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本工作得到国家自然科学基金（82222038 和 81970259）、国防生物技术优秀青年人才项目（2023-JCJQ-ZQ-001 和 01-SWKJYCJJ06）以及重庆市杰出青年科学基金（CSTB2022NSCQ-JQX0017）的资助。

本文所描述的所有实验程序均经第三军医大学动物福利与伦理委员会批准（SCXK(PLA)20120031）。
1. 实验动物
<ol>
	<li>使用C57BL/6小鼠，雄性，8–10周龄，体重23–28 g（动物许可证号：SCXK (湘) 2019-0004）。将小鼠饲养于特定病原体阴性（SPF）环境中，自由摄食和饮水。饲养条件如下：室温（24 ± 2ºC），湿度50%–55%，光照-黑暗周期为12 h/12 h。</li>
</ol>
2. 细菌制备
<ol>
	<li>选用合适的菌株。此处使用Klebsiella pneumoniae美国典型培养物保藏中心（ATCC）菌株43816。</li>
	<li>准备适当的培养基（LB肉汤培养基）。</li>
	<li>准备用于接种的细菌。
	<ol>
		<li>挑取单个菌落接种于5 mL LB肉汤培养基中，在37 °C、220 rpm条件下振荡培养过夜（12 h）。</li>
		<li>将过夜培养的细菌转接到新鲜LB肉汤培养基中，继续培养3–4 h，直至达到高密度生长期（600 nm处的光密度[OD600] ≈ 0.8）。</li>
		<li>将细菌溶液稀释后，取100 µL加入含有固体培养基的培养皿底部，置于37 °C培养箱中培养12 h，计数菌落数量，获得浓度为2 × 109 CFU/mL的KP菌液，即OD600 ≈ 0.8。</li>
		<li>用0.9% NaCl溶液调节细菌浓度。配制浓度分别为1 × 108 CFU/mL、1 × 106 CFU/mL和1 × 104 CFU/mL的三种细菌悬液，供后续实验使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 鼻腔滴注感染（图1）
<ol>
	<li>通过腹腔注射 2% 戊巴比妥钠，剂量为 40 mg/kg，对小鼠进行麻醉（图 1A，B）。</li>
	<li>当小鼠意识减弱但仍保留吞咽反射时，用微量移液器吸取 50 µL 细菌悬液（或以 0.9% NaCl 溶液作为对照）。</li>
	<li>用拇指轻压小鼠颈部前方，其余手指轻轻握住小鼠身体，固定其颈部。将小鼠头部向后倾斜（图 1C）。</li>
	<li>使用移液器将细菌悬液缓慢滴入小鼠鼻孔（每滴约 5–10 µL），每次向一个鼻孔滴加一滴（图 1D）。</li>
	<li>观察到小鼠吸入悬液后，迅速将小鼠向上提起，再缓慢放下，以促进悬液进入支气管（图 1E，F）。</li>
	<li>换另一侧鼻孔重复操作。交替向两侧鼻孔滴加，每次 5–10&#160;µL&#160;，直至总共吸入 50&#160;µL。</li>
	<li>若小鼠在操作过程中出现咳嗽、叹气或无法吸入细菌溶液的情况，应让小鼠休息并观察。待情况稳定后继续吸入步骤，确保小鼠完全吸入全部细菌溶液（或 0.9% NaCl 溶液）。</li>
	<li>将小鼠固定于倾斜 60° 的小鼠板上，保持仰卧位，直至意识恢复。提供辅助热源以促进麻醉复苏；持续监测动物状态，防止过热。小鼠苏醒后，将其放回&#160; 返回饲养笼，保持适宜温度，并提供充足饮水和食物。</li>
</ol>
4. 模型评估
注意：通过上述鼻内滴注方法建立四组小鼠模型，分别为对照组（A组，滴注PBS）、1 × 104 KP浓度组（B组）、1 × 106&#160;KP浓度组（C组）和1 × 108 KP浓度组（D组）。小鼠通过腹腔注射2%戊巴比妥钠（60 mg/kg）进行深度麻醉。在进行终末期心脏穿刺取血以评估模型之前，需通过翻正反射消失、夹趾无回缩反应及肌肉松弛等指标确认麻醉深度充分。采血后立即行颈椎脱位确认死亡。模型评估采用以下方法：
<ol>
	<li>评估12小时炎症指标。
	<ol>
		<li>在鼻内滴注KP后12小时，采集血液（≥ 300 &#181;L) 通过心脏穿刺采集（每组 n = 5）。通过离心分离血清（1000 &#215; 克10 分钟）并用于细胞因子白细胞介素-6（IL-6）的检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>24小时器官损伤评估
	<ol>
		<li>在鼻内滴注KP 24小时后，采集血液（≥300 &#181;L通过心脏穿刺采集血清（每组 n = 5），用于生化指标检测。其中，丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）用于评估肝损伤，肌酸激酶（CK）用于评估肌肉损伤，血尿素氮（BUN）用于评估肾损伤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>症状评估
	<ol>
		<li>每日监测小鼠体重，并观察其毛发状况、活动水平及其他相关指标。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>7天细胞因子与免疫细胞
	<ol>
		<li>建模后第7天（n = 10 [A/B]，n = 15 [C]，n = 40 [D]），通过心脏穿刺采集血液，用于流式细胞术分析，以评估淋巴细胞百分比、单核细胞中主要组织相容性复合体II类分子（MHC-II）的表达比例、IL-10和TGF-β的平均荧光强度（MFI）&#946;1 在 CD4 中+ T细胞</li>
		<li>组织处理
		<ol>
			<li>混合血液样本（100 &#181;L) 加入红细胞裂解缓冲液（300 &#181;L) 按照体积比1:3混合。室温下溶血15分钟后，将混合物在400 × g离心 &#215; g 5 分钟后，弃去上清液。</li>
			<li>将沉淀重悬于 200 &#181;L 加入红细胞裂解缓冲液（体积比 = 1:2），孵育10分钟以进行二次裂解。</li>
			<li>再次以400离心后 &#215; g 5 分钟后，弃上清，将沉淀重悬于 100 &#181;L 细胞染色缓冲液</li>
			<li>添加 1 &#181;L 每份流式细胞术抗体加入样品中。简言之，加入CD45用于淋巴细胞染色；加入CD45、CD116、Ly6G、Ly6C和MHC-II抗体用于MHC-II检测；加入CD45、CD3、CD4、CD8和CD25抗体用于IL-10和TGF-β的检测。&#946;1. 上述每种抗体的稀释比例均为1:100。</li>
			<li>将所有样品孵育于 4 &#176;C 在避光条件下孵育30分钟。随后加入1 mL细胞染色缓冲液，然后在400 × g离心 &#215; 离心5分钟，弃上清。</li>
			<li>用于检测淋巴细胞和MHC-II时，重悬于 400 &#181;L 流式细胞术分析前的细胞染色缓冲液</li>
			<li>随后，进行IL‑10和TGF‑的检测操作。&#946;1 按照步骤 4.4.2.8–4.4.2.12 进行：</li>
			<li>加入1 mL固定缓冲液，于4℃孵育样品&#186;在黑暗中于 C 孵育 60 分钟。</li>
			<li>加入1 mL破膜缓冲液后，将混合物在400 × g下离心 &#215; g 5 分钟后，弃去上清液。</li>
			<li>将细胞沉淀重悬于 100 &#181;L 缓冲液，随后加入 1 &#181;L Foxp3、IL-10 和 TGF-&#946;1 抗体。将样品在 4 &#176;C 在避光条件下孵育30分钟。</li>
			<li>接下来，加入 1 mL 破膜缓冲液，于 400 × g 离心 &#215; g 5 分钟后去除上清液。</li>
			<li>最后，将细胞重悬于 400 &#181;L 加入细胞染色缓冲液，通过流式细胞术检测。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>门控策略
		<ol>
			<li>通过FSC-A/FSC-H图排除碎片和双联体以检测淋巴细胞。将CD45阳性细胞鉴定为总白细胞。&#8314; 事件。根据 CD45 阳性细胞中较低的 FSC/SSC 对淋巴细胞进行设门&#8314; 群体</li>
			<li>为了检测MHC-II，首先在FSC-A/SSC-A上圈选白细胞以排除碎片，随后选择CD45&#8314; 细胞。将髓系细胞鉴定为 CD11b&#8314;，通过Ly6G阴性排除中性粒细胞。将经典单核细胞定义为Ly6G&#8315; Ly6Chi 细胞，并检测该群体内 MHC-II 的表达情况。</li>
			<li>检测 IL-10 和 TGF-&#946;1. 通过FSC-A/SSC-A和FSC-A/FSC-H排除碎片和双联体，以CD45鉴定总T细胞&#8314;CD3&#8314; 事件。在 CD4&#8314;CD8&#8315; 群体，将Treg识别为CD25&#8314;FOXP3&#8314; 细胞。定量TGF-&#946;&#8314; Treg 细胞亚群中的细胞，并检测所有 CD4 细胞中 IL-10 的表达&#8314; T细胞。使用FMO对照设置所有阳性门。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>继发感染后24小时支气管肺泡灌洗液（BALF）中的细菌计数
	<ol>
		<li>造模后第7天（n = 5 [A/B]，n = 10 [C]，n = 40 [D]），对小鼠进行鼻内灌注 50 &#181;L 的 铜绿假单胞菌 （PA）（浓度为6.8） &#215; 1010 CFU/mL）使用上述鼻内滴注方法。</li>
		<li>继发铜绿假单胞菌（PA）感染后24 h，收集1.5 mL支气管肺泡灌洗液（BALF）。将BALF进行系列稀释，接种于LB液体培养基中，并置于恒温培养箱中培养 37 &#176;C 在菌落计数前培养24小时。</li>
		<li>按照以下步骤进行支气管肺泡灌洗液（BALF）的采集。
		<ol>
			<li>以人道方式处死小鼠（150 mg/kg 2% 戊巴比妥钠），然后将其仰卧放置，颈部过度伸展。</li>
			<li>沿颈部正中线做切口以暴露气管。将一根钝头24G导管插入气管，至略超过气管隆突处，并用缝线固定。</li>
			<li>通过气管插管向肺部注入0.5 mL无菌的冰冷PBS。轻柔抽吸3–5次，回收液体，并重复此灌洗步骤3次，总体积约为1.5 mL。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生存分析
	<ol>
		<li>为生存分析使用单独的小鼠队列（n = 10 [A/B/C]，n = 40 [D]）。</li>
		<li>记录感染后7天内小鼠的存活状态。</li>
		<li>在继发性铜绿假单胞菌（PA）感染后，观察小鼠从第7天到第14天的死亡率。</li>
		<li>观察后，使用异氟烷（5%）对小鼠进行深度麻醉；通过翻正反射和足趾夹捏反射消失、呼吸规律及肌肉松弛确认麻醉深度，随后经腹腔注射过量戊巴比妥钠（150 mg/kg）实施安乐死，并通过颈椎脱位确认死亡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>统计分析
	<ol>
		<li>对定量数据进行正态性检验和方差齐性检验。</li>
		<li>对于组间比较，若数据呈正态分布且方差齐性，采用单因素方差分析（ANOVA）；否则，采用非参数检验。</li>
		<li>使用Kaplan-Meier法进行生存分析。采用混合效应模型检验不同时间点各组间体重变化的差异。将p值≤0.05视为具有统计学显著性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Van Vught, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence%2C+risk+factors%2C+and+attributable+mortality+of+secondary+infections+in+the+intensive+care+unit+after+admission+for+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Incidence, risk factors, and attributable mortality of secondary infections in the intensive care unit after admission for sepsis.</a> JAMA. 315 (14), 1469-1479 (2016).</li>
<li>Jones-Nelson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neutrophilic+response+to+Pseudomonas+damages+the+airway+barrier%2C+promoting+infection+by+Klebsiella+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The neutrophilic response to Pseudomonas damages the airway barrier, promoting infection by Klebsiella pneumoniae.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 59 (6), 745-756 (2018).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

脓毒症是一种复杂的临床综合征，其晚期特征性的免疫抑制状态是导致患者死亡的关键因素12,13。因此，能够准确模拟脓毒症诱导免疫抑制病理生理过程的临床前模型，对于深入探究其机制以及开发新的治疗方法至关重要。在本研究中，我们成功建立并验证了一种通过鼻内滴注肺炎克雷伯菌（KP）诱导的小鼠脓毒症模型，该模型的核心特征是能够稳定地复制出与临床高度相关的免疫抑制状态。
为确保模型的可靠性和可重复性，我们在建立过程中采用了一系列标准化设计。标准高毒力菌株 肺炎克雷伯菌 ATCC 43816 (KPPR1)14,15 选择了该菌株用于本实验方案。该菌株的毒力特征已得到充分验证，能够稳定诱导感染相关的病理改变，为模型的可重复性奠定了基础。鼻腔滴注的标准化操作设计是确保感染途径一致性的核心。针对操作过程中可能出现的咳嗽或类似叹气样呼吸等潜在问题，我们建立...

脓毒症是由宿主对感染产生异常反应所导致的危及生命的器官功能障碍1,2,3。它是重症监护病房（ICU）患者死亡的主要原因之一。全球每年有4890万例脓毒症病例，相关死亡人数达1100万4。尽管抗感染治疗和器官支持技术近年来取得了进展，但脓毒症的发病机制仍未完全阐明，且缺乏特异性治疗手段。因此，脓毒症已成为临床医学研究的重点与挑战之一4。
动物模型在基础医学和转化医学研究中发挥着不可替代的作用，是研究脓毒症发病机制和评估新型治疗策略的重要工具。通过模拟人类脓毒症的病理生理过程，这些模型不仅有助于探索免疫紊乱和器官功能障碍等关键机制，还为药物筛选和干预策略的开发提供了实验平台。在众多动物模型中，小鼠因其明确的遗传背景、丰富的免疫系统研究基础以及易于操作的特点，成为脓毒症研究中最常用的动物模型。
目前，已有多种基于不同范式的脓毒症动物模型，包括内毒素模型、细菌输注模型、盲肠结扎穿刺（CLP）模型以及升结肠支架腹膜炎（CASP）模型5。然而，这些模型缺乏自然感染途径，难以真实反映临床感染过程。研究表明，肺炎是美国脓毒症的主要病因6。因此，建立一种能够模拟自然感染途径、具有免疫抑制特征、操作简便且可重复性高的小鼠脓毒症模型，对于深入研究脓毒症的免疫机制以及评估潜在干预策略具有重要意义。
Klebsiella pneumoniae （KP）占所有医院获得性细菌感染的3%至8%7,8,9。该细菌可通过多种途径进入人体，包括呼吸道、胃肠道、泌尿道以及皮肤；由KP引起的感染预后较差，尤其是在免疫功能低下患者中更为显著7,10。鉴于肺炎是脓毒症（sepsis）的主要病因，而KP是一种与不良预后相关的常见呼吸道病原体，因此KP是建立具有临床相关性的脓毒症模型的理想候选菌种。
尽管此前已建立多种包括经鼻感染在内的肺炎克雷伯菌（KP）动物模型11，但仅有少数研究致力于优化模型以诱导脓毒症相关免疫抑制，或确定建模所需的最佳KP浓度。这一空白限制了现有KP模型在研究脓毒症所致免疫功能障碍中的应用。
为满足这一需求，我们通过鼻内滴注肺炎克雷伯菌（KP）建立了小鼠脓毒症诱导的免疫抑制模型。与现有模型相比，该模型模拟了呼吸道感染的自然途径，并进一步验证了其有效性，为后续研究提供了方法学基础。

<table><tbody><tr><td>生化培养箱</td><td>YSEI</td><td>SHH-150L</td><td>细菌培养</td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>Vital River Laboratories</td><td>8-10 周龄，雄性</td><td></td></tr><tr><td>CD116b</td><td>BioLegend</td><td>101257</td><td>流式抗体（抗小鼠）</td></tr><tr><td>CD25</td><td>BD bioscience</td><td>740447</td><td>流式抗体（抗小鼠）</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BioLegend</td><td>100203</td><td>流式抗体（抗小鼠）</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BioLegend</td><td>100544</td><td>流式抗体（抗小鼠）</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BioLegend</td><td>103116</td><td>流式抗体（抗小鼠）</td></tr><tr><td>CD8</td><td>BioLegend</td><td>100752</td><td>流式抗体（抗小鼠）</td></tr><tr><td>细胞染色缓冲液&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>恒温摇床</td><td>Honour</td><td>HNY-100B</td><td>细菌培养</td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>Beckman Coulter</td><td>CytoFLEX</td><td>流式细胞术分析</td></tr><tr><td>高速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>AIIEGRA</td><td></td></tr><tr><td>IDEXX catalyst one</td><td>IDEXX</td><td>Catalyst One</td><td>生化分析</td></tr><tr><td>IL-10</td><td>BioLegend</td><td>505026</td><td>流式抗体（抗小鼠）</td></tr><tr><td>胰岛素注射器&amp;nbsp;</td><td>WEGO</td><td>1mL</td><td>采血</td></tr><tr><td>肺炎克雷伯菌 ATCC 43816</td><td>biobw.org</td><td>bio-81659</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基（粉末）</td><td>Solarbio</td><td>L1010</td><td>LB 液体培养基</td></tr><tr><td>LB 培养基（粉末）</td><td>Solarbio</td><td>L1015</td><td>LB 琼脂平板</td></tr><tr><td>LY6C</td><td>BioLegend</td><td>128010</td><td>流式抗体（抗小鼠）</td></tr><tr><td>Ly6G</td><td>BioLegend</td><td>127606</td><td>流式抗体（抗小鼠）</td></tr><tr><td>MHC-II</td><td>BioLegend</td><td>107622</td><td>流式抗体（抗小鼠）</td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>Eppendorf</td><td>P100</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>Solarbio</td><td>R1010</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf6131</td><td>光密度测定</td></tr><tr><td>统计分析软件</td><td>GraphPad Software</td><td>Graphpad Prism10.0</td><td></td></tr><tr><td>无菌无酶移液器吸头</td><td>Biosharp</td><td>200&amp;mu;L</td><td></td></tr><tr><td>TF 稀释缓冲液</td><td>BD Pharmingen</td><td>51-90008101</td><td></td></tr><tr><td>TF 固定/透化缓冲液</td><td>BD Pharmingen</td><td>51-90008100</td><td></td></tr><tr><td>TF 透化/洗涤缓冲液</td><td>BD Pharmingen</td><td>51-90008102</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&amp;beta;1</td><td>BioLegend</td><td>141406</td><td>流式抗体（抗小鼠）</td></tr><tr><td>Varioskan LUX 多功能微孔板读板仪</td><td>Thermo Scientific</td><td>Varioskan LUX&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

通过鼻内滴注细菌建立小鼠脓毒症诱导的免疫抑制模型

Establishment of A Mouse Sepsis-Induced Immunosuppression Model By Intranasal Instillation of Bacteria

脓毒症是由宿主对感染产生异常反应所导致的危及生命的器官功能障碍。肺炎是引发脓毒症的主要原因。动物模型是研究脓毒症发病机制和评估新治疗策略的重要工具。既往的脓毒症动物模型缺乏自然感染途径，难以准确模拟临床感染过程。
本研究通过鼻内滴注Klebsiella pneumoniae（KP）建立小鼠脓毒症免疫抑制模型，以模拟自然呼吸道感染途径。使用不同浓度KP建模后，在12小时检测细胞因子白细胞介素-6（IL-6）水平以评估炎症反应，在24小时检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、肌酸激酶（CK）和血尿素氮（BUN）水平以评估器官损伤。建模后7天分析模型的生存率。通过检测淋巴细胞和白细胞百分比、单核细胞中主要组织相容性复合体II类（MHC-II）的表达比例，以及CD4+ T细胞中IL-10和TGF-β1的平均荧光强度（MFI），评估小鼠的免疫抑制状态。建模7天后，通过鼻内滴注铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, PA）进行二次感染。在二次感染后24小时检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中的细菌载量，并在14天内评估死亡率，以进一步评价模型的免疫抑制程度。
通过鼻腔接种高浓度的Klebsiella pneumoniae可有效诱导免疫抑制。其目的是模拟由自然呼吸道感染途径引发的脓毒症，并为动物脓毒症研究提供标准模型。

鼻腔滴注后12小时，1 × 108 KP组小鼠血清IL-6水平显著升高（p &#60; 0.0001，n = 5）（图2A）。鼻腔滴注后24小时，1 × 108 KP组小鼠血清ALT（p &#60; 0.01，n = 5）（图2B）、AST（p &#60; 0.01，n = 5）（图2C）、CK（p &#60; 0.01，n = 5）（图2D）和BUN（p &#60; 0.001，n = 5）（图2E）水平均高于对照组。1 × 106 KP组和1 × 108 KP组小鼠在第1至第3天出现眼睑闭合、眶周分泌物增多、寒战以及对外界刺激反应性降低的表现。此外，小鼠倾向于聚集成团，活动量减少。鼻腔滴注KP后第三天，两组小鼠的体重均显著下降（p &#60; 0.00...

在此，我们介绍一种通过鼻内滴注建立小鼠脓毒症免疫抑制模型的实验方案 肺炎克雷伯菌 并通过多种指标验证了该模型。

脓毒症是由宿主对感染的异常反应所导致的危及生命的器官功能障碍。肺炎是脓毒症的主要病因。动物……

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免疫学与感染

通过鼻腔注射细菌建立小鼠败血症诱导免疫抑制模型

我们通过气管途径，展示了一种将待测物质非手术递送至麻醉小鼠肺部的方法。该方法可使肺部暴露于细菌和病毒病原体、细胞因子、抗体、微珠、化学物质或染料中。我们进一步描述了肺组织及肺引流淋巴结（LDLNs）的采集与处理，以用于流式细胞术分析。...

小鼠非手术气管内灌注及通过流式细胞术分析肺组织和肺引流淋巴结

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病毒侵染细胞后细菌与真菌生物膜形成起始的测定

本方案概述了使用临床相关且遗传上易于操作的菌株 R20291 建立头孢哌酮诱导的小鼠Clostridium difficile感染（CDI）模型的方法。该方案详细描述了在小鼠模型中对临床疾病监测、C.

经头孢哌酮处理的临床相关小鼠模型 艰难梭菌 菌株 R20291

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建立双人源化TK-NOG小鼠模型用于研究HIV相关性肝病发病机制

本文介绍了一种有效的方法，用于研究经尾静脉输注来源于C57BL/6小鼠脐带全长的人类间充质基质细胞在博来霉素经气管注射诱导肺损伤后所表现出的抗纤维化活性。该方案可轻松扩展应用于其他治疗药物的临床前测试。...

经气管注射博来霉素诱导小鼠肺损伤

Army Medical University.  本文介绍了通过鼻腔注射克雷伯菌肺炎（ Klebsiella pneumoniae ）建立小鼠败血症免疫抑制模型的方案，并通过多种指标验证了该模型。

通过鼻内滴注细菌建立小鼠脓毒症诱导的免疫抑制模型

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