Name: 超分辨率成像与共享管理：具备多重探测的共焦点显微镜协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-24T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 学习使用共聚焦显微镜与多重阵列探测器进行超分辨率成像的方法，实现约120纳米分辨率的活细胞与固定细胞成像。该方案降低了传统超分辨率技术的光毒性与操作复杂性，便于研究人员观察亚细胞结构动态。

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作者感谢浙江大学医学院公共技术平台提供的技术支持，并感谢 Yao Yao Zhong 提供人肝癌活细胞 Hep3B 样本。本研究受到浙江省自然科学基金（LZ25H060002）、浙江大学实验技术项目（SYBJS202321）、浙江省教育厅（Y202351321）以及农业农村部动物病毒学重点实验室开放研究项目（202201）的资助。

所有涉及生物样本的实验均按照浙江大学医学院公共技术平台的指南和规定进行，并经机构生物安全委员会批准（批准证书编号：BSL20235710079）。
注意：除非另有说明，涉及细胞培养的所有操作均须在 II 级生物安全柜中以无菌条件进行。本方案假设显微镜系统已安装完毕，且激光功率已完成校准。关键试剂、耗材和设备（如成像培养皿、盖玻片、封片介质）的详细规格及推荐供应商列于材料表中。
1. 样品制备
注意：成功的超分辨率成像始于最佳的样品制备。必须使用高质量、1.5 厚度（0.17 mm）的盖玻片型培养皿，以匹配高数值孔径（NA）油浸物镜的校正环，避免球面像差。除非另有说明，所有离心步骤均应在 300 × g 条件下进行 5 分钟。
<ol>
	<li>用于多色超分辨率成像的固定细胞样本制备（例如 COS7 细胞） 
	注意：本方案以图 1 所示为例，描述了微管（Alexa Fluor 568）和线粒体（Alexa Fluor 488）的免疫荧光染色，并以 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行细胞核复染。
	<ol>
		<li>在含 10% 胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于 37°C、5% CO2 的湿化培养箱中培养 COS7 细胞。</li>
		<li>将细胞以每皿 1.0 × 105 个细胞的密度接种至 35 mm 玻璃底成像培养皿中，静置使其贴壁并生长至 60–70% 汇合度（通常为 24 小时）。</li>
		<li>吸除培养基，用预热（37°C）的磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔洗涤细胞一次。加入 1 mL 含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 固定细胞，在室温（RT）孵育 15 分钟。</li>
		<li>吸除 PFA 溶液（按危险废物处理）。用 2 mL PBS 洗涤细胞三次，每次轻轻摇动孵育 5 分钟。</li>
		<li>通透与封闭：在通透/封闭缓冲液（含 0.1% v/v Triton X-100 和 1% w/v 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS）中室温孵育 30 分钟。</li>
		<li>一抗孵育：将抗 α-微管蛋白（小鼠单克隆抗体）和抗 TOMM20（兔多克隆抗体）的一抗混合物溶于抗体稀释缓冲液（含 1% BSA 的 PBS）中，每皿加入 300 µL 覆盖玻璃表面，4°C 过夜孵育（或室温 1–2 小时）。</li>
		<li>洗涤：小心吸除一抗溶液。用含 0.05% Tween-20 的 PBS（PBST）洗涤细胞三次，每次 2 mL，每次洗涤 5 分钟。</li>
		<li>二抗与细胞核染色：在抗体稀释缓冲液（含 1% BSA 的 PBS）中配制荧光二抗与 DAPI 的混合液，避光保存。
		<ol>
			<li>使用与 Alexa Fluor 568 偶联的驴抗小鼠 IgG（1:500）和与 Alexa Fluor 488 偶联的驴抗兔 IgG（1:500）。</li>
			<li>加入 DAPI 至终浓度为 1 µg/mL 用于细胞核染色。每皿加入 300 µL 混合液，室温避光孵育 1 小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>最终洗涤：吸除染色液，用 2 mL PBS 洗涤细胞三次，每次 5 分钟。</li>
		<li>封片：小心吸除成像培养皿中的 PBS，保持样本略微湿润。立即在玻璃底区域直接滴加少量硬化型抗荧光淬灭封片剂（如 ProLong Gold），约 20 µL。</li>
		<li>盖片与固化：轻柔地将一张 #1.5 高精度盖玻片盖在液滴上，避免产生气泡。在室温避光条件下静置过夜使其完全固化；若需快速固化，可在 37°C 孵育 2–4 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于延时成像的活细胞样本制备（例如表达荧光蛋白标签的 Hep3B 细胞）。 
	注意：本方案描述了稳定表达靶向线粒体的荧光蛋白（如 EGFP）的 Hep3B 细胞的成像方法。
	<ol>
		<li>在含 10% FBS 的最低必需培养基（MEM）中培养 Hep3B 细胞。将细胞以每皿 0.8 × 10⁵ 个细胞的密度接种至 35 mm 玻璃底成像培养皿（#1.5 盖玻片）中，培养约 18–24 小时，使其生长至约 70–80% 汇合度，以获得最佳细胞状态和成像密度。</li>
		<li>成像前准备：在成像当天，轻柔地将常规培养基替换为 2 mL 预平衡（37°C、5% CO2 条件下至少 30 分钟）的无酚红、低自发荧光成像培养基，该培养基需补充 10% FBS，如需在无 CO2 培养箱环境中维持 pH 稳定，还需添加 25 mM HEPES 缓冲液。此步骤可最大限度降低背景荧光，并在成像过程中维持生理 pH。 
		注意：开始延时成像采集前，应将培养皿置于预热的显微镜载物台上、环境培养舱内，适应至少 30–45 分钟，以确保温度、焦距和细胞状态稳定。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 显微镜系统的启动、初始化与基本校准
<ol>
	<li>打开显微镜主机、激光发射模块（包含405、488、561和640 nm的固态激光器）、LED光源以及控制计算机的电源。
	<ol>
		<li>让激光器预热并稳定至少15–20分钟。这对于保持激光输出功率的稳定性至关重要，尤其是在进行定量实验或时间序列实验时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动显微镜操作软件。</li>
	<li>从主界面中选择“显微镜 &#62; 初始化或按照软件的启动向导进行操作。</li>
	<li>在软件中，导航至“采集“面板。从物镜下拉菜单中选择”Plan-Apochromat 63 x/1.40 油镜 或根据实验需求选择合适的物镜。</li>
	<li>在物镜前透镜上直接滴加一滴浸油（折射率 = 1.518），避免产生气泡。</li>
	<li>对于活细胞成像，启动环境培养箱和主动聚焦稳定系统（例如，'确定焦点' &#62;) 成像前至少 45–60 分钟进行。将温度设置为 37°C，CO2 至5%，湿度至 &#62;60%。让系统稳定，使用培养箱传感器验证稳定性。</li>
	<li>系统现已准备就绪，可进行样本加载和成像参数设置。</li>
</ol>
3.&#160;多色荧光成像
<ol>
	<li>将制备好的样品放置在显微镜载物台上。小心地升高载物台，直至盖玻片&#160;接触到浸油。</li>
	<li>在采集软件中，进入“采集”选项卡，然后选择创建新实验。</li>
	<li>添加多个与所用荧光染料对应的成像通道（通道）。以图1中的示例为例，配置如下：
	<ol>
		<li>通道1（DAPI）：激发波长405 nm，检测范围410–480 nm。</li>
		<li>通道2（Alexa Fluor 488）：激发波长488 nm，检测范围495–550 nm。</li>
		<li>通道3（Alexa Fluor 568）：激发波长561 nm，检测范围570–620 nm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对每个通道，将共聚焦针孔直径设置为1艾里单位（1 AU）。</li>
	<li>通过以下迭代过程，优化每个通道的激光功率和探测器增益：
	<ol>
		<li>选择第一个通道（例如DAPI），切换至“实时”扫描模式。</li>
		<li>将初始激光功率设为较低值（例如0.1–0.5%），将探测器增益设为线性范围内的中等水平（例如GaAsP PMT设为700 V）。</li>
		<li>逐步增加激光功率，直至在实时图像中目标结构清晰可见且明显高于背景信号。</li>
		<li>打开直方图显示，确保无像素饱和（直方图不堆积在右侧边缘），必要时降低激光功率。</li>
		<li>调节探测器增益，以获得明亮且低噪声的图像。避免增益超过850 V，以防噪声过高。</li>
		<li>对所有其余荧光通道重复步骤3.5.1–3.5.5。 
		注意：应平衡激光功率、增益和像素驻留时间，在最小化光损伤的同时最大化信噪比。对于活细胞成像，应优先采用较低功率和较短驻留时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置图像格式（像素数量）和像素驻留时间。
	<ol>
		<li>设置像素大小以满足奈奎斯特采样准则：像素大小 ≤（分辨率 / 2.3）。对于标准共聚焦成像（横向分辨率约250 nm），应设置像素大小 ≤108 nm。</li>
		<li>若软件提供“奈奎斯特”采样按钮，可使用该功能自动计算。</li>
		<li>设置像素驻留时间。为获得更高信噪比，可采用较长驻留时间（例如1.0–2.0 µs）；为实现更快成像，可采用较短驻留时间（例如0.5–1.0 µs）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确保在各通道之间选择“顺序扫描”模式，以最小化串扰。</li>
	<li>点击“开始”以采集单幅图像，并保存包含相关元数据的图像。</li>
</ol>
4. 差分干涉对比（DIC）成像
<ol>
	<li>在采集软件的“采集”选项卡中，选择“添加新通道”，并将其配置为透射光检测。</li>
	<li>在软件中选择合适的透射光检测器（通常称为T-PMT（透射光光电倍增管）或ESID（外部系统接口检测器））。</li>
	<li>DIC棱镜和偏振器配置：
	<ol>
		<li>从硬件控制面板或软件界面中，选择与物镜匹配的DIC棱镜（例如，使用63倍物镜时选择“DIC III”）。</li>
		<li>将选定的棱镜插入光路中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>调节偏振器和DIC滑块以获得最佳对比度：
	<ol>
		<li>旋转检偏器（偏振器），直至“实时”图像中的背景呈现暗色或极暗状态。</li>
		<li>在观察实时图像的同时，以微小步进缓慢调节DIC滑块的位置。</li>
		<li>优化至细胞结构（如细胞膜、细胞核）在中性灰色背景上呈现出清晰的阴影投射、伪三维浮雕效果为止。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将DIC的照明波长设置为可见光范围内的某一数值（例如488 nm或546 nm）。</li>
	<li>调节透射光通道的透射强度（激光或光源功率）和检测器增益，以获得清晰且无饱和的图像。</li>
	<li>采集DIC图像。</li>
</ol>
5. 用于三维重建的Z轴层扫采集
注意：在定义Z轴扫描范围之前，应按照第3节所述，在一个最佳焦平面上配置所有成像参数（激光功率、增益、针孔、像素大小），以确保所有光学切片间的设置一致。
<ol>
	<li>在“采集”选项卡中，选择“Z轴层扫”模式。</li>
	<li>定义感兴趣区域的体积：
	<ol>
		<li>使用高速实时扫描，将焦距对准最上方感兴趣的结构。</li>
		<li>点击“设置第一层”（或“顶部”）。</li>
		<li>小心地向下聚焦至最下方感兴趣的结构。</li>
		<li>点击“设置最后一层”（或“底部”）。软件将显示总深度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置Z轴步进大小，以满足轴向方向的奈奎斯特采样准则（通常为dr/2.3，其中dr为轴向分辨率）。对于63倍/1.4数值孔径的油镜，建议使用0.3–0.4 µm。</li>
	<li>或者，使用软件中的“最佳”或“奈奎斯特”按钮自动计算步进大小。</li>
	<li>按照第3节所述，为每个通道设置成像参数（激光功率、增益、针孔=1 AU）。对于弱信号，可考虑相比单张2D图像略微提高激光功率或增益。</li>
	<li>开始采集以获取完整的图像堆栈。 
	注意：总采集时间 = （单层图像的帧时间） × （层数） 
	&#8203;请合理规划，特别是针对活体样品。</li>
	<li>三维重建与可视化：
	<ol>
		<li>使用软件的“处理”模块（例如三维投影功能），或将图像堆栈导入ImageJ/Fiji等专用软件中进行处理。</li>
		<li>生成最大强度投影（MIP），以在单张2D图像中显示所有合焦信号。</li>
		<li>如需真实的三维呈现，请应用体渲染技术，并根据需要调节亮度、不透明度和光照效果。</li>
		<li>生成正交视图（XZ和YZ截面），以检查轴向范围和图像配准情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6.&#160;活细胞延时成像
<ol>
	<li>按照第1.2节所述准备活细胞，并将培养皿置于环境培养箱内的预热显微镜载物台上。</li>
	<li>按照第2.6节所述，让样品适应环境至少45–60分钟，以确保系统稳定。</li>
	<li>选择一个细胞状态良好且分布适当的视野，使用根据第3.5节优化的参数获取一张高质量的单幅图像。</li>
	<li>启用主动聚焦稳定系统（例如 Definite focus 或类似系统）。对于长期实验，此步骤必不可少，用以补偿热漂移。</li>
	<li>在“Acquisition”选项卡中，选择“Time Series”模式。</li>
	<li>根据对速度、分辨率和光毒性之间所需平衡，选择合适的成像模式：
	<ol>
		<li>对于动态变化较慢但需要最高空间分辨率的过程，选择“SR”（超分辨率）模式。</li>
		<li>对于多数细胞器动态研究中较为平衡的需求，选择“SR 2 Y”或“SR 4 Y”模式（加速型超分辨率模式）。</li>
		<li>对于无需超分辨率但要求极高速成像的情况，选择“Confocal”或“Co 2 Y”模式。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定义实验时间线：设置实验总时长以及连续帧之间的时间间隔（Δt）。（例如，线粒体运动可设置为5–30秒）</li>
	<li>优化成像参数以最小化光损伤：
	<ol>
		<li>从能够产生可检测信号的最低激光功率开始。</li>
		<li>将探测器增益调整至其线性范围（600–850 V），以获得可用的信号强度，优先通过增益而非提高激光功率来增强信号。</li>
		<li>在满足图像质量要求的前提下，使用最快的扫描速度（最短的像素驻留时间）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开始延时成像采集，并监控前几帧的聚焦稳定性和细胞状态。</li>
</ol>
7. 大面积平铺扫描成像
<ol>
	<li>在“Acquisition”选项卡中，选择“Tile Scan”模式。</li>
	<li>使用以下两种方法之一定义拼接区域（tilingRegion）：
	<ol>
		<li>基于布局的方法：指定X和Y方向上的图像块数量（例如，3 × 3）。</li>
		<li>基于感兴趣区域（ROI）的方法：在“Live”图像上手动绘制一个矩形以定义感兴趣区域。软件将自动计算所需的图像块数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置相邻图像块之间的重叠率为10–15%。 
	注意：此重叠范围可为软件的拼接算法提供足够的信息，以生成无缝的合成图像。</li>
	<li>按照静态图像成像的方式，为单个图像块设置成像参数（激光功率、增益、分辨率）。 
	注意：对于非常大的拼接区域，建议使用较快的扫描模式（例如“Co 2 Y”），以使总采集时间保持在合理范围内，并尽量减少光漂白。</li>
	<li>开始图像块采集。软件将自动完成图像块的采集与拼接。</li>
	<li>采集完成后，仔细检查拼接后的图像，特别是在图像块边界处是否存在伪影。如有需要，可使用软件提供的手动拼接调整工具进行修正。</li>
</ol>
8. 使用多重阵列探测器的超分辨率成像
<ol>
	<li>在“采集”选项卡中，进入模式选择器，点击“智能设置”，然后选择“Airyscan”模式。接着选择“超分辨率”作为多路阵列探测器的工作模式。</li>
	<li>根据实验优先级选择特定的采集模式：
	<ol>
		<li>“SR”模式：实现最高空间分辨率（横向分辨率约120 nm），适用于固定样品。</li>
		<li>“SR 2 Y”模式：在分辨率与成像速度之间取得平衡。</li>
		<li>“SR 4 Y”模式：最快的超分辨率模式（理论上线速可达约25 fps），优化用于活细胞成像以最小化光照剂量。</li>
		<li>“Co 2 Y”模式：提供类似共聚焦的成像速度，并具有增强的信噪比，适用于无需超分辨率的实验。 
		注：分辨率数值（例如120 nm）为理想条件下的系统规格12。实际分辨率取决于样品制备、信噪比及正确处理方法。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配置成像参数（激光功率、探测器增益）。
	<ol>
		<li>对于活细胞成像，起始激光功率应低于共聚焦模式，以减少光损伤。</li>
		<li>对于信号较弱的固定样品，可能需要更高的激光功率和/或增益，以获得足够的信噪比。</li>
		<li>在“实时”模式下，找到能够产生清晰、高对比度图像的最低激光功率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置像素大小和驻留时间。
	<ol>
		<li>为捕捉增强的分辨率，像素大小应满足奈奎斯特准则：像素大小 ≤（目标分辨率 / 2.3）。对于SR模式（目标120 nm），设置像素大小 ≤ ~52 nm。</li>
		<li>若软件提供“最佳”或“奈奎斯特”按钮，可使用其自动计算该值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采集图像。原始数据包含多路复用信号，尚未实现超分辨率重建。</li>
	<li>对采集的数据进行处理以实现超分辨率：
	<ol>
		<li>进入软件的处理模块。</li>
		<li>选择数据集并选择“超分辨率处理”功能。</li>
		<li>首先使用“自动”设置。对于低信噪比数据，可手动调整“强度”和“噪声滤波器”以增强锐度，同时避免引入伪影。</li>
		<li>（可选）为获得最高保真度，特别是在3D图像堆栈中，可额外应用联合去卷积（jDCV）步骤。</li>
		<li>执行处理。比较处理前后的图像视图，验证真实细节的增强效果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>（可选）为在不同模式间定量比较信噪比（SNR）：
	<ol>
		<li>在不同模式下采集同一样品的图像。</li>
		<li>在分析软件中，在均匀结构上定义感兴趣区域（ROI），并测量平均信号强度。</li>
		<li>定义背景区域（背景ROI），并测量背景强度的标准差。</li>
		<li>计算信噪比 SNR =（平均信号）/（背景强度的标准差）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>（可选）使用荧光微球进行系统分辨率的经验测量：
	<ol>
		<li>制备100 nm荧光微球样品。</li>
		<li>以SR模式并采用奈奎斯特采样方式，采集单个孤立微球的Z轴层扫图像。</li>
		<li>使用超分辨率处理（可选地结合jDCV）对图像堆栈进行处理。</li>
		<li>使用软件的“点扩散函数测量”工具拟合三维高斯函数，并记录半高全宽（FWHM）值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Castagnini, D., Palma, K., Jara Wilde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+Imaging+of+Proteus+mirabilis+biofilm+by+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Super-resolution Imaging of Proteus mirabilis biofilm by expansion microscopy.</a> J Vis Exp. (221), e67932(2025).</li>
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作者声明不存在任何竞争性的经济或非经济利益。在本稿件的撰写过程中，作者使用了 DeepSeek 进行语言润色和格式整理辅助。

本文介绍的整合方案为在可持续的共享资源框架内，实施配备多重阵列超分辨率探测器的现代共聚焦显微镜系统的先进成像功能提供了全面的路线图。本节综合阐述了该方法的关键要素、实际实施步骤及其在生物成像领域中的定位。成功执行本方案依赖于若干关键步骤。首先，精细的样品制备是基础；使用兼容高分辨率的基底材料（例如 #1.5 盖玻片）以及优化的免疫染色方案，对于实现超分辨率图像处理所需的信号完整性与低背景至关重要13。在图像采集过程中，根据实时反馈和奈奎斯特采样准则，精确平衡激光功率、探测器增益和像素驻留时间，对于在最小化光损伤的同时最大化信噪比尤为关键，这一点在活细胞成像应用中尤为重要14。最后，必须强调的是，对于基于多重阵列探测器的成像模式，采集后的计算处理是必不可少的步骤，用于从原始阵列数据中重建超分辨率图像；忽略此步骤将导致次优结果，这一点已在我们的数据中得到证实。
该方案具有良好的稳健性，同时具备可适应性。例如，可通过顺序扫描和光谱解混来减轻通道间的串扰。在活细胞实验中，一旦出现光毒性迹象，应立...

动态亚细胞结构的可视化对于推动生命科学研究至关重要。然而，传统光学显微镜的分辨率受衍射限制，横向分辨率约为 200 nm，限制了其对动态亚细胞过程的分辨能力。为突破这一限制，已开发出多种超分辨率技术。然而，诸如受激辐射损耗显微镜（STED）、光激活定位显微镜（PALM）/随机光学重建显微镜（STORM）以及结构光照明显微镜（SIM）等技术，在多用户环境中广泛应用时常面临障碍，包括光毒性高、需要特殊荧光染料或样品制备、复杂的对准程序或高强度的计算处理1,2,3。
在此背景下，配备多重阵列探测器的共聚焦显微镜系统通过多像素检测与计算重分配实现超分辨率成像，显著降低了技术门槛4。该方法采用由32个元件组成的磷化镓砷（GaAsP）探测器阵列，以从每个扫描点收集更多光子。随后通过智能去卷积算法对这些信息进行重新分配，有效减小检测体积。该过程可实现横向约120 nm、轴向约350 nm的空间分辨率，相比宽场显微镜的衍射极限分辨率提高约2倍，并且相较于同一仪器上的标准共聚焦模式，信噪比提升4至8倍4,5,6。这种分辨率提升、信号质量优异以及与常用荧光标记和实验方案兼容的特性组合，构成了其广泛适用的主要优势。
因此，这种易于使用的超分辨率显微技术已在生命科学研究中得到广泛应用，能够对固定细胞和活细胞中的细胞器形态、细胞骨架动态、病毒-宿主相互作用以及分子共定位进行细致研究7,8。该技术相对温和的成像特性使其特别适用于对活体样本进行长时间的延时观察。
将此类先进系统整合到核心设施中对于实现资源共享至关重要，但其可持续且高效运行仍面临独特挑战。在机构核心设施中，例如浙江大学医学院，最佳性能和影响力高度依赖于三个支柱：（1）标准化且可重复的成像方案，（2）严格的常规维护，（3）有效的共享使用管理框架。尽管已有针对早期系统成像方法9或通用设施管理原则10,11等方面的宝贵资源，但目前尚缺乏将现代多重阵列探测器平台的详细、可重复操作方案与经过验证的共享资源管理模式相结合的综合性指南。本实验方案旨在填补这一空白。
总体目标是提供一份全面的分步指南，以在共享资源环境下高效实施和利用配备多重阵列探测器的共聚焦系统进行超分辨率成像。本指南面向两类主要受众：一是需要超越常规共聚焦分辨率极限（约250 nm）的研究人员，二是负责管理该类设施并确保其可持续运行的平台管理人员。&#8236;-300 nm），同时对活细胞兼容性、操作便捷性和通量有较高要求的研究人员；以及正在建立或优化此类服务的平台管理者。本文系统阐述了系统配置、多模态成像方案（涵盖多色、三维、活细胞、拼接和超分辨率成像模式）以及一种经过验证的共享管理模式。本综合指南旨在充分释放这一强大成像技术的潜力并提升其可及性。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;COS7细胞</td><td>ATCC（或类似机构）</td><td>CRL-1651</td><td>非洲绿猴肾成纤维细胞系。用于制备固定细胞样本，以进行多色超分辨率成像&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;驴抗小鼠IgG，Alexa Fluor 568标记</td><td>Invitrogen（或类似产品）</td><td>A10037</td><td>用于微管染色的二抗，使用稀释比例为1:500</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;杜尔贝科&amp;lsquo;高糖改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Gibco（或类似产品）</td><td>11965092</td><td>COS7细胞的标准培养基，添加10% FBS。</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;胎牛血清（FBS），热灭活</td><td>Gibco（或类似产品）</td><td>10082147</td><td>所有细胞培养基中均添加10%（v/v）的血清补充剂。</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;玻璃底成像培养皿（35 mm， &amp;micro;- 培养皿，#1.5 聚合物盖玻片，0.17 mm 厚度</td><td>ibidi（或类似产品）</td><td>81156</td><td>用于细胞铺板和成像的基底。对于与高数值孔径油浸物镜的兼容性至关重要。</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;图像处理 &amp;以及分析软件（ZEN 模块）</td><td>卡尔·蔡司股份公司</td><td>ZEN 3.5（蓝色）</td><td>用于三维重建、超分辨率处理（例如 Airyscan 处理）、点扩散函数测量和信噪比分析。</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;ImageJ / Fiji</td><td>开源</td><td>N/A</td><td>用于额外的三维重建、生成正交视图以及常规图像分析。</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;浸油（折射率 = 1.518）</td><td>卡尔·蔡司（或类似品牌）</td><td>444960-0000-000</td><td>用于油浸物镜（例如，63x/1.4 NA）。</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;配备多路阵列检测器的激光扫描共聚焦显微镜系统（例如，ZEISS LSM 900 配备 Airyscan 2）</td><td>卡尔·蔡司股份公司</td><td>LSM 900（Airyscan 2）</td><td>本方案中所述所有共聚焦和超分辨率成像模式所使用的主要成像平台。</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;含Earle's平衡盐溶液的最低必需培养基（MEM）&amp;lsquo;盐类</td><td>Gibco（或类似品牌）</td><td>11095080</td><td>Hep3B 细胞的标准培养基，添加 10% FBS。</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;小鼠抗-&amp;alpha;-微管蛋白单克隆抗体（克隆 DM1A）</td><td>Sigma-Aldrich（或类似产品）</td><td>T6199</td><td>用于标记微管的一抗，使用时稀释比例为1:500</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;4% 多聚甲醛（PFA）PBS 溶液</td><td>&amp;nbsp;Jinpan&amp;nbsp;（或类似物）</td><td>TBS5083</td><td>细胞固定剂。室温使用，作用15分钟。操作时应采取适当防护措施。</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;无酚红成像培养基</td><td>Gibco（或类似产品）</td><td>21063029</td><td>用于活细胞成像的低自发荧光培养基。已预平衡于5% CO₂环境中&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 37℃&amp;deg;使用前置于 C。</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;磷酸盐缓冲液（PBS），1X，pH 7.4</td><td>CellWorld（或类似产品）</td><td>C0162-311</td><td>在整套实验方案中用作洗涤和稀释缓冲液。</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen（或类似产品）</td><td>P36930</td><td>用于固定样品中荧光保存的硬化封片介质。</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich（或类似产品）</td><td>T8787</td><td>以0.1%（v/v）用于细胞通透化</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich（或类似品牌）</td><td>P9416</td><td>在抗体孵育后的洗涤步骤中，使用含0.05%（v/v）PBS（PBST）溶液。</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA），第五组分</td><td>Sigma-Aldrich（或类似产品）</td><td>A7906</td><td>在 PBS 中按 1% (w/v) 使用，用于封闭及作为抗体稀释缓冲液的组分。</td></tr><tr><td>DAPI（4&amp;lsquo;,6-二脒基-2-苯基吲哚）</td><td>Sigma-Aldrich（或类似品牌）</td><td>D9542</td><td>细胞核复染剂。使用终浓度为1 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>驴抗兔IgG，Alexa Fluor 488标记</td><td>Invitrogen（或类似产品）</td><td>A21206</td><td>用于线粒体染色的二抗，使用时稀释比例为1:500</td></tr><tr><td>荧光微球（微珠），直径100 nm</td><td>Invitrogen（例如，TetraSpeck&amp;trade;）或类似物</td><td>T7279</td><td>用于系统的实证测量&amp;lsquo;点扩散函数（PSF）与分辨率</td></tr><tr><td>稳定表达EGFP-线粒体的Hep3B细胞</td><td>IMMOCELL</td><td>IM-H367</td><td>经基因工程改造以稳定表达定位于线粒体基质的EGFP的人肝癌细胞系。用于活细胞延时成像。</td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液，1 M</td><td>Gibco（或类似产品）</td><td>15630080</td><td>在非 CO₂ 环境下进行活细胞成像时，用于成像培养基中的终浓度为 25 mM，以实现 pH 稳定&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td></tr><tr><td>高精度盖玻片（#1.5，0.17 mm 厚度）</td><td>Marienfeld（或类似品牌）</td><td>107052</td><td>用于固定样品的封片。</td></tr><tr><td>显微镜操作软件（例如 ZEN blue edition）</td><td>卡尔·蔡司股份公司</td><td>ZEN 3.5（蓝色）</td><td>用于系统控制、图像采集和基本处理。</td></tr><tr><td>物镜：平场复消色差 63倍/1.40 数值孔径 油镜 DIC</td><td>卡尔·蔡司股份公司</td><td>421462-9900-000</td><td>用于高分辨率成像的主要物镜。</td></tr><tr><td>兔抗TOMM20多克隆抗体</td><td>Abcam（或类似品牌）</td><td>ab186735</td><td>用于标记线粒体的一抗，使用1:1000稀释比例&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

超分辨率成像与共享管理：一种用于多通道检测共聚焦显微镜的实验方案

Super-Resolution Imaging and Shared Management: A Protocol for Confocal Microscopy with Multiplex Detection

超分辨率显微镜（SRM）突破了传统光学显微镜的衍射极限，实现了亚细胞结构的纳米级可视化。然而，诸如受激辐射损耗显微镜（STED）、光激活定位显微镜（PALM）/随机光学重建显微镜（STORM）以及结构光照明显微镜（SIM）等技术的广泛应用，可能受到高光毒性、特殊的样品制备要求或操作复杂性等因素的限制。本文介绍了一种综合性的实验方案，该方案利用集成多路超分辨率探测器的激光扫描共聚焦平台，结合计算处理，可在同一工作流程中实现共聚焦成像与超分辨率成像之间的便捷切换。该方案提供了一种操作简便、快速、高分辨率且低光毒性的成像方法。详细方法涵盖了多模态成像能力，包括多色荧光、微分干涉差（DIC）、三维Z轴层扫重建、活细胞延时成像、大视野拼接以及多路阵列探测器提供的多种超分辨率模式。系统性比较表明，这些超分辨率模式可实现约120 nm的横向分辨率，相比传统宽场显微镜的衍射极限提高了约两倍，且与同一平台上标准共聚焦成像相比，在分辨率和信噪比方面均有显著提升（提高4–8倍）。本文还讨论了支撑该技术可持续运行所必需的共享资源管理模式中的关键要点。本综合指南为生命科学研究中希望采用并充分发挥这种易于获取的先进成像技术潜力的新手与资深研究人员及核心设施管理者提供了宝贵的参考资源。

多色荧光成像 
对固定后的COS7细胞进行多色荧光成像，操作步骤如第3节所述。使用针对α-微管蛋白（微管）和TOMM20（线粒体）的抗体，并以DAPI进行细胞核复染。如图1所示，细胞核（蓝色）、线粒体（绿色，Alexa Fluor 488）和微管（红色，Alexa Fluor 568）清晰可辨，具有高特异性且光谱串扰极小，验证了顺序扫描及优化检测设置的有效性。
荧光与微分干涉差（DIC）成像的结合 
荧光通道与DIC成像的叠加（第4节）提供了具有上下文意义的形态学信息。图2展示了高对比度的DIC图像，呈现出细胞结构特征性的阴影浮雕效果，并与荧光信号精确叠加，突显了无标记对比技术与荧光成像相结合的实用性。
三维结构分析 
通过Z轴层扫采集与处理（第5节），对植物根样本进行了三维分析。<stro...

本方案详细介绍了集成多路阵列探测器的激光扫描共聚焦显微镜系统在高级成像中的应用及其共享资源管理，适用于高分辨率的细胞及亚细胞成像。该工作流程可在同一平台上实现从共聚焦到超分辨率（约120 nm）的多模态成像，使纳米级可视化更加便捷可行。

超分辨率显微镜技术（SRM）突破了传统光学显微镜的衍射极限，实现了亚细胞结构的纳米级可视化……

我们的研究致力于开发可及的超分辨率成像方法，以可视化动态的亚细胞结构，突破传统显微镜的衍射极限。超分辨率方法面临光毒性、操作复杂以及需要特殊制备等问题。本方案通过基于共聚焦的多重检测技术，降低了这些技术门槛。首先，打开显微镜主机、激光发射模块、LED 光源和控制计算机的电源。启动显微镜操作软件。在主界面中选择 GFP，然后关闭反射光。进入采集面板。从物镜下拉菜单中选择合适的物镜。进行活细胞成像时，应在成像前45至60分钟启动环境培养箱和主动聚焦稳定系统。系统稳定后，使用培养箱传感器验证其稳定性。在物镜前端透镜上滴加浸油，注意避免产生气泡。将制备好的样品放置在显微镜载物台上。小心地抬起，直到盖玻片接触到浸油。接下来，打开采集软件。进入“采集”选项卡，选择创建新实验。现在，为所用的荧光染料添加成像通道。对于每个通道，将共聚焦针孔直径设置为一个空气单位。为优化激光功率，选择第一个通道并切换至实时扫描模式。将初始激光功率设为较低值，然后将检测器增益调节至其线性范围内的中等水平。随后逐步增加激光功率，直至目标结构在实时图像中清晰可见，且明显高于背景信号。使用软件中的奈奎斯特采样按钮设置像素尺寸，以自动计算最佳值。接下来，设置像素时间。然后选择轨道间的逐帧扫描模式，以尽量减少串扰。单击“拍摄”以获取单幅图像。保存带有相关元数据的图像。为了在光学切片间保持设置的一致性，在定义Z轴扫描范围之前，需确认所有成像参数已在单一最佳焦平面上进行配置。打开采集选项卡，选择Z轴扫描模式。通过快速实时扫描来定义感兴趣区域的体积：首先聚焦到最底部的感兴趣结构，然后点击“设置末层”或“底部”。仔细调节焦距至最顶部的感兴趣结构，然后点击“设置首层”或“顶部”。软件将显示总深度。设置Z轴步进尺寸以满足奈奎斯特采样标准。可使用“最优”按钮自动计算该值。在为每个通道配置成像参数后，与单幅二维图像相比，对于较弱信号可略微增加激光功率或增益。开始采集以获取完整的图像序列。为便于观察，使用显微镜自带的图像处理模块，生成最大强度投影图，以在单个二维图像中显示所有聚焦的信号。然后使用软件内置的算法进行体积渲染，以生成三维图像。根据需要调整亮度、不透明度和光照。随后生成正交的XZ和YZ截面，以检查轴向范围和配准情况。对固定的COS-7细胞进行多色荧光成像显示，细胞核、线粒体和微管被清晰标记，且重叠信号极少，证实了有效的顺序扫描与优化的检测效果。最大强度投影整合了所有光学切片中的信号，突出了荧光标记结构的空间分布。三维重建则提供了对样品结构深度信息的可视化观察。通过对不同成像模式下带有EGFP标记线粒体的活体Hep 3B细胞进行延时成像，进行比较。共聚焦显微镜在不同时间点采集的图像显示出清晰的结构，但荧光信号随时间逐渐减弱。标准超分辨率（SR）成像虽具有更高的分辨率，但随时间推移光漂白现象更为明显。快速超分辨率或SR-4Y图像即使在较晚的时间点也能保持稳定的荧光信号。EGFP平均荧光强度在100个时间点上的变化曲线显示，SR-4Y模式维持了最稳定的信号。在固定COS-7细胞中的成像性能比较表明，超分辨率模式比共聚焦模式提供了更清晰的结构细节。使用100纳米荧光微球测量点扩散函数表明，与单独使用Airyscan超分辨成像相比，Airyscan超分辨成像结合联合去卷积处理可同时提高横向和轴向分辨率。本实验方案使研究人员能够在约120纳米分辨率下研究固定细胞和活细胞中的细胞器形态、细胞骨架动态以及分子共定位。本方案最关键的考虑因素是精细的样品制备，需使用高质量的盖玻片和优化的染色方法，以确保超分辨成像处理所需的信号完整性。通过该步骤，研究人员可使用 ImageJ 等专用软件进行定量图像分析，例如测量信噪比或共定位。

super-resolution-imaging-shared-management-protocol-for-confocal

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

超分辨率成像与共享管理：具备多重探测的共焦点显微镜协议

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同时多色成像生物结构的荧光光激活定位显微技术

我们展示了一种利用荧光标记抗体的连续结合与洗脱，以单分子精度对异质纳米结构内多种分子进行成像的方法。...

使用 madSTORM 对 T 细胞进行高度多重化的超分辨率成像

本文介绍了一种构建集成显微系统的实用指南，该系统以经济高效的方式将传统的落射荧光成像、基于单分子检测的超分辨率成像以及多色单分子检测（包括单分子荧光共振能量转移成像）整合到一个装置中。...

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共聚焦与超分辨率成像技术揭示基底膜蛋白极化性细胞内运输及分泌过程 黑腹果蝇 卵子发生

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全细胞超分辨率成像 通过 使用光学光子重分配的旋转盘共聚焦显微镜进行DNA-PAINT成像

学习使用共聚焦显微镜与多重阵列探测器进行超分辨率成像的方法，实现约120纳米分辨率的活细胞与固定细胞成像。该方案降低了传统超分辨率技术的光毒性与操作复杂性，便于研究人员观察亚细胞结构动态。

超分辨率成像与共享管理：一种用于多通道检测共聚焦显微镜的实验方案

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