RNA关联染色质DNA-DNA相互作用方法
2026年4月30日
本文介绍了一种捕捉RNA相关染色质DNA-DNA相互作用的方案，用于绘制RNA相关三维基因组组织图谱。
我们开发了RNA相关染色质DNA-DNA相互作用法（RDD方法），用于绘制由特定RNA分子组织的染色质接触图。RDD能够强有力地绘制RNA特异性染色质带带及跨内源性和外源RNA的远程相互作用。首先，将果蝇S2双联细胞衍生的渗透核颗粒重新悬浮于15毫升含Triton X-100的0.1%FA裂解缓冲液中。
将1.5毫升的核悬浮液注入14毫升圆底试管，同时避免气泡形成。以38%幅度对悬浮进行超声处理，持续4.5分钟，使用30秒开启和30秒关闭的循环。将超声处理的染色质收集到15毫升管中，在室温下以3,200克离心20分钟。
将约13毫升的上清液转移到新的15毫升管上。现在，将100微升已准备好的链亲亲和素C1珠加入含有超声染色质的管子，并在室温下旋转20分钟。然后，将管子放在磁性架上，停留一分钟，将含有预先清除的染色质的上清液转移到新的50毫升管中。
将10微升分量存放于零下20摄氏度进行分析。在室温下，将26毫升新鲜制备的杂交缓冲液与13毫升预先清除的染色质一起在旋转器上孵育30分钟。接着，将杂交混合物分成三根15毫升的管子，并在每个样品中加入6微升100微摩尔生物素化探针。
用胶片封住管盖后，晚上以37摄氏度旋转管子。阻断链亲和芬C1珠后，移除阻断缓冲液，将珠子重新悬浮于400微升杂交缓冲液中。现在，将阻断缓冲处理的链甲亲和素C1珠加入先前制备的对应杂交染色质中。
将混合物在室温下旋转2.5小时。丢弃上清液并将珠子转移到1.5毫升管中后，先用800微升洗涤液清洗珠子五次，再用TE缓冲液洗两次。最终清洗后，丢弃上清液，并将珠子重新悬浮在1000微升含1X蛋白酶抑制剂的TE缓冲液中，室温下使用。
对于阻断结合在探针染色质复合体上的链亲和素C1珠上未占位点，向探针染色质复合物中加入220微升变性IPB珠子，并在室温下旋转管子15分钟。孵育后，使用TE缓冲液洗涤链氨亲定C1珠五次。接着，向链霉亲和素C1珠子上的染色质中加入693微升末端修复混合物，充分混合。
然后加入七微升T4 DNA聚合酶。将混合物放入热混合器中，以每分钟800转、12摄氏度的温度孵育30分钟。然后将样品放入搅拌机上，温度为16摄氏度，孵育15分钟。
用800微升冰冷的ChIA-PET缓冲液清洗珠子三次，然后用TE缓冲液洗一次。然后，向链霉亲和素C1珠上的染色质中加入693微升A尾混合液，充分混合。接着，加入7微升Klenow片段，3级引级到5级外切酶减去。
将管子以每分钟12转、37摄氏度的混合器孵育50分钟。用800微升冰冷的ChIA-PET缓冲液清洗三次，然后用轻柔移液洗一次洗脱缓冲液。现在，将1,390微升近接连接混合物加入链霉亲和素C1珠上的染色质，并在室温搅拌机中培养五分钟。
加入10微升T4 DNA连接酶，在室温下以每分钟20转的速度旋转培养五分钟，然后在室温下转为每分钟12转，持续50分钟，并在16摄氏度继续过夜。接着，用800微升冰冷的ChIA-PET缓冲液清洗三次，再用TE缓冲液清洗两次。释放染色质时，向链霉亲生C1珠上的染色质加入480微升LC ChIP洗脱缓冲液，并充分混合。
加入20微升每毫升20毫克蛋白酶K以实现去联。将试管以每分钟950转、65摄氏度的热混合器孵育一夜，然后用酚：氯仿：异戊醇试剂纯化近接DNA。将Tn5标记测试所需的所有成分加入冰上PCR管中，总反应体积为50微升。
在55摄氏度下，将标记反应在热循环器中孵育10分钟，盖子设为70摄氏度，然后保持在4摄氏度。在标记的DNA中加入50微升ChIP洗脱缓冲液和1微升蛋白酶K。将溶液混合后，在65摄氏度、每分钟900转的热混合器上孵育30分钟。
使用DNA纯化试剂盒进行DNA纯化，并使用自动毛细管电泳系统定量DNA。将所有断片连接的DNA加入预先用阻断缓冲液和基因组DNA封闭的M280珠中，混合悬浮液。在室温下将管子在搅拌机上旋转45分钟。
短暂旋转后，将管子放在磁性架上，丢弃上清液。洗涤步骤后，在不混合的情况下向珠子中加入30微升的洗脱缓冲液。按照DNA库的制备套件准备PCR混合物。
将PCR管转移到PCR机器并设置扩增程序。最后，在用磁珠纯化PCR产物后，使用核酸定量器测量10至30纳克的文库DNA，以准备测序样品。超声染色质片段约为1000至3000碱基对，表明成功断裂。
RNA相关染色质的片段大小范围约为1000到3000碱基对。用Tn5标记的染色质显示出显示出显示染色质标记效率的片段分布。扩增后的测序文库显示出约180到1,000碱基对的片段大小分布。
在选定尺寸后，测序文库片段主要在约250至600碱基对范围内富集。RNA关联染色质DNA-DNA相互作用（RDD方法）检测了NC RNA roX2和7SK结合的基因组位置，以及相应的远程染色质相互作用环路。RNA聚合酶II ChIA-PET的数据显示，这些NC RNA与基因表达之间存在明确的调控关系，峰值表明相互作用强度。
通过整合RDD锚定的相互作用与Hi-C全基因组染色质构象图谱及表观基因组标记、新生转录以及RNA聚合酶II的ChIA-PET数据，实现了多维分析。在这些区域，拓扑结合的结构域被清晰可见，RNA引导的染色质环常位于其边界或跨越多个此类结构域。此外，还确定了以RNA为中心的调控枢纽。
RDD方法及锚定染色质相互作用揭示了RNA结合位点及三维基因组组织中的相关DNA-DNA相互作用。关键教义是在聚合酶连接前，保持正确的探针、连接蛋白和染色质比值，并用天然生物素阻断未受限链霉亲和素位点。未来的研究可以探索RNA如何动态地绕线染色质相互作用，跨越发育、扰动和感染。
概述
RNA相关染色质DNA-DNA相互作用方法（RDD）是一种靶向性方法，用于绘制由特定RNA锚定的染色质相互作用图谱。该技术能够同时鉴定与目标RNA相关的基因组位点，并解析这些位点之间的长程DNA-DNA相互作用，从而为基因组空间结构和调控机制提供深入见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因组学
- 表观遗传学
- 分子生物学
背景
- 染色质相互作用在基因调控和基因组结构中起着关键作用。
- 包括编码和非编码类型的RNA能够组织染色质并影响基因表达。
- 现有方法通常缺乏特异性地绘制由RNA锚定的染色质相互作用的能力。
- 理解RNA介导的染色质组织对于解析调控网络至关重要。
研究目的
- 建立一种稳健的方法，用于绘制由特定RNA锚定的染色质相互作用图谱。
- 实现对RNA相关基因组位点及其空间接触的高分辨率鉴定。
- 促进对RNA介导的增强子-启动子配对及远距离基因调控的研究。
使用的方法
- 使用与靶标 RNA 互补的生物素化反义探针，富集 RNA-染色质复合物。
- 细胞交联、染色质片段化及末端修复。
- 利用设计的连接子对捕获复合物内空间邻近的 DNA 片段进行邻近连接。
- 连接产物的纯化、测序文库构建及高通量测序。
- 生物信息学分析以生成 RNA 锚定的染色质相互作用图谱。
主要结果
- RDD 能够实现以 RNA 为锚点的位点特异性、高分辨率染色质互作图谱绘制。
- 该方法适用于内源性和外源性 RNA，包括来自病毒和微生物的 RNA。
- RDD 与多种细胞类型和实验条件兼容。
- 该实验流程稳健且可重复，可生成详细的互作图谱，用于调控机制研究。
结论
- RDD 提供了一种强大的工具，用于解析与调控性 RNA 相关的三维基因组结构。
- 该方法有助于深入理解 RNA 如何组织染色质并调控基因表达。
- RDD 可广泛应用于增强子-启动子相互作用及基因组长距离调控的研究。
常见问题
行业重要性概述
RNA相关染色质DNA-DNA相互作用方法（RDD）使生物制药研发团队能够绘制由特定RNA锚定的染色质相互作用图谱，从而提供对调控性基因组结构的高分辨率洞察。该技术可在早期发现和临床前关键节点支持作用机制的去风险化及靶点验证，尤其适用于RNA介导的调控通路。RDD与多种细胞类型以及内源性和外源性RNA均兼容，因而适用于复杂的疾病模型和宿主-病原体研究，具有广泛的项目应用价值。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够研究RNA介导的调控机制和基因组的空间结构。
- 通过绘制与RNA相关的染色质相互作用图谱，支持功能靶点的验证。
- 有助于降低针对RNA及染色质修饰靶点的机制性风险。
- 提供位点特异性数据，以提升靶点选择的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 为下游筛选工作流程制备经过验证的染色质相互作用图谱。
- 提供可重复的定量接触谱型，用于实验标准化。
- 支持在编码和非编码RNA靶标间跨平台重复使用。
- 支持对影响RNA-染色质相互作用的化合物进行可靠评估。
转化与临床前研究
- 通过在多种细胞类型中绘制调控性RNA相互作用图谱，与疾病相关系统保持一致。
- 从RNA介导通路的发现到临床前验证提供连续性支持。
- 实现对RNA靶向治疗药物的风险调整型推进决策。
- 通过高分辨率染色质接触谱分析支持生物标志物的鉴定。
流程与工作流整合
RDD 融入从早期机制研究到临床前模型验证的整个发现过程，支持靶点识别和转化研究。
- 发现生物学：揭示RNA锚定的染色质相互作用，以阐明调控通路并降低生物学假设的风险。
- 筛选：提供定量、可重复的接触图谱，用于检测方法开发和化合物筛选。
- 分析：生成高分辨率测序数据，用于在不同条件下对染色质接触进行比较分析。
- 转化研究：可在原代或模型系统中绘制与疾病相关的RNA相互作用图谱。
- 企业级应用：提供一种稳健且可灵活调整的工作流程，适用于多种RNA与染色质研究应用。
运营与企业影响
- 科学价值：提高RNA介导调控的预测置信度，并减少机制上的模糊性。
- 操作价值：提供标准化、可扩展且可重复的染色质相互作用图谱绘制。
- 战略价值：通过早期阐明调控机制，优化决策流程并提升资本使用效率。
- 项目组合影响：支持对RNA及染色质修饰靶点进行基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备染色质生物学、RNA 生物化学和高通量测序方面的专业知识。
- 需要具备高通量测序和生物信息学分析平台的支持。
- 要求跨团队在探针设计和数据分析方面实现标准化。
- 通过优化实验方案，可适用于多种细胞类型和实验条件。
- 结果的分辨率和可重复性依赖于探针的特异性和测序深度。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:25
Chromatin Fragmentation and Preclearing with Streptavidin C1 Beads
1:51
Chromatin-RNA Probe Hybridization and Immobilization on Streptavidin C1 Beads
3:42
On-Bead Chromatin End-Repair and A-Tailing
4:59
Chromatin Proximity Ligation and Release from the Streptavidin C1 Beads
6:22
Tn5 Tagmentation of Proximity-Ligated DNA
7:19
Immobilization and PCR Amplification of Ligated DNA on M280 Beads
8:23
Results
10:18
Conclusion
