使用荧光示踪剂评估小鼠龈上皮屏障的功能性

这是一个标准化方案，用于定量评估龈上皮屏障完整性。该方案适用于研究屏障功能障碍疾病和测试牙龈屏障修复药物。首先，将雄性野生型C57BL/6J小鼠分为三组，包括未处理的对照组、连接诱发牙周炎组和牙龈卟啉引起的牙周炎组。

选择具有不重叠光谱的荧光示踪剂，如FITC标记的右旋糖酐和带标记的罗丹明B右糖酐。为稀释示踪剂，将FD40和RD70各1克混合于2%羧甲基纤维素凝胶中。将准备好的混合物放入冰块保存。

通过脚趾夹击反射确认麻醉深度后，使用口塞保持被麻醉小鼠口腔的开放。将预备好的示踪剂混合物局部涂抹在臼齿区的唇龈表面。将混合物留在原处30分钟，吞下后再重新涂抹。

敷示踪剂30分钟后，将老鼠固定在纸板上仰卧，并用胶带固定四肢以固定动物。接着，打开被安乐死小鼠的口腔，分离上颌骨。轻柔清除周围组织，并用PBS彻底冲洗标本。

将孤立的上颌骨放在玻璃玻片上。然后在样品两侧铺上塑形粘土，以稳定并固定覆盖套。请小心将剥离后的上颌骨放置在定制样品架上，以确保影像稳定位置。

使用配备25倍水浸物镜的立式单光子显微镜。聚焦于上颌骨下方的固定支撑区域并拍摄图像。选择上颌第二磨牙颊面的关注区域，并立即开始影像检查。

从牙龈表面开始，采集步长为一微米的Z叠栈图像，深度为100至200微米，进行三维重建。在软件中，点击“文件”并选择新文件夹，为数据集创建一个新文件夹并分配描述性名称。在采集标签页中，将XY格式设置为512×512，分辨率为0.99微米每像素。

然后把缩放因子设为1。接下来，将激发波长设置为488纳米和561纳米。将发射窗口分别配置为500至550纳米和570至620纳米。

对于Z系列和三维成像，选择ND采集模式。将Z步设为一微米，必要时调整。参数配置完成后，选择实时模式，以可视化单个和合并荧光通道中的牙龈区域。

然后点击立即运行开始图像采集。为了测量渗透率，将FD40和RD70的荧光强度分离到不同的通道中。合并Z轴切片时不做背景减法。

然后使用ImageJ软件量化荧光强度，以评估上皮屏障的渗透性。点击文件并选择打开，在ImageJ中打开上颌骨图像。然后点击图片，将图片类型更改为8位格式进行分析。

点击分析，选择集合测量。然后检查面积、平均值和积分密度，点击确定确认。然后选择想要的频道，通过点击图片、调整和阈值来调整阈值。

启用暗背景选项以考虑黑色背景。点击分析并选择集合测量。然后检查平均灰色值和限制到阈值，点击确定确认。

使用自由手绘选择工具，手动描摹牙龈组织侧荧光信号区域的轮廓。点击分析并选择测量值以获得荧光强度值，其中积分密度表示荧光强度。将测量结果复制到电子表格中进行计算和绘图。

计算电子表格中对照组的平均荧光强度。将每个实验组的荧光强度值除以对照组均值，得到相对荧光强度。对照组中，两种荧光示踪剂主要局限于牙龈表面。

在连接组和牙龈卟啉单胞胎组中，均观察到FD40和RD70显著渗入龈上皮。半定量分析显示，连接组和卟啉单胞菌组的FD40和RD70荧光强度均显著增加。3D成像显示，结扎组和牙龈卟啉单胞菌治疗组在牙龈血管周围的示踪剂荧光分布比对照组更广泛且弥漫。

该方案量化小鼠牙龈旁屏障的通透性和完整性。该方案可与微型CT结合进行多模态图像分析。进一步研究可以探索屏障修复药物及口腔疾病中的分子机制。