Name: 脑脊液的宏基因组次世代测序以检测中枢神经系统病原体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-17T13:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 了解脑脊液宏基因组次世代测序的优化实验方案，该方案针对低核酸丰度和降解问题进行了专门改进，可在Illumina平台上实现稳健的中枢神经系统病原体检测，适用于高通量和低成本两种测序工作流程。

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本研究获得了美国国立卫生研究院福格蒂国际中心资助项目（资助编号：D43TW009343）的支持。我们谨向加州大学旧金山分校威尔逊实验室以及CZI的众多研究人员致以诚挚感谢，他们在过去数年中为宏基因组测序（mNGS）技术在多种科研应用中的开发与优化做出了重要贡献。

本方案的开发和测试使用了根据加州大学旧金山分校机构审查委员会批准的研究项目所采集的样本。
<img alt="脑脊液测序工作流程：样本采集、DNA/RNA提取、Illumina测序、病原体鉴定。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70075/70075fig1.jpg" data-altupdatedat="1780372819000" data-alt="图1"> 
图1：脑脊液（CSF）宏基因组下一代测序（mNGS）样本处理及病原体检测分析工作流程。该示意图展示了脑脊液mNGS湿实验和生物信息学分析路径的主要步骤。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70075/70075fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
1. 脑脊液样本处理注意事项
注意：如果脑脊液（CSF）文库制备在样本采集时立即进行，或在采集后通过液氮速冻并长期保存于 -80 °C 条件下，则宏基因组测序（mNGS）结果最佳15。 alternatively，也可在样本采集时使用保存液（如 DNA/RNA Shield），从而允许样本在室温下长期储存16,17。当冷链运输或储存条件不可靠时，此方法可能更为适宜。此外，避免不必要的冻融循环也有助于维持核酸完整性；若预期对脑脊液样本进行多种分析流程，建议在采集时预先分装成多个 aliquot18,19。
2. 脑脊液核酸提取
警告：应在适当的生物安全柜中操作，并佩戴手套和实验服，以降低传染性生物体传播的风险。试剂若被吞咽、吸入或与皮肤接触，可能对人体有害。使用后的材料应按照当地法规作为危险化学废物进行处置。
<ol>
	<li>Quick-DNA/RNA 试剂盒通常适用于核酸含量较低的样本。</li>
	<li>将脑脊液（CSF）样本置于冰上解冻，然后吸取每份样本 100 µL–1 mL 转移至 1.5 mL 离心管中，在 4 °C 条件下以 16,000 x g 离心 10 分钟。</li>
	<li>小心吸取上清液，保留沉淀（通常肉眼不可见）及约 100 µL 上清液。</li>
	<li>向剩余的 100 µL 上清液和沉淀中加入 100 µL DNA/RNA Shield，充分吹打混匀。</li>
	<li>随后加入 600 µL DNA/RNA 裂解缓冲液，吹打混匀至溶液均匀。</li>
	<li>按照制造商在补充附录 A中所述的其余 DNA/RNA 提取步骤进行操作，并针对脑脊液样本作以下重要修改：
	<ol>
		<li>除最后的 DNA/RNA 洗涤步骤需在最大速度（约 21,000 x g）下离心 3 分钟外，其余所有离心步骤均在最大速度下离心 1 分钟。</li>
		<li>洗脱时，直接向柱基质中加入 22 µL（而非 25 µL）无核酸酶水，室温孵育 3 分钟。较高的洗脱体积通常可获得更多的总核酸量。</li>
		<li>洗脱后，将流出液重新吸打至柱基质上，再次于最大速度下离心 1 分钟。将样本转移至新的 1.5 mL 储存管中，可立即进行文库构建，或于 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 脑脊液RNA文库制备
警告：操作应在适当的生物安全柜中进行，并佩戴手套和实验室外套。试剂若被吞咽、吸入或与皮肤接触，可能对人体有害。使用后的材料应按照当地法规作为危险化学废物进行处置。
注意：实验开始前的重要考虑事项：在分离 mRNA 时，优先选择核糖体 RNA 耗竭法（rRNA depletion），而非多聚腺苷酸富集法，因为 rRNA 耗竭法无需额外的磁珠纯化步骤（这些步骤可能导致可用 mRNA 产量降低），且某些嗜神经 RNA 病毒的转录本缺乏多聚腺苷酸结构。可添加 ERCC（外部 RNA 控制联盟）RNA 外参作为质量控制措施，但并非必需。若 RNA 提取后保存于 -80 °C，使用前需在冰上解冻。
<ol>
	<li>RNA片段化与引物结合：在聚合酶链式反应（PCR）管中加入以下组分并用移液器混匀：3.5 µL RNA样品、0.5 µL 1:2500稀释的ERCC外参 spike-in、4 µL第一链反应缓冲液（5x）、1 µL随机引物和1 µL 1:100稀释的rRNA（材料表）。将样品放入热循环仪中，加热盖温度设为105 °C，依次在75 °C孵育2 min、70 °C孵育2 min、65 °C孵育2 min、60 °C孵育2 min、55 °C孵育2 min、37 °C孵育5 min，最后在25 °C孵育5 min。</li>
	<li>第一链cDNA合成：将片段化并结合了引物的RNA（10 µL）与8 µL无核酸酶水和2 µL第一链合成酶混合液用移液器混匀。将样品放入热循环仪中，加热盖温度设为105 °C，依次在25 °C孵育10 min、42 °C孵育15 min，最后在70 °C孵育15 min。</li>
	<li>第二链cDNA合成：将已合成第一链的cDNA（20 µL）与8 µL第二链合成反应缓冲液、4 µL第二链合成酶混合液和48 µL无核酸酶水用移液器混匀。将样品放入热循环仪中，在16 °C孵育1 h，加热盖关闭。</li>
	<li>使用SPRI磁珠（144 µL，比例为1.8x）进行磁珠纯化（补充附录B）。用53 µL无核酸酶水洗脱，并将50 µL最终上清液（含纯化的双链cDNA）转移至洁净的无核酸酶PCR管中。如有需要，样品可在此阶段于-20 °C安全冷冻过夜。</li>
	<li>cDNA文库末端修复：若样品曾在-20 °C保存过夜，重新操作前需在冰上解冻。将纯化的双链cDNA（50 µL）与7 µL末端修复反应缓冲液和3 µL末端修复酶混合液用移液器混匀。</li>
	<li>将样品放入热循环仪中，在20 °C孵育30 min，随后在65 °C孵育30 min，加热盖关闭。</li>
	<li>接头连接（此步骤需在冰上操作）：在无核酸酶水中将接头稀释至1:100。将末端修复反应混合物（60 µL）加入另一管中，该管预先含有30 µL连接主混合液、1 µL连接增强剂和2.5 µL 1:100稀释的接头。确保接头单独加入（例如，不与连接主混合液或连接增强剂预先混合），以避免接头二聚体的形成。</li>
	<li>将样品放入热循环仪中，在20 °C孵育15 min，加热盖关闭。</li>
	<li>立即进行磁珠纯化（补充附录2），使用SPRI磁珠（87 µL，比例为0.9x）。</li>
	<li>用17 µL无核酸酶水洗脱，并将15 µL最终上清液转移至洁净的无核酸酶PCR管中。</li>
	<li>加标签PCR扩增：将经纯化并连接接头的cDNA（15 µL）加入另一管中，加入3 µL USER酶、25 µL Q5主混合液和10 µL特异性条形码引物。将样品放入热循环仪中，加热盖温度设为105 °C，先在37 °C孵育15 min，然后在98 °C孵育30 s，接着进行19个循环（每个循环：98 °C变性10 s，65 °C退火延伸75 s）。PCR结束前，在65 °C再孵育5 min以完成反应。</li>
	<li>使用磁珠（43 µL，比例为0.8x）进行最终磁珠纯化。用23 µL无核酸酶水洗脱，完成最终磁珠分离后，将20 µL洗脱液转移至洁净的无核酸酶PCR管中。如有需要，样品可在此阶段于-20 °C安全冷冻过夜。</li>
</ol>
4. 脑脊液DNA文库构建
警告：应在适当的生物安全柜中佩戴手套和实验室外套进行操作。试剂若吞咽、吸入或与皮肤接触，可能对人体有害。使用后的材料应按照当地法规作为危险化学废物处理。
<ol>
	<li>如果提取的DNA在-20 °C下保存过夜，请在重新开始前置于冰上解冻。</li>
	<li>DNA片段化与末端修复：通过涡旋振荡和移液混合，充分混匀第一链反应缓冲液，以重悬任何沉淀物。用移液器混合3.5 µL提取的DNA、22.5 µL无核酸酶水、7 µL第一链反应缓冲液和2 µL第一链酶混合液。</li>
	<li>在热循环仪中，将加热盖设为105 °C，将样品在37 °C孵育5 min，随后在65 °C孵育30 min。</li>
	<li>DNA文库与RNA文库的接头连接及加标签PCR步骤相同。对已片段化并完成末端修复的DNA，重复“脑脊液RNA文库构建”部分的第7–10节，以完成DNA文库的制备。</li>
</ol>
5. 文库质量控制与合并
<ol>
	<li>使用DNA定量试剂盒及相应的荧光计测定样本文库的浓度。水对照组的浓度应明显低于其他样本（或无法定量）。</li>
	<li>通过自动化毛细管电泳仪检测样本文库的片段大小。</li>
	<li>或者，若无自动化毛细管电泳仪，可取1–2 µL样本使用Illumina通用引物进行PCR扩增，随后将最终产物中的10 µL在2%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。使用过的材料应按照当地法规作为危险化学废弃物处理。 
	注意：理想文库长度约为400–500个碱基对，因此若文库长度大于或小于预期，应相应调整后续片段化反应的孵育时间。此外，必须检测接头二聚体的存在，其长度约为150个碱基对，由两个接头分子在无插入序列的情况下意外连接形成。即使含量较低，接头二聚体在流动池中仍易于聚集并高效测序，从而降低测序运行中可用读段的比例。因此，若存在接头二聚体，应使用0.8倍体积的SPRI磁珠进行额外的磁珠纯化。（需要注意的是，如果样本中接头二聚体&gt;10%，可能需要进行2–3轮磁珠纯化才能去除大部分接头二聚体）。</li>
	<li>为确保同一次测序运行中各样本的测序深度相近，必须将每个样本的等摩尔量进行混合。若所有样本的文库大小相近，可直接等质量混合各个RNA文库，并对每个DNA文库分别重复此操作。</li>
</ol>
6. 测序注意事项
<ol>
	<li>混合后的样本现已准备好用于Illumina测序仪进行测序。如果在本单位内进行测序（而非通过专业的测序核心平台），在将样本池加载到试剂载片之前，需根据测序仪的操作说明对混合文库进行仔细的变性与稀释（大多数Illumina测序平台的典型浓度为4 nM）。</li>
	<li>通过将Illumina流动池的预期数据产出量除以测序运行中多重样本的数量，计算出预计的测序深度。 
	注意：所需测序深度的确定取决于多个因素，包括成本、所用测序仪类型以及实验目标。不同测序深度的两个示例如下文“代表性结果”部分所示。</li>
</ol>
7. 病原体检测的数据分析
<ol>
	<li>使用开源的基于网络的平台 Chan Zuckerberg ID（CZID，https://www.czid.org，Illumina mNGS 分析流程 v8.3）进行宏基因组学分析以检测病原体。CZID 还提供通过命令行界面上传样本，以及从 Illumina BaseSpace 账户直接传输至 CZID 的选项。有关 CZID mNGS 数据分析的详细概述，请访问 https://chanzuckerberg.zendesk.com/hc/en-us/articles/13770737266196-Guide-to-mNGS-Data-Analysis</li>
	<li>登录 CZID，点击“上传”，选择“宏基因组学”作为分析类型，并从测序结果中选择输入的 fastq 文件。为每个样本输入必要信息，包括样本名称、样本类型（脑脊液）和核酸类型（RNA 或 DNA）。 
	注意：上传的文件将通过 CZID 分析流程进行自动化处理，该流程整合了多种计算工具（如 STAR、Bowtie2、Trimmomatic、PriceSeq 和 GSNAP 等），用于去除低质量读段和人源读段序列。随后，流程利用 Minimap2 和 DIAMOND 软件分别比对并组装过滤后的序列，参考数据库为美国国家生物技术信息中心（NCBI）的核苷酸（NT）和蛋白质（NR）数据库。最终的 CZID 输出结果包括每个样本的 NT/NR 分类单元计数和重叠群（contig）计数（即组装过程中生成的连续重叠片段）。</li>
	<li>处理完成后，点击包含样本的项目文件夹，进入汇总仪表板。</li>
	<li>向下滚动，查看每个样本的读段数量（并与所用 Illumina 流式芯片及测序运行中多重样本数量预期的读段数进行比较）、通过质量控制过滤的读段百分比，以及重复压缩比，以评估是否存在 PCR 过度扩增导致的偏差。</li>
	<li>在脑脊液样本采集过程或提取/文库制备过程中，环境核酸片段污染是常见现象20。为判断细菌、真菌和寄生虫读段是否为真阳性，可考虑采用基于标准化读段数（每百万读段数，rPM）的潜在分析方法：
	<ol>
		<li>在 CZID 内直接建立背景模型（例如，使用经过提取、制备和测序的水样本），以过滤掉 rPM 与背景模型相似或低于背景模型的分类单元（因此可能代表污染）。在项目文件夹中，选中各个水阴性对照样本，然后点击“背景模型”进行创建。在分析每个样本时，选择该背景模型并点击“阈值过滤”，应用“NTZ Score” &gt; 1（或更高）以去除可能的污染物。</li>
		<li>使用预设的 rPM 阈值，例如 rpM样本 &gt; 10×(对照组平均 rPM对照)，或 log10(rPM样本) 至少比 log10(整个队列平均 rPM队列) 高出 1 个数量级。首先，在项目页面上选中每个样本，点击下载，选择“合并样本分类单元结果”，下载每个样本的特异性 rPM 数据。生成的 .csv 文件可根据需要使用 R 或 Stata 等统计软件进行分析。 
		注意：由于病毒病原体的相对丰度较低，任何具有已知神经侵袭潜力且至少有一条读段比对到其基因组的病毒均应视为阳性结果（理想情况下应通过重复 mNGS 或病原体特异性临床检测进行确认）。此外，分析流程要求 fastq 文件中的每条读段在计算上比对到 NCBI 数据库中最可能的参考基因组。因此，部分读段可能对特定病原体特异性较低，理论上可能比对到多种生物体，而非 CZID 所指定的具体分类单元。鉴于此风险，应对阳性结果进行人工确认，方法是通过基于网络的 NCBI BLAST 工具验证比对结果（可通过点击相关分类单元旁的 blast 图标，将 CZID 中特定分类单元的读段直接发送至 NCBI BLAST 进行比对）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Chiu, C. Y., Miller, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Clinical metagenomics.</a> Nat Rev Genet. 20 (6), 341-355 (2019).</li>
<li>Wilson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+metagenomic+sequencing+for+diagnosis+of+meningitis+and+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical metagenomic sequencing for diagnosis of meningitis and encephalitis.</a> N Engl J Med. 380 (24), 2327-2340 (2019).</li>
<li>Forbes, J. D., Knox, N. C., Ronholm, J., Pagotto, F., Reimer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomics%3A+the+next+culture-independent+game+changer%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Metagenomics: the next culture-independent game changer.</a> Front. Microbiol. 8, (2017).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>DNA Sequencing Costs: Data. , National Human Genome Research Institute (US). 
 <a target="_blank" href="https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/DNA-Sequencing-Costs-Data">https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/DNA-Sequencing-Costs-Data</a> (2026).</li>
<li>Wilson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+meningitis+investigated+via+metagenomic+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Neurology%22%5BJournal%5D)">Chronic meningitis investigated via metagenomic next-generation sequencing.</a> JAMA Neurology. 75 (8), 947-955 (2018).</li>
<li>Benoit, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seven-year+performance+of+a+clinical+metagenomic+next-generation+sequencing+test+for+diagnosis+of+central+nervous+system+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Seven-year performance of a clinical metagenomic next-generation sequencing test for diagnosis of central nervous system infections.</a> Nat Med. 30 (12), 3522-3533 (2024).</li>
<li>Glaser, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+search+of+encephalitis+etiologies%3A+diagnostic+challenges+in+the+California+encephalitis+project%2C+1998-2000%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">In search of encephalitis etiologies: diagnostic challenges in the California encephalitis project, 1998-2000.</a> Clinical Infectious Diseases. 36 (6), 731-742 (2003).</li>
<li>Ramachandran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+central+nervous+system+metagenomics+and+host+response+for+diagnosis+of+tuberculosis+meningitis+and+its+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Integrating central nervous system metagenomics and host response for diagnosis of tuberculosis meningitis and its mimics.</a> Nat Commun. 13, 1675(2022).</li>
<li>Xing, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+DNA%2FRNA+microbe+detection+and+host+response+for+accurate+diagnosis%2C+treatment%2C+and+prognosis+of+childhood+infectious+meningitis+and+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Integrating DNA/RNA microbe detection and host response for accurate diagnosis, treatment, and prognosis of childhood infectious meningitis and encephalitis.</a> J Transl Med. 22, 583(2024).</li>
<li>Omura, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((298.+Host+response+profiling+from+clinical+metagenomic+sequencing+data+for+diagnosis+of+central+nervous+system+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Forum+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">298. Host response profiling from clinical metagenomic sequencing data for diagnosis of central nervous system infections.</a> Open Forum Infect Dis. 12 (1), (2025).</li>
<li>Andriuk, L. V., Skochiĭ, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acids+of+the+cerebrospinal+fluid+in+acute+disorders+of+cerebral+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Zh+Nevropatol+Psikhiatr+Im+S+S+Korsakova%22%5BJournal%5D)">Nucleic acids of the cerebrospinal fluid in acute disorders of cerebral circulation.</a> Zh Nevropatol Psikhiatr Im S S Korsakova. 88 (7), 32-34 (1988).</li>
<li>Olausson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+cerebrospinal+fluid+microbial+DNA+metagenomic+sequencing+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Optimization of cerebrospinal fluid microbial DNA metagenomic sequencing diagnostics.</a> Sci Rep. 12 (1), 3378(2022).</li>
<li>Becskei, A., Rahaman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+and+death+of+RNA+across+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Struct+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">The life and death of RNA across temperatures.</a> Comput Struct Biotechnol J. 20, 4325-4336 (2022).</li>
<li>Wang, C., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+degradation+kinetics+of+mRNAs+and+half-lives+of+microRNAs%2C+circRNAs%2C+lncRNAs+in+blood+in+vitro+using+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Factors influencing degradation kinetics of mRNAs and half-lives of microRNAs, circRNAs, lncRNAs in blood in vitro using quantitative PCR.</a> Sci Rep. 12 (1), 7259(2022).</li>
<li>Cb, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA%2FRNA+preservation+in+glacial+snow+and+ice+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">DNA/RNA preservation in glacial snow and ice samples.</a> Frontiers in microbiology. 13, (2022).</li>
<li>Kazantseva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+sample+storage+and+DNA+extraction+for+human+gut+microbiota+studies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+microbiology%22%5BJournal%5D)">Optimisation of sample storage and DNA extraction for human gut microbiota studies.</a> BMC microbiology. 21 (1), (2021).</li>
<li>Xiaoli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+repeated+freeze-thaw+cycles+on+the+quality+of+biomolecules+in+four+different+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreservation+and+biobanking%22%5BJournal%5D)">The impact of repeated freeze-thaw cycles on the quality of biomolecules in four different tissues.</a> Biopreservation and biobanking. 15 (5), (2017).</li>
<li>Kellman, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+freeze-thaw+cycles+lead+to+a+loss+of+consistency+in+poly%28A%29-enriched+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Multiple freeze-thaw cycles lead to a loss of consistency in poly(A)-enriched RNA sequencing.</a> BMC genomics. 22 (1), (2021).</li>
<li>Zinter, M. S., Mayday, M. Y., Ryckman, K. K., Jelliffe-Pawlowski, L. L., DeRisi, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+precision+quantification+of+contamination+in+metagenomic+sequencing+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Towards precision quantification of contamination in metagenomic sequencing experiments.</a> Microbiome. 7 (1), 62(2019).</li>
<li>Mayday, M. Y., Khan, L. M., Chow, E. D., Zinter, M. S., DeRisi, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturization+and+optimization+of+384-well+compatible+RNA+sequencing+library+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Miniaturization and optimization of 384-well compatible RNA sequencing library preparation.</a> PLoS One. 14 (1), e0206194(2019).</li>
<li>Sakiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+biopsy+and+metagenomic+sequencing+enhance+aetiological+diagnosis+of+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Commun%22%5BJournal%5D)">Brain biopsy and metagenomic sequencing enhance aetiological diagnosis of encephalitis.</a> Brain Commun. 7 (3), fcaf1650(2025).</li>
<li>Sakiyama, Y., Yuan, J., Yoshimura, A., Takei, J., Ando, M., Takashima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etiological+insights+of+encephalitis+and+encephalitis-like+central+nervous+system+diseases%3A+brain+tissue+metagenomic+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Etiological insights of encephalitis and encephalitis-like central nervous system diseases: brain tissue metagenomic next-generation sequencing.</a> Neurology. 102 (7-1), 3782(2024).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+PCR+amplification+errors+in+unique+molecular+identifiers+to+generate+accurate+numbers+of+sequencing+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Correcting PCR amplification errors in unique molecular identifiers to generate accurate numbers of sequencing molecules.</a> Nat Methods. 21 (3), 401-405 (2024).</li>
<li>Tan, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+validation+of+a+clinical+metagenomic+next-generation+sequencing+assay+for+respiratory+virus+detection+and+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Laboratory validation of a clinical metagenomic next-generation sequencing assay for respiratory virus detection and discovery.</a> Nat Commun. 15 (1), 9016(2024).</li>
<li>Prasanna, A. kshatha <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPrasanna%2C+Akshatha+%22Clin-mNGS%3A+Automated+pipeline+for+pathogen+detection+from+clinical+metagenomic+data%22">Clin-mNGS: Automated pipeline for pathogen detection from clinical metagenomic data</a>. , https://github.com/AkshathaPrasanna/Clin-mNGS (2025).</li>
<li>Marra, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+next-generation+sequencing+in+patients+with+infectious+meningoencephalitis%3A+a+comprehensive+systematic+literature+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Forum+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Metagenomic next-generation sequencing in patients with infectious meningoencephalitis: a comprehensive systematic literature review and meta-analysis.</a> Open Forum Infect Dis. 12 (5), ofaf274(2025).</li>
<li>Ramachandran, P. S., Wilson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomics+for+neurological+infections+-+expanding+our+imagination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Metagenomics for neurological infections - expanding our imagination.</a> Nat Rev Neurol. 16 (10), 547-556 (2020).</li>
<li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biol. 12, 87(2014).</li>
<li>Simner, P. J., Miller, S., Carroll, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+promises+and+hurdles+of+metagenomic+next-generation+sequencing+as+a+diagnostic+tool+for+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Understanding the promises and hurdles of metagenomic next-generation sequencing as a diagnostic tool for infectious diseases.</a> Clin Infect Dis. 66 (5), 778-788 (2018).</li>
</ol>

M.R.W. 获得了来自 Roche/Genentech、Novartis 和 Kyverna Therapeutics 的非关联研究资助，并且是 Delve Bio Inc. 的创始人及董事会成员。他曾为 Pfizer、Vertex Pharmaceuticals、Ouro Medicines 和 Indapta Therapeutics 提供咨询服务。

根据所需的测序深度、所使用的测序平台以及质量控制设备的可用性，可能需要对该方案进行某些重要调整。然而，本文所展示的两个代表性队列表明，在广泛的实验条件下仍可实现可靠的病原体检测。具体而言，B队列显示，尽管采取了多项节约成本的措施——包括低深度测序、省略ERCC对照、方案微型化，以及使用传统凝胶电泳而非生物分析仪或TapeStation进行质量控制——样本中仍检测到了多种多样的神经侵袭性病原体。
在实验过程中，有若干关键步骤和注意事项可最大限度地提高实验成功率。提取过程中（特别是添加 DNA/RNA Shield 之前）应高效操作，以避免 RNA 发生非预期的降解。在文库构建的各个步骤中，应充分混匀反应体系以确保均一性，同时避免产生过多气泡，因为气泡可能降低文库得率。若混匀后仍可见气泡，可轻轻弹击 PCR 板条并进行瞬时离心。接头二聚体是本实验中另一个关键问题。为降低接头二聚体过量的风险，应在 PCR 管置于冰上时，将稀释后的接头与主混合液分开加入，并充分混匀（若处理多个样本，建议使用多通道移液器）。在质控评估中若发现接头二聚体过量，通常需要额外进行 2–3 次磁珠纯化（磁珠与文库体...

宏基因组高通量测序（mNGS）是一种日益广泛应用的分子技术，可用于检测特定环境或宿主样本中广泛存在的核酸1。通过对样本中绝大多数遗传物质进行扩增和测序，mNGS无需预先假设样本中可能存在的特定微生物种类。mNGS已显示出作为诊断工具在多种临床场景中的应用价值，例如用于检测罕见病原体或感染性疾病的非典型表现1,2,3。此外，mNGS检测所产生的RNA测序数据还可捕获宿主的转录谱，使研究人员能够更深入地理解宿主对不同疾病状态的免疫应答4。由于mNGS适用于广泛的临床和研究场景，加之近几十年来通用测序成本显著下降，该技术的应用已实现巨大增长5。&#160;
特别是，宏基因组下一代测序（mNGS）在中枢神经系统（CNS）感染的检测中展现出良好的应用前景，而这类感染目前仍难以诊断2,6,7。在临床mNGS检测出现之前，加州脑炎项目曾对全州范围内的脑炎病因进行了调查，发现尽管采用了扩展的分子检测组合和详细的临床评估，仍有一半以上的病例未能明确诊断8。如今，二十多年后，一项经过临床验证的脑脊液（CSF）mNGS检测方法在为期七年的研究期间，于近15%的疑似中枢神经系统感染患者脑脊液中检测到了致病性微生物7。此外，在已确诊为感染性疾病的患者中，每五人就有一人仅通过该临床脑脊液mNGS检测才得以确诊，凸显了该检测方法的重要价值7。另外，研究还表明，基于mNGS检测所获得的宿主转录组信息，有望预测多种中枢神经系统感染的发生概率9,10,11。&#160;
然而，由于脑脊液样本处理和加工过程中存在一些特有的挑战，这一前景广阔的技术的应用受到限制。特别是，脑脊液中的DNA和RNA含量通常低于文库构建试剂盒所规定的最低要求量12,13。此外，用于临床目的采集的脑脊液样本通常储存在DNA酶和RNA酶仍可保持活性的温度条件下，导致核酸质量可能不理想14。本文介绍了一种基于研究的脑脊液宏基因组下一代测序（mNGS）方案，适用于Illumina测序平台，已优化以最大程度提高获得可用于病原体检测的有效数据的可能性（图1）。&#160;

<table><tbody><tr><td>0.2 mL PCR 管条</td><td>Eppendorf</td><td>30124359</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL DNA LoBind 管</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 安全锁紧管</td><td>Eppendorf</td><td>30120191</td><td></td></tr><tr><td>ERCC RNA 外参混合液</td><td>Thermo Fisher</td><td>4456740</td><td></td></tr><tr><td>高灵敏度 D1000 试剂</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Collibri 文库扩增主混合液</td><td>Thermo Fisher</td><td>A38539050</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler x50</td><td>Thermo Fisher</td><td>6311000010</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Illumina 多重引物组</td><td>New England Biolabs</td><td>7335S/L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II DNA 文库构建试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>E7645</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II RNA 文库构建试剂盒（适用于 Illumina）</td><td>New England Biolabs</td><td>E7770</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500/550 高输出试剂盒 v2.5（150 个循环）</td><td>Illumina</td><td>20024907</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 550</td><td>Illumina</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>QIAseq FastSelect -rRNA HMR 试剂盒</td><td>Quiagen</td><td>334386</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1X dsDNA 高灵敏度检测试剂盒</td><td>Qubit</td><td>Q33230</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 荧光仪</td><td>Thermo Fisher</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Quick-DNA/RNA 微量提取 Plus 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Zymo</td><td>D7005</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation 4150</td><td>Agilent</td><td>G2992AA</td><td></td></tr></tbody></table>

脑脊液宏基因组高通量测序用于中枢神经系统病原体检测

Metagenomic Next-Generation Sequencing of Cerebrospinal Fluid for the Detection of Central Nervous System Pathogens

宏基因组高通量测序（mNGS）已成为临床和科研领域中用于无偏倚病原体检测和宿主转录谱分析的强大工具。尽管其在中枢神经系统（CNS）感染诊断中的价值日益受到认可，但由于脑脊液（CSF）样本中核酸含量低且易降解，给检测带来了独特挑战。本研究提出了一种针对CSF样本mNGS优化的、基于Illumina测序平台的研究性实验流程，涵盖样本处理、核酸提取、文库构建、测序及生物信息学分析全过程。同时提供了适用于高资源和低资源环境的质量控制方法，包括毛细管电泳的替代方案。本研究通过两个代表性队列验证了该流程的稳健性：一个是高测序深度、基于NovaSeq的工作流程，另一个是注重成本控制、基于NextSeq的工作流程。在这两个队列中，超过50%的病例检测到病原体，凸显了该方法即使在资源受限条件下的适应性仍具备显著的诊断潜力。该实验流程有助于实现可重复的CSF mNGS，为神经感染性疾病的研究与诊断提供了坚实的技术基础。

文库质量控制 
在完成 DNA/RNA 提取后，所测得的提取 DNA 浓度通常为 1–10 ng/µL。然而，提取 RNA 的浓度通常在 pg/µL 数量级，因此常无法通过分光光度计检测到。文库构建完成后，纯化并扩增的 cDNA 文库和 DNA 文库浓度通常分别为 0.5–10 ng/µL 和 10–30 ng/µL。图 2A 中的毛细管电泳及电泳图谱数据显示，该 cDNA 样本文库存在过度片段化现象，并含有接头二聚体。在进行文库混合与测序之前，应使用 0.8 倍磁珠与样本比例（0.8x magnetic bead-to-sample ratio）通过额外的磁珠纯化步骤去除接头二聚体。相比之下，图 2B 中的数据展示了一个质量较高的 cDNA 文库，无明显接头二聚体污染，可直接用于文库混合与测序。
<img alt="电泳凝胶结果；DNA 片段大小分布；图谱分...

本研究方案概述了脑脊液宏基因组高通量测序（mNGS）的优化工作流程。该方法针对低生物量样本特有的挑战进行改进，可在不同资源条件下实现可靠的病原体检测，为神经感染性疾病研究应用提供了通用的技术基础。

宏基因组高通量测序（mNGS）已成为一种强大的工具，可用于无偏倚的病原体检测和宿主转录谱分析……

本研究性方案旨在通过宏基因组下一代测序技术对脑脊液样本进行测序，以检测样本中可能存在的病原体。现有的宏基因组测序（MNGS）方案未充分考虑脑脊液中RNA含量较低的问题。本方案优化了多个步骤，以应对此类样本中生物量低的挑战。首先将脑脊液样本在冰上解冻，然后将每个样本的100微升转移至1.5毫升离心管中，加入1毫升溶液，于4°C下以16,000 G离心10分钟。随后小心吸走上清液，保留沉淀及100微升上清液。向剩余的100微升上清液和沉淀中加入100微升DNA/RNA保护液，并充分混匀。然后加入 600 µL DNA RNA 裂解缓冲液，通过移液操作混匀，直至溶液呈均一状态。按照试剂盒制造商提供的说明书进行 DNA 和 RNA 提取操作，但需进行以下重要修改：除最后的 DNA RNA 洗涤步骤需以最大速度离心 3 分钟外，其余所有离心步骤均以最大速度离心 1 分钟。为洗脱样品，将22 µL无核酸酶水直接加入到柱基质上。然后在室温下孵育3分钟。孵育结束后，用移液器将流出液重新加回到柱基质上，再次以最大速度离心1分钟，随后将样品转移至新的1.5 mL储存管中。在PCR管中加入RNA片段化和引物结合所需的组分。将PCR管放入热循环仪中孵育，加热盖温度设为105摄氏度。用移液器将片段化并结合了引物的RNA与八微升无核酸酶水和两微升第一链合成酶混合液混合。将试管放入PCR仪中孵育，加热盖温度设为105摄氏度。然后将第一链合成的DNA与48微升无核酸酶水混合，再加入8微升第二链合成反应缓冲液和4微升第二链合成酶混合液。将离心管放入热循环仪中，在16摄氏度下孵育1小时，加热盖设为关闭状态。接着，使用1.8倍比例的固相可逆固定化磁珠进行磁珠纯化。用53 µL无核酸酶水洗脱样本。将含有纯化双链cDNA的终上清液50微升转移至洁净的无核酸酶PCR管中。此时，样品可在-20摄氏度冷冻过夜。如果样品已在-20摄氏度保存过夜，则在继续操作前需置于冰上解冻。用移液器将50微升纯化的双链cDNA与7微升末端修复反应缓冲液以及3微升末端修复酶混合液混合。将样品置于热循环仪中，在20摄氏度孵育30分钟，随后在65摄氏度孵育30分钟，加热盖保持关闭状态。接下来，在冰上进行接头连接步骤，首先在无核酸酶水中对接头进行1:100稀释。将末端修复反应混合物用移液器转移至含有30微升连接反应主混合液、1微升连接增强剂和2.5微升稀释接头的离心管中。将样品放入热循环仪，于20摄氏度孵育15分钟，加热盖保持关闭状态。孵育结束后，立即使用0.9倍体积的固相可逆固定化磁珠进行磁珠纯化。然后用17微升无核酸酶水洗脱。将最终上清液的15微升转移至一个洁净的无核酸酶PCR管中。现在将纯化的接头连接的cDNA用移液器加入到一个含有3微升用户酶、25微升Q5预混液和10微升独特条形码引物的试管中。将试管放入热循环仪中，加热盖温度设为105摄氏度，并在所示条件下孵育。使用0.8倍比例的磁珠进行最终磁珠纯化。然后将样品洗脱至23微升无核酸酶水中。将20微升最终上清液转移至洁净的无核酸酶PCR管中。使用DNA定量试剂盒及相应的荧光计测定样品文库的浓度。验证水对照组的浓度显著低于其他样品或无法定量。使用自动化毛细管电泳仪检测样品文库的大小。利用开源的基于网络的平台 Chan Zuckerberg ID 进行宏基因组分析以检测病原体。登录 Chan Zuckerberg ID 并点击上传。选择宏基因组学作为分析类型，并从测序运行中选择输入的FASTQ文件。输入所需的样本信息，包括样本名称、样本类型脑脊液（CSF）以及核酸类型RNA或DNA。处理完成后，单击包含样本的项目文件夹，然后导航至摘要仪表板。向下滚动以查看每个样本的读段数量。检查通过质量控制过滤的读段百分比以及重复序列压缩比率，以评估是否存在PCR过度扩增导致的偏差。为确定项目文件夹中是否存在外源DNA污染，请选中每个水对照样本，然后点击“背景模型”以生成模型。分析过程中，应用该模型并使用阈值过滤器设定 NTZ 分值大于 1，以去除可能的污染物。然后使用适当的统计软件分析数据。毛细管电泳和电泳图谱数据显示，该 cDNA 样本文库过度片段化，并含有不适合测序的接头二聚体。无显著接头二聚体污染的 cDNA 文库已准备好进行文库合并与测序。脑脊液宏基因组高通量测序在 A 组和 B 组队列中检测到多种病原体，在 A 组样本中至少检测到一种病原体的比例为 73.5%，在 B 组样本中为 51.2%。一个关键挑战是由于操作体积较小，以及 B 干燥步骤对时间敏感，移液必须精确，干燥不足或过度均可能影响结果。尽管本特定方案侧重于病原体检测方面，但通过该方案生成的宿主RNA转录本也可用于其他下游分析。因此，未来的研究有必要将这种特定的文库制备和测序方案与专为稀疏样本设计的新兴方法进行性能比较，以评估其在病原体检测以及转录组学分析方面的表现。

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Research

科研

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医学

脑脊液的宏基因组次世代测序以检测中枢神经系统病原体

阿尔茨海默病（AD）的转基因（Tg）小鼠模型为研究疾病进展过程中人脑脊液（CSF）内Aβ或tau蛋白水平变化的机制和原因提供了极佳的机会。本文中，我们展示了一种改良的大脑池穿刺技术，用于对小鼠进行系列脑脊液取样。...

一种在小鼠中通过大池进行脑脊液连续采集的技术

离心样品以沉淀细胞碎片，并收集上清液。...

利用免疫分析法检测脑脊液中与年龄相关的神经发生标志物

我们描述了一种实时PCR方案，用于分析脑脊液（CSF）中的microRNA。除RNA提取步骤外，该方法可推广应用于从其他体液、培养细胞或组织样本中提取的RNA。...

利用定量实时聚合酶链式反应进行脑脊液微小RNA谱分析

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一种高通量、多重靶向蛋白质组学脑脊液检测方法，用于定量神经退行性生物标志物及载脂蛋白E亚型状态

本文介绍了一种对人脑脊液（CSF）中内源性肽进行质谱分析的方法。通过采用分子量截断过滤、色谱预分离、质谱分析以及后续多种肽段鉴定策略的组合，与以往研究相比，已知的脑脊液肽组规模几乎扩展了十倍。...

人脑脊液中内肽组学分析的样品制备

我们介绍一种流式细胞术方法，可同时鉴定从小鼠脑或脊髓中分离的不同细胞类型。该方法可用于在神经退行性疾病中分离或表征纯化的细胞群体，或用于定量评估在体内给予病毒载体或纳米颗粒后对细胞的靶向程度。...

通过不同匀浆方法从小鼠脑/脊髓中分离多种细胞类型的同步流式细胞术表征

脑脊液蛋白水平升高可能是血脑屏障改变后血浆蛋白扩散所致，也可能是鞘内合成的结果。本文介绍了一种优化的检测方案，有助于区分这两种情况，并提供对鞘内合成蛋白的定量测量。...

小鼠鞘内合成蛋白质的定量测量

体内，许多中枢神经系统疾病（如胶质母细胞瘤，GBM）所涉及的细胞间通讯极难进行测量和表征。本文介绍了脑部开放流动微透析（cOFM）的操作流程，该方法可用于在GBM的纵向动物模型中采集间质液成分。...

利用脑部开放流式微透析技术在胶质母细胞瘤动物模型中纵向采集间质液

脓毒症是指由微生物感染引发的全身性炎症反应综合征，可通过一种称为盲肠结扎穿刺（CLP）的手术技术进行模拟。本文介绍了一种利用CLP诱导的动物模型筛选具有治疗作用的药用植物的方法。...

利用脓毒症动物模型评价新型草药疗法

腹膜完整性丧失为理解和治疗轻度子宫内膜异位症女性的慢性盆腔痛提供了一种新范式，可在腹腔镜手术期间通过术中染料灌注轻松检测。...

术中检测微小子宫内膜异位症：一种针对腹膜完整性缺失相关盆腔疼痛检测与治疗的新范式

了解脑脊液宏基因组次世代测序的优化实验方案，该方案针对低核酸丰度和降解问题进行了专门改进，可在Illumina平台上实现稳健的中枢神经系统病原体检测，适用于高通量和低成本两种测序工作流程。

脑脊液宏基因组高通量测序用于中枢神经系统病原体检测

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