圈区域游动距离所占百分比： 
		<img alt="趋触性计算公式；展示研究背景下行为分析方法的方程。" src="/files/ftp_upload/70041/70041eq1.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1780977605000" data-alt="公式1"> 
		计算在外圈区域停留时间所占百分比： 
		<img alt="趋触性方程，ΣFx=0，描述行为分析，包含参数 total dur、an1、an2。" src="/files/ftp_upload/70041/70041eq2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1780977605000" data-alt="公式2"></li>
		<li>采用Student's t检验比较WT组与MPTP处理组之间趋触性的差异。每组共使用24条斑马鱼幼鱼（n = 24）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 运动功能评估
<ol>
	<li>在5 dpf时，从野生型（WT）组和MPTP处理组中分别选取斑马鱼幼鱼，并转移至两个12孔板中（一个为WT组，另一个为MPTP处理组，每孔1条幼鱼，加入2 mL E3培养基）（图1D）。 
	注意：确保所选斑马鱼幼鱼大小相近，且幼鱼应具有展开的鳍、直立的体态、充气良好的鳔以及规律的运动行为。</li>
	<li>在进行运动能力评估前，提前15分钟将孔板置于Zebrabox的测试位置以适应环境。 
	注意：适应期间的光照条件应与测试期间的光照条件保持一致。</li>
	<li>经过15分钟的适应期后，选择跟踪模式为在线分析，使用自动化的计算机视频跟踪系统记录每条幼鱼5分钟内的运动活动。通过Zebralab软件每60秒采集一次运动轨迹及多种相关运动参数，导出完整数据文件，并使用MATLAB分析每条幼鱼在5分钟内的总移动距离和平均速度。
	<ol>
		<li>采用Student's t检验和双因素方差分析（two-way ANOVA）比较WT组与MPTP处理组之间的差异。每组共使用24条斑马鱼幼鱼（n = 24）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 惊吓反应测试
注意：本实验检测视觉惊吓反应（VSR），也称为暗闪光诱发的惊吓反应，由突然转入黑暗的刺激引发。该惊吓反应测试旨在评估由突然的、毫秒级暗闪光所诱发的光诱发性视觉惊吓反应。与通过重复光脉冲来评估持续性行为反应的暗闪烁光范式不同，本检测方法侧重于对急性视觉刺激产生的快速反射性运动反应。
<ol>
	<li>准备工作：在受精后第5天（5 dpf），分别从野生型（WT）组和MPTP处理组中选取斑马鱼幼鱼，并将其转移至两个12孔板中（一个为WT组，另一个为MPTP处理组，每孔1条幼鱼，加入2 mL E3培养基）（图1D）。</li>
	<li>在惊吓反应测试开始前，提前5分钟将孔板置于Zebrabox的测试位置，以适应环境。</li>
	<li>设置刺激参数：打开Zebralab软件，运行Tracking-online分析模式，进入Light-triggering界面，选择Use one of the 3 triggering methods below，启用Enhanced stimuli，设置为When session is started；在转换时序中定义暗闪光节律如下（程序在启动21秒后开始触发）：Transition 1：5 ms，100%光强；Transition 2：2890 ms，100%光强；Transition 3：5 ms，0%光强；Transition 4：100 ms，0%光强；勾选Repeat list of transitions，以确保实现周期性闪烁。</li>
	<li>启动实验方案：确保Numeriscope视频录制功能已开启，高通量自动追踪将在90秒测试中生成包含30个行为终点的多维数据集。</li>
	<li>数据分析：完成惊吓反应实验后，导出原始数据文件并导入MATLAB软件进行分析。以3秒为间隔计算每条幼鱼的游泳距离及平均游泳速度。
	<ol>
		<li>确定各组在闪光刺激后出现的运动距离峰值、速度峰值或反应潜伏期。采用Student's t检验和双因素方差分析（two-way ANOVA）比较WT组与MPTP处理组之间的差异。每组共使用24条斑马鱼幼鱼（n = 24）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 明暗挑战实验
<ol>
	<li>在5 dpf时，将斑马鱼幼鱼分别转移至两个24孔板中（图1E），每孔一只幼鱼，每孔加入1 mL E3培养基。每个培养板包含24只幼鱼，两个24孔板平均分为野生型（WT）组和MPTP处理组（每组n = 24）。</li>
	<li>测试前，将24孔板放入ZebraBox内的指定测试区域，进行5分钟的光照适应期，以使环境适应。启动跟踪-在线分析模式。设置光照程序如下：6分钟恒定光照，随后4分钟完全黑暗（图1E总测试时间为10分钟，采集数据点的时间间隔为60秒。 
	注意：全局6分钟光照用于适应和习惯化，以确保稳定的运动活动基线以及对明暗环境的特异性反应31,32.</li>
	<li>第10天th 分钟，停止行为记录并保存数据。小心地从 Zebrabox 中取出培养板。</li>
	<li>对每只幼虫，提取每60秒时间间隔内的游泳距离。计算光照阶段（0th-6th 分钟），暗期（7th-10th 分钟），以及整个10分钟时间段。在黑暗阶段定量分析趋壁行为和习惯化学习表现。 
	注意：习惯化学习是指当动物持续暴露于某一刺激或环境时，其行为反应逐渐减弱的现象。33,34，并通过统计学方法比较在1分钟内的平均总移动距离（mm）来进行评估 st 分钟和4th 在光转暗后第 min 进行检测。采用学生 t 检验和双因素方差分析（two-way ANOVA）比较野生型（WT）组与 MPTP 处理组之间的差异。每组共使用 24 条斑马鱼幼鱼（n = 24）。</li>
</ol>
9. MPTP 废物的处理
注意：每次行为学实验后，需使用新配制的次氯酸钠溶液（漂白剂；≥10% v/v）喷洒并擦拭接触过MPTP的表面（例如实验台和ZebraBox）。
<ol>
	<li>收集MPTP的液体废物（包括剩余的暴露溶液和冲洗介质）和固体废物（例如，巴斯德吸管、手套、培养皿和多孔板）。明确标记为有害神经毒性废物。</li>
	<li>使用新配制的次氯酸钠溶液（漂白剂；≥10% v/v）处理受污染的液体废物和固体材料，至少放置24小时以确保去污，随后根据机构规定进行处置。</li>
	<li>通过将MPTP处理的斑马鱼幼体浸入稀释的次氯酸钠溶液（例如，6%漂白剂:水 = 1:5）中5分钟实施安乐死35。通过无运动和无心跳确认死亡。将去污后的幼体及培养基作为有害生物废物，按照机构批准的程序交由机构统一处置。</li>
</ol>

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<li>Dekens, M. P. S., Fontinha, B. M., Gallach, M., Pflugler, S., Tessmar-Raible, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin+elevates+locomotor+activity+during+the+wake+state+of+the+diurnal+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Melanopsin elevates locomotor activity during the wake state of the diurnal zebrafish.</a> EMBO Rep. 23 (5), e51528(2022).</li>
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<li>Cavanagh, J. F., Kumar, P., Mueller, A. A., Richardson, S. P., Mueen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diminished+EEG+habituation+to+novel+events+effectively+classifies+Parkinson%27s+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Diminished EEG habituation to novel events effectively classifies Parkinson's patients.</a> Clin Neurophysiol. 129 (2), 409-418 (2018).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究建立并验证了一种全面的实验方案，用于评估和分析MPTP诱导的帕金森病样行为表型。该方案整合了6种不同的测试方法：运动能力评估、趋壁行为检测、惊吓反应测试、光运动反应范式（包括频闪光刺激）、明暗挑战实验以及睡眠-觉醒调节监测，以系统评价和描述帕金森病的运动与非运动功能缺陷。结果表明，与野生型（WT）组相比，经MPTP处理的斑马鱼幼鱼表现出运动和非运动相关的行为改变，包括活动减少、感觉运动反应受损以及睡眠-觉醒节律紊乱，这些均类似于帕金森病样症状。这些发现证明了斑马鱼模型的可靠性，以及该多行为测试方法在捕捉帕金森病样症状方面的可行性与实用性。
实验从1 dpf的斑马鱼胚胎制备开始。幼虫分别暴露于50 µM MPTP（MPTP处理组）或E3胚胎培养基（WT组），随后在4至6 dpf期间进行行为学评估。以下是各项测试的具体结果与解释：
睡眠-觉醒调节监测 
从受精后第4天开始，使用96孔板对斑马鱼幼鱼持续监测52小时，以测量其睡眠-觉醒节律。结果显示，暴露于MPTP的幼鱼表现出紊乱的睡...

帕金森病（Parkinson's disease, PD）是继阿尔茨海默病之后第二常见的神经退行性疾病1。近年来，其患病率及受累人群数量持续上升，已成为全球重大的公共卫生挑战2。PD 的发病率随年龄增长显著升高3,4。临床上，PD 的表现包括运动症状——如运动障碍、运动迟缓、静止性震颤和姿势不稳——以及多种非运动症状，包括认知功能障碍、焦虑和睡眠障碍5。目前，PD 的诊断主要依赖于运动症状的存在6；然而，当这些症状变得明显时，黑质中的多巴胺能神经元已丧失超过 60%7。尽管非运动症状常更早出现，但缺乏特异且客观的评估标准，使得早期诊断和干预变得复杂8。目前，PD 的主要治疗手段是给予左旋多巴9，该药物在脑内转化为多巴胺，从而补充纹状体中的多巴胺水平。虽然该治疗可暂时缓解症状，但并不能阻止疾病的进展10。因此，进一步开展 PD 发病机制研究和药物筛选至关重要。
建立合适的动物模型对于帕金森病（PD）发病机制的研究以及抗PD药物筛选至关重要。目前，PD研究主要有三种模型：化学诱导模型11、基因编辑模型12和人源异种移植模型13。常用的模式动物包括啮齿类动物（如小鼠）14以及非人灵长类动物（如猴子）15。近年来，斑马鱼（Danio rerio）因其体型小、生长迅速、与人类基因同源性高以及胚胎透明等优势，在PD研究中受到越来越多的关注16。使用神经毒素MPTP（1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶）诱导多巴胺能神经元损伤17,18是构建PD模型的经典方法。斑马鱼在暴露于亚致死浓度的MPTP后，会表现出多种类似PD的行为表型19。
然而，目前大多数斑马鱼帕金森病（PD）研究主要集中于基本的运动行为或简单的明暗转换16,20，而单维度的行为检测方法难以全面反映PD复杂的行為特徵，尤其是非运动功能方面的行为变化。考虑到PD是一种涉及多个神经行为系统而不仅限于运动控制的疾病21,22,23，迫切需要一种多参数行为表型评估方法，以捕捉其多系统的表型特征24。
因此，本研究建立了一种多参数、快速的行为表型分析实验方案，以更全面地描述MPTP处理的斑马鱼幼鱼中类似帕金森病（PD）的行为表型。采用亚致死剂量的MPTP（50 µM）25处理受精后1至5天（dpf）的幼鱼16,20,26。在4至6 dpf期间16,20,24，我们进行了6项行为学测试：睡眠-觉醒调节监测、光运动反应范式、接触性趋避行为评估、运动能力评估、惊跳反应测试以及明暗转换挑战实验。这些行为评估涵盖了运动和非运动两个方面，包括运动障碍、感觉运动功能、习惯化学习、冒险行为、应激反应性以及睡眠-觉醒节律等指标。
利用 Zebrabox 高通量视频追踪系统及定量分析方法，我们提取并量化了多种行为学参数，并通过统计学方法比较了 MPTP 处理组与野生型（WT）组之间的行为差异。与现有的斑马鱼帕金森病（PD）检测方法相比，该多参数行为学检测体系可在标准化框架内同时捕捉运动和非运动表型。自动化追踪系统确保了行为数据采集的客观性和高重复性。此外，幼鱼体型较小，可将个体分别置于多孔板中，从而实现高通量评估。上述优势有助于深入分析帕金森病的病理机制、筛选候选药物或化合物，以及探究环境因素对帕金森病发生或发展的影响。

<table><tbody><tr><td>100&amp;times; E3 储存液</td><td>上海飞兮生物科技有限公司</td><td>N/A</td><td>每升含 34.8 g NaCl、1.6 g KCl、5.8 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 和 9.78 g MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>12 孔细胞培养板</td><td>NEST 生物科技</td><td>712011</td><td>未经处理、无热原、无菌、聚苯乙烯材质。用于斑马鱼幼鱼行为学检测</td></tr><tr><td>24 孔细胞培养板</td><td>NEST 生物科技</td><td>702011</td><td>未经处理、无热原、无菌、聚苯乙烯材质。用于斑马鱼幼鱼行为学检测</td></tr><tr><td>3 mL 巴斯德吸管</td><td>Biologix</td><td>30-0238A1</td><td></td></tr><tr><td>6 孔细胞培养板</td><td>NEST 生物科技</td><td>703011</td><td>未经处理、无热原、无菌、聚苯乙烯材质。用于斑马鱼幼鱼行为学检测</td></tr><tr><td>96 孔细胞培养板</td><td>NEST 生物科技</td><td>701011</td><td>未经处理、无热原、无菌、聚苯乙烯材质。用于斑马鱼幼鱼行为学检测</td></tr><tr><td>MATLAB R2020a</td><td>MathWorks, USA&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>MATLAB R2020a，通过山东大学软件门户（softms.sdu.edu.cn）获取的校园范围许可证。用于斑马鱼幼鱼行为数据的统计分析。</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>Microsoft Excel（Microsoft Office 组件之一），通过山东大学授权软件门户（softms.sdu.edu.cn）安装的版本。</td></tr><tr><td>MPTP（1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶）&amp;nbsp;</td><td>Beyotime</td><td>41125281</td><td>5 mg</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>NEST 生物科技</td><td>704202</td><td>100 mm，无菌，带易握手柄，TC 处理</td></tr><tr><td>次氯酸钠溶液</td><td>麦克林</td><td>S817439</td><td>市售漂白剂原液（有效氯含量 6–14%），稀释至 &amp;ge;10% v/v 用于表面和废弃物去污；也按 1:5（6% 漂白剂 : 水）稀释用于安乐死处理 MPTP 处理的斑马鱼幼鱼。</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZX2 系列</td><td></td></tr><tr><td>Zebrabox 高分辨率视频追踪系统&amp;nbsp;</td><td>Viewpoint, France&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Zebralab 软件&amp;nbsp;</td><td>Viewpoint, France&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>版本 (3,52,3,87)</td></tr></tbody></table>

基于行为学实验的mptp诱导斑马鱼幼鱼帕金森病样行为表型分析

Phenotypic Profiling of MPTP-Induced Parkinsonian-like Behavioral Phenotypes in Zebrafish Larvae Based on Behavioral Experiment

本文介绍了一种独特的、多参数行为表型分析方案，用于研究MPTP诱导的斑马鱼幼鱼帕金森病（PD）。在斑马鱼中通过化学方法诱导类帕金森病病理，提供了一个高通量且遗传上易于操作的研究系统，然而大多数研究仅局限于基本的运动能力检测或简单的明暗转换实验。这类有限的方法无法全面捕捉与PD相关的广泛功能障碍，包括运动迟缓、感觉运动缺陷以及类似焦虑的行为和睡眠紊乱。为弥补这一空白，本研究开发了一套由6项互补实验组成的综合检测体系：运动能力测试用于评估总体运动和探索行为；趋壁性分析用于检测与焦虑相关的边缘偏好行为；惊跳反应测试用于记录运动迟缓和运动反应能力受损；明暗挑战实验用于评估冒险行为和应激反应性；光运动反应范式（包括频闪光刺激）用于量化感觉运动和反射性运动；以及睡眠-觉醒调控监测用于测量睡眠-觉醒行为。斑马鱼幼鱼从受精后第1天（dpf）至第5天持续暴露于亚致死浓度的MPTP中，并于4至6 dpf期间开始进行行为学评估。高分辨率自动化追踪系统为每项实验生成多个行为终点指标。该方法揭示了以往未被发现的类帕金森病改变，例如紊乱的睡眠结构、习惯化学习能力受损、感觉运动及反射性运动异常，反映了早期非运动症状。通过整合这些实验，研究人员可以获得更全面的行为症状谱，更真实地模拟人类帕金森病的复杂性。本方案拓展了研究帕金森病发病机制、筛选候选治疗药物以及探究环境调节因素的研究范式，体现了本系列致力于通过稳健、多维度的表型分析展示创新动物模型的目标。

睡眠-觉醒调节监测 
52小时的睡眠-觉醒调节监测从受精后4天（4 dpf）开始，使用96孔板进行。与野生型（WT）组相比，MPTP处理组斑马鱼的睡眠结构表现出显著紊乱。图2展示了代表性的睡眠曲线、觉醒活动图谱及平均活动轨迹。斑马鱼幼鱼睡眠-觉醒调节分析的各项参数见图3。MPTP组的总睡眠时间较WT组显著增加（p &lt; 0.01，Student's t检验）。MPTP组的睡眠片段数量较WT组减少（p &lt; 0.001），而平均睡眠片段持续时间则显著延长（p &lt; 0.0001）。两组间的睡眠潜伏期无显著差异。MPTP组的觉醒活动也受到显著影响（p &lt; 0.01），平均活动水平降低（p &lt; 0.01）。
光运动反应范式 
在5 dpf时，采用96孔板光运动反应实验评估恒定光照和频闪光照条件下感觉运动门控功能。图4A</st...

本方案建立了一种在MPTP处理的斑马鱼幼虫中进行行为表型分析的范式，用于评估类似帕金森病的运动和非运动功能缺陷。

基于行为学实验的MPTP诱导斑马鱼幼鱼帕金森病样行为表型分析

本文介绍了一种独特的多参数行为表型分析方案，用于研究MPTP诱导的幼年斑马鱼帕金森病（PD）。化学……

我们提出了一种多参数行为学方案，用于全面分析斑马鱼幼体中运动性和非运动性帕金森表型。该方案适用于帕金森病建模、药物筛选、环境神经毒性研究以及利用鱼类幼体开展的相关研究。开始实验前，请穿戴适当的个人防护装备，包括手套、实验服和护目镜。用超纯水按1:100的比例稀释100倍浓度的E3储存液，制备单倍浓度的培养基。然后选取性成熟的成年雄性和雌性斑马鱼。使用带有可拆卸隔板的繁殖箱，进行受控繁殖。晚上8:00，将雄性和雌性斑马鱼按2条雄鱼比3条雌鱼的比例放入繁殖缸的不同区域，并使用隔板将其分隔开。次日早上8:00，移除隔板以允许交配。一小时后收集胚胎，并用干净的系统水清洗三次。将胚胎置于含有20毫升新鲜E3培养基的100毫米培养皿中，在28°C、14小时光照和10小时黑暗的循环条件下培养胚胎。受精后一天，使用巴斯德吸管小心去除未受精、畸形和异常的胚胎。从培养皿边缘缓慢吸出培养基，并沿培养皿壁加入新鲜的 E3 胚胎培养基，以尽量减少对野生型胚胎的扰动。对于 MPTP 处理组，使用 50 微摩尔 MPTP 溶液。受精后第四天，将一支 3 毫升巴斯德移液管的尖端剪去 10 毫米，以形成宽口。在下午6:00，使用改装过的移液器从每组中挑选斑马鱼幼鱼，将每组一条幼鱼转移至96孔板中。在体视显微镜下观察每个孔，确认每条斑马鱼幼鱼外观健康，鱼鳍张开并规律摆动，身体直立， swim bladder（ swim ladder 应为 swim bladder 之误）充气正常。接下来，仔细清洁板的底部，以防止污物影响视频追踪结果。然后将96孔板居中转移至斑马鱼行为观测箱的底部。在视频追踪软件中选择量化模式。为监测睡眠-觉醒节律，将光照调节设置为晚上10:00关闭灯光，早上8:00开启灯光。配置软件参数，使检测阈值设为40，突发（burst）设为25，静止（freeze）设为4，总监测时间为52小时，分段时长设为60秒。在晚上8:00开始睡眠-觉醒监测程序。为监测光运动反应，将受精后第5天的幼鱼放入96孔板中，每孔一条幼鱼。然后设置光照转换程序：0至60秒为黑暗期，随后60至120秒为恒定光照期。开始实验方案，并在120秒的检测过程中每六秒采集一次运动参数。120秒时停止实验方案，并导出数据文件。随后将幼虫置于完全黑暗环境中五分钟，使其适应后续的暗闪光检测。设置光转换程序，以每秒10赫兹的频率提供60秒的闪光刺激。为评估接触趋向性，选取两个六孔板，每个孔中加入4毫升E3培养基。受精后第五天，分别收集野生型组和MPTP处理组的斑马鱼幼鱼，放入不同的六孔板中。在进行趋边性评估前，将六孔板置于斑马鱼行为箱中适应15分钟。随后使用绘图区域功能，在每个孔中绘制两个同心圆，内圆半径为孔半径的一半，然后开始评估。进行运动能力评估时，将野生型组和MPTP处理组的5日龄斑马鱼幼鱼分别转移至两个独立的12孔板中。经过15分钟适应后，选择在线追踪分析模式，使用自动视频追踪系统记录5分钟内的运动活动。对于惊吓反应测试，将5日龄幼鱼分别单独转移至两个12孔板中，每孔一条幼鱼，加入2毫升E3培养基。将培养板放入斑马鱼行为分析仪中，进行5分钟的光适应。启动ZebraLab软件并激活在线分析追踪模式。打开光刺激触发界面，然后选择并使用以下三种触发方法之一，并启用增强刺激。然后，将起始方式设置为会话开始时。在过渡时间表中，定义暗闪光节律。设置程序在21秒后触发，然后将过渡一设置为5毫秒，光强度为100%。将过渡二设置为2,890毫秒，光强100%；过渡三设置为5毫秒，光强0%；过渡四设置为100毫秒，光强0%。勾选“重复过渡列表”以确保实现周期性闪烁，然后启动实验方案。进行明暗挑战实验时，将斑马鱼幼鱼转移至两个24孔板中，每孔一条幼鱼，每孔加入1毫升E3培养基。在斑马鱼行为分析箱中适应5分钟后，启动轨迹分析在线模式，随后设置光照程序：先给予6分钟持续光照，接着4分钟完全黑暗。第10分钟时，停止行为记录并保存数据。小心地将培养板从斑马鱼行为箱中取出。每次行为实验结束后，使用新配制的次氯酸钠溶液喷洒并擦拭所有接触过MPTP的表面。收集含有MPTP的液体和固体废物，并明确标记为有害神经毒性废物。所有受污染的材料均需用新鲜配制的次氯酸钠溶液处理。与野生型组相比，经处理的斑马鱼幼体表现出睡眠和觉醒活动轨迹的紊乱。治疗组的总睡眠时间也显著增加。治疗组的觉醒次数显著减少，而平均觉醒持续时间延长。治疗组的清醒活动量和平均活动量均显著降低。在恒定光照下，处理组的僵直指数显著升高。在10赫兹频闪光刺激下，僵直指数也显著升高。光运动反应曲线显示处理组的反应性降低。追踪结果显示，处理组的运动和探索行为减少。处理组的总游泳时间和平均游泳速度也显著降低。处理组的静止运动时间比例显著升高，但快速运动时间比例显著降低。野生型幼虫在明暗交替的刺激下表现出明显的速度峰值。与对照组相比，处理组在刺激后游泳的距离以及刺激后的峰值速度均显著降低。此外，处理组达到最高速度运动的潜伏期也显著延长。关键挑战在于在考虑个体差异的同时，尽量减少内部决定因素，以确保斑马鱼水平上行为分析的准确性和可重复性。行为聚类和表型组学分析可用于揭示细微的神经毒性效应，并获得更深入的机制见解。未来的研究可将该平台应用于危害性评估、药物筛选以及斑马鱼帕金森病模型的药理学评价。

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