超分辨率成像与共享管理：一种用于多通道检测共聚焦显微镜的实验方案

我们的研究致力于开发可及的超分辨率成像方法，以可视化动态的亚细胞结构，突破传统显微镜的衍射极限。超分辨率方法面临光毒性、操作复杂和需要特殊制备等问题。本方案通过基于共聚焦的多重检测技术，降低了这些技术门槛。

首先，打开显微镜主机、激光发射模块、LED 光源和控制计算机的电源。启动显微镜操作软件。在主界面中选择 GFP，然后关闭反射光。

进入采集面板。从物镜下拉菜单中选择合适的物镜。进行活细胞成像时，成像前 45 至 60 分钟，启动环境培养室和主动聚焦稳定系统。

系统稳定后，使用培养箱传感器验证其稳定性。在物镜前端透镜上滴加浸油，注意避免产生气泡。将制备好的样品置于显微镜载物台上。

小心地抬起，直到盖玻片接触到浸油。接下来，打开采集软件。转到采集选项卡，选择创建新实验。

现在，为所用的荧光染料添加成像通道。对于每个通道，将共聚焦针孔直径设置为一个空气单位。为优化激光功率，选择第一个通道并切换到实时扫描模式。

将初始激光功率设为较低值，然后将检测器增益调节至其线性范围内的中等水平。随后逐步增加激光功率，直至目标结构在实时图像中明显高于背景并清晰可见。使用软件中的奈奎斯特采样按钮设置像素大小，以自动计算该参数。

接下来，设置像素时间。然后选择轨道间的逐帧扫描模式，以尽量减少串扰。单击“拍摄”以获取单幅图像。

保存带有相关元数据的图像。为确保光学切片间设置的一致性，在定义Z-stack之前，需确认所有成像参数已在单一最优焦平面上配置完毕。打开采集选项卡并选择Z-stack模式。

使用快速实时扫描定义感兴趣区域的体积：首先聚焦到最底部的感兴趣结构，然后点击“设置末层”或“底部”。仔细调节焦距至最顶部的感兴趣结构，然后点击“设置首层”或“顶部”。软件将显示总深度。

设置Z轴扫描步距以满足奈奎斯特采样标准。可点击“最优”按钮自动计算该值。在为每个通道配置成像参数后，与单幅二维图像相比，应对弱信号略微提高激光功率或增益。

启动采集以获取完整的图像序列。为便于观察，使用显微镜自带的图像处理模块，生成最大强度投影，将所有合焦信号呈现在一幅单独的二维图像中。

然后使用软件内置的算法进行体积渲染，以生成三维图像。根据需要调整亮度、不透明度和光照。随后生成正交的 XZ 和 YZ 截面，以检查轴向范围和配准情况。

对固定的COS-7细胞进行多色荧光成像显示，细胞核、线粒体和微管被清晰标记，且重叠信号极少，证实了有效的顺序扫描和优化的检测条件。最大强度投影整合了所有光学切片中的信号，突出了荧光标记结构的空间分布。三维重建则提供了对样品结构的深度感知视图。

通过对不同成像模式下携带EGFP标记线粒体的活体Hep 3B细胞进行延时成像，比较其效果。共聚焦显微镜在各时间点采集的图像显示结构清晰，但荧光信号随时间逐渐减弱。标准超分辨率（SR）成像虽具有更高分辨率，但随时间推移光漂白现象更为明显。

快速超分辨率或SR-4Y图像即使在较晚的时间点也能保持稳定的荧光信号。平均EGFP荧光强度随100个时间点变化的图表表明，SR-4Y模式维持了最稳定的信号。在固定COS-7细胞中的成像性能在不同模式间进行了比较，结果显示超分辨率模式比共聚焦模式提供了更清晰的结构细节。

使用100纳米荧光微球测量点扩散函数表明，与单独使用Airyscan超分辨率成像相比，Airyscan超分辨率成像结合后续联合去卷积显著提高了横向和轴向分辨率。本实验方案使研究人员能够在约120纳米分辨率下研究固定细胞和活细胞中的细胞器形态、细胞骨架动态以及分子共定位。本方案最关键的考虑因素是精细的样品制备，需使用高质量的盖玻片和优化的染色方法，以确保超分辨率处理所需的信号完整性。

采用此方法后，研究人员可使用 ImageJ 等专用软件进行定量图像分析，例如测量信噪比或共定位。