Name: 分离、培养并短暂转染原代人类T细胞，生成嵌合抗原受体（CAR）T细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 学习分离、培养并短暂转染原代人类T细胞以生成嵌合抗原受体T细胞的方法。该方案涵盖电穿孔转染、流式细胞术表型分析及CAR表达动力学评估，为免疫治疗研究提供快速筛选CAR结构的可靠技术平台。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由奥地利科学基金（FWF 项目 ESP 465-B）资助。我们感谢维也纳医科大学核心设施流式细胞术单元的支持。我们向所有自愿参与并提供样本的健康捐献者以及提供协助的护理团队表示感谢。

<ol><li>Bartelt, R. R., Cruz-Orcutt, N., Collins, M., Houtman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+T+cell+receptor-induced+proximal+signaling+and+downstream+functions+in+immortalized+and+primary+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of T cell receptor-induced proximal signaling and downstream functions in immortalized and primary T cells.</a> PLoS One. 4 (5), e5430(2009).</li>
<li>Smeets, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathway+profiling+of+T+lymphocyte+signal+transduction+pathways%3B+Th1+and+Th2+genomic+fingerprints+are+defined+by+TCR+and+CD28-mediated+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular pathway profiling of T lymphocyte signal transduction pathways; Th1 and Th2 genomic fingerprints are defined by TCR and CD28-mediated signaling.</a> BMC Immunol. 13 (12), (2012).</li>
<li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jurkat+T-cell+lines+exhibit+marked+genomic+instability+affecting+karyotype%2C+mutational+profile%2C+gene+expression%2C+immunophenotype+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Jurkat T-cell lines exhibit marked genomic instability affecting karyotype, mutational profile, gene expression, immunophenotype and function.</a> Sci Rep. 15 (1), 22426(2025).</li>
<li>Dobersberger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineering+strategy+to+target+activated+EGFR+with+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Methods%22%5BJournal%5D)">An engineering strategy to target activated EGFR with CAR T cells.</a> Cell Rep Methods. 4 (4), 100728(2024).</li>
<li>Van Bruggen, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+lymphocytic+leukemia+cells+impair+mitochondrial+fitness+in+CD8%2B+T+cells+and+impede+CAR+T-cell+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Chronic lymphocytic leukemia cells impair mitochondrial fitness in CD8+ T cells and impede CAR T-cell efficacy.</a> Blood. 134 (1), 44-58 (2019).</li>
<li>Hoffmann, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+expansion+potential+of+naive+chimeric+antigen+receptor+T+cells+from+healthy+donors+and+untreated+chronic+lymphocytic+leukemia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differences in expansion potential of naive chimeric antigen receptor T cells from healthy donors and untreated chronic lymphocytic leukemia patients.</a> Front Immunol. 8 (1956), (2017).</li>
<li>Zhang, D. K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+CAR-T+cell+functionality+in+a+patient-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Enhancing CAR-T cell functionality in a patient-specific manner.</a> Nat Commun. 14 (1), 506(2023).</li>
<li>Li, Y., Kurlander, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+anti-CD3+and+anti-CD28-coated+beads+with+soluble+anti-CD3+for+expanding+human+T+cells%3A+differing+impact+on+CD8+T+cell+phenotype+and+responsiveness+to+restimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation.</a> J Transl Med. 8 (104), (2010).</li>
<li>Xu, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+comparative+analysis+reveals+differential+impacts+of+various+cytokines+on+CART+cell+phenotype+and+function+ex+vivo+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Multiparameter comparative analysis reveals differential impacts of various cytokines on CART cell phenotype and function ex vivo and in vivo.</a> Oncotarget. 7 (50), 82354-82368 (2016).</li>
<li>Cornish, G. H., Sinclair, L. V., Cantrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+T-cell+growth+by+IL-2+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of T-cell growth by IL-2 and IL-15.</a> Blood. 108 (2), 600-608 (2006).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+%28CAR-T%29+cells+expanded+with+IL-7%2FIL-15+mediate+superior+antitumor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects.</a> Protein Cell. 10 (10), 764-769 (2019).</li>
<li>Foster, J. B., Barrett, D. M., Kariko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+in+vitro-transcribed+mRNA+in+adoptive+T+cell+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">The emerging role of in vitro-transcribed mRNA in adoptive T cell immunotherapy.</a> Mol Ther. 27 (4), 747-756 (2019).</li>
<li>Becker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+effectiveness+of+gammadelta+T+cells+by+mRNA+transfection+of+chimeric+antigen+receptors+or+bispecific+T+cell+engagers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Enhancing the effectiveness of gammadelta T cells by mRNA transfection of chimeric antigen receptors or bispecific T cell engagers.</a> Mol Ther Oncolytics. 29, 145-157 (2023).</li>
<li>Wiesinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical-scale+production+of+CAR-T+cells+for+the+treatment+of+melanoma+patients+by+mRNA+transfection+of+a+CSPG4-specific+CAR+under+full+GMP+compliance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Clinical-scale production of CAR-T cells for the treatment of melanoma patients by mRNA transfection of a CSPG4-specific CAR under full GMP compliance.</a> Cancers (Basel). 11 (8), 1198(2019).</li>
<li>Wu, J., Wu, W., Zhou, B., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+therapy+meets+mRNA+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor therapy meets mRNA technology.</a> Trends Biotechnol. 42 (2), 228-240 (2024).</li>
<li>Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-based+therapeutics--developing+a+new+class+of+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (10), 759-780 (2014).</li>
<li>Underwood, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+activators+exhibit+distinct+downstream+effects+on+chimeric+antigen+receptor+T+cell+phenotype+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunohorizons%22%5BJournal%5D)">T cell activators exhibit distinct downstream effects on chimeric antigen receptor T cell phenotype and function.</a> Immunohorizons. 8 (6), 404-414 (2024).</li>
<li>Zajc, C. U., Teufl, M., Traxlmayr, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+and+stability+analysis+of+yeast+displayed+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Affinity and stability analysis of yeast displayed proteins.</a> Methods Mol Biol. 2491, 155-173 (2022).</li>
<li>Seigner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solving+the+mystery+of+the+FMC63-CD19+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Solving the mystery of the FMC63-CD19 affinity.</a> Sci Rep. 13 (1), 23024(2023).</li>
<li>Jalkanen, A. L., Coleman, S. J., Wilusz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+and+implications+of+mRNA+poly%28A%29+tail+size--does+this+protein+make+my+tail+look+big%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Determinants and implications of mRNA poly(A) tail size--does this protein make my tail look big.</a> Semin Cell Dev Biol. 34, 24-32 (2014).</li>
<li>Foster, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+mRNA+encoding+a+chimeric+antigen+receptor+is+critical+for+the+generation+of+a+robust+T-Cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Purification of mRNA encoding a chimeric antigen receptor is critical for the generation of a robust T-Cell response.</a> Hum Gene Ther. 30 (2), 168-178 (2019).</li>
<li>Kitte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29-mRNA+for+transient+CAR+T+cell+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimal chimeric antigen receptor (CAR)-mRNA for transient CAR T cell generation.</a> Int J Mol Sci. 26 (3), 965(2025).</li>
<li>Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+assays+to+measure+CAR+T-cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity.</a> Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonviral+approach+to+generate+transient+chimeric+antigen+receptor+T+cells+using+mRNA+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A nonviral approach to generate transient chimeric antigen receptor T cells using mRNA for cancer immunotherapy.</a> J Vis Exp. (216), e67548(2025).</li>
<li>Foster, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+mRNA+CAR+T+cells+targeting+GD2+provide+dose-adjusted+efficacy+against+diffuse+midline+glioma+and+high+grade+glioma+models%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Transient mRNA CAR T cells targeting GD2 provide dose-adjusted efficacy against diffuse midline glioma and high grade glioma models.</a> Neuro Oncol. 27 (10), 2684-2696 (2025).</li>
<li>Usheva, Z. I., Petersen, D. L., Barington, T., Mouritzen, P., Barnkob, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+cytotoxicity+assay+to+assess+chimeric+antigen+receptor+T+cells+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Droplet-based cytotoxicity assay to assess chimeric antigen receptor T cells at the single-cell level.</a> J Vis Exp. (217), e67657(2025).</li>
<li>Subham, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vitro+cytotoxicity+evaluation+of+Jurkat+expressing+chimeric+antigen+receptor+using+fluorescent+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Rapid in vitro cytotoxicity evaluation of Jurkat expressing chimeric antigen receptor using fluorescent imaging.</a> J Vis Exp. (200), e65560(2023).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transfection+of+primary+human+and+mouse+T+lymphocytes+using+RNA+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transfection of primary human and mouse T lymphocytes using RNA electroporation.</a> Mol Ther. 13 (1), 151-159 (2006).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li>
<li>Clausen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+significance+of+the+activation-associated+receptors+CD25+and+CD69+on+human+NK-cells+and+NK-like+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Functional significance of the activation-associated receptors CD25 and CD69 on human NK-cells and NK-like T-cells.</a> Immunobiology. 207 (2), 85-93 (2003).</li>
<li>Poloni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation-induced+marker+assays+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">T-cell activation-induced marker assays in health and disease.</a> Immunol Cell Biol. 101 (6), 491-503 (2023).</li>
<li>Rotta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+flow+cytometry+immunophenotyping+of+human+antigen-specific+T+cells+by+activation-induced+marker+and+Th1+cytokine+detection%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for flow cytometry immunophenotyping of human antigen-specific T cells by activation-induced marker and Th1 cytokine detection.</a> STAR Protoc. 6 (1), 103343(2025).</li>
<li>Elsallab, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+primary+malignancies+after+commercial+CAR+T-cell+therapy%3A+analysis+of+the+FDA+adverse+events+reporting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Second primary malignancies after commercial CAR T-cell therapy: analysis of the FDA adverse events reporting system.</a> Blood. 143 (20), 2099-2105 (2024).</li>
<li>Verdun, N., Marks, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+cancers+after+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Secondary cancers after chimeric antigen receptor T-cell therapy.</a> N Engl J Med. 390 (7), 584-586 (2024).</li>
<li>Krug, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+and+activity+of+MCSP-specific+chimeric+antigen+receptors+%28CARs%29+depend+on+the+scFv+antigen-binding+domain+and+the+protein+backbone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Stability and activity of MCSP-specific chimeric antigen receptors (CARs) depend on the scFv antigen-binding domain and the protein backbone.</a> Cancer Immunol Immunother. 64 (12), 1623-1635 (2015).</li>
<li>Kitte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticles+outperform+electroporation+in+mRNA-based+CAR+T+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticles outperform electroporation in mRNA-based CAR T cell engineering.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 31, 101139(2023).</li>
<li>Sauerer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+mRNA+as+a+universal+technology+platform+to+transfect+a+variety+of+primary+cells+with+antigens+and+functional+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of mRNA as a universal technology platform to transfect a variety of primary cells with antigens and functional proteins.</a> Methods Mol Biol. 2786, 219-235 (2024).</li>
<li>Bimbo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-specific+non-viral+DNA+delivery+and+in+vivo+CAR-T+generation+using+targeted+lipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">T cell-specific non-viral DNA delivery and in vivo CAR-T generation using targeted lipid nanoparticles.</a> J Immunother Cancer. 13 (7), (2025).</li>
<li>Hudecek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+non-viral%3A+the+Sleeping+Beauty+transposon+system+breaks+on+through+to+the+clinical+side%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Going non-viral: the Sleeping Beauty transposon system breaks on through to the clinical side.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 52 (4), 355-380 (2017).</li>
<li>Prommersberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minicircles+for+CAR+T+cell+production+by+sleeping+beauty+transposition%3A+a+technological+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Minicircles for CAR T cell production by sleeping beauty transposition: a technological overview.</a> Methods Mol Biol. 2521, 25-39 (2022).</li>
<li>Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sleeping+Beauty+transposon+system%3A+a+non-viral+vector+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy.</a> Hum Mol Genet. 20 (R1), R14-R20 (2011).</li>
<li>Soundara Rajan, T., Gugliandolo, A., Bramanti, P., Mazzon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-Transcribed+mRNA+chimeric+antigen+receptor+T+cell+%28IVT+mRNA+CAR+T%29+therapy+in+hematologic+and+solid+tumor+management%3A+A+preclinical+update%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro-Transcribed mRNA chimeric antigen receptor T cell (IVT mRNA CAR T) therapy in hematologic and solid tumor management: A preclinical update.</a> Int J Mol Sci. 21 (18), (2020).</li>
<li>Granit, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+clinical+activity+of+autologous+RNA+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+in+myasthenia+gravis+%28MG-001%29%3A+a+prospective%2C+multicentre%2C+open-label%2C+non-randomised+phase+1b%2F2a+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Safety and clinical activity of autologous RNA chimeric antigen receptor T-cell therapy in myasthenia gravis (MG-001): a prospective, multicentre, open-label, non-randomised phase 1b/2a study.</a> Lancet Neurol. 22 (7), 578-590 (2023).</li>
<li>Dagher, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+efficacy+of+multi-targeting+mRNA-based+CAR+T+cell+therapy+in+resection+models+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Preclinical efficacy of multi-targeting mRNA-based CAR T cell therapy in resection models of glioblastoma.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 36 (3), 102676(2025).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

分离和培养原代人T细胞为 体外 和 体内 研究。众所周知，激活后 体外 扩增过程中，T细胞分化为效应样表型，且细胞因子添加剂的选择显著影响这些分化命运9. 与使用 IL-2 扩增的 T 细胞相比，在小鼠模型中，用 IL-7 和 IL-15 培养的 CAR T 细胞表现出更佳的持续存留能力和更强的抗肿瘤活性29因此，激活试剂和细胞因子补充物的选择对于获得具有理想表型的T细胞至关重要。我们比较了两种激活试剂（CD3/28磁珠和TransAct），在为期三周的扩增过程中，它们对T细胞扩增动力学、得率以及CD4/CD8比例具有不同影响。总体而言，经CD3/28磁珠激活扩增的T细胞中CD8阳性细胞的比例更高+ 以及CD4的较低频率+ 细胞数量多于TransAct激活后的细胞数量。由于CD8⁺ T细胞倾向于分化为效应样TEMRA表型，因此试剂的选择是应与实验目标相匹配的关键变量。除了表型表面标志物外，激活标志物的上调也能提供有关T细胞状态和效应功能的信息。CD25和CD69均为敏感的激活标志物，通常在激活后的早期时间点即出现上调。它们常用于评估T细胞的激活状态，但也适用于其他细胞类型（如自然杀伤细胞，NK细胞）的激活检测。30,31,32相比之下，扩增的T细胞中激活标志物CD137和CD154的表达水平较低，表明其在共培养体系中可用于评估CAR T细胞与靶细胞共培养后特异性上调的潜力。值得注意的是，在应用激活标志物 panel 评估CAR T细胞与靶细胞（即肿瘤细胞）共培养后的活性时，需谨慎选择激活标志物，以避免所选标志物在缺乏靶细胞的情况下于T细胞上已有较高本底表达。
在使用原代T细胞时，应注意其扩增和分化特性高度依赖于供体。然而，在T细胞分离前将初始样本在4 °C下保存，并尽量缩短操作时间，可显著提高分离细胞的得率和质量。细胞活力受冻存和复苏过程持续时间的影响，因为冻存液中含有二甲基亚砜（DMSO）等冷冻保护剂。尽管DMSO在冷冻过程中对维持细胞结构至关重要，但在室温下对细胞具有毒性。因此，复苏后需快速操作并稀释DMSO。在对T细胞进行电穿孔时，细胞在电脉冲后最为敏感，该电脉冲旨在使细胞膜对mRNA通透。轻柔操作细胞以避免额外的剪切应力，并使用预温的溶液，可显著提高细胞回收率和存活率。在测试新的CAR构建体时，加入阳性对照mRNA（例如已知表达水平的CAR或GFP等报告蛋白）可能具有帮助。此外，建议至少设置MOCK转染细胞（即未加入mRNA而仅进行电穿孔的细胞）作为阴性对照。在功能检测中，可使用编码靶向不同抗原的CAR的mRNA，以评估CAR特异性的激活情况。
由于表达动力学可能依赖于mRNA序列，单独评估其动力学是选择下游实验最佳时间点的有力工具。该转染方法主要用于快速、简便地平行筛选多种CAR结构。由于CAR在T细胞表面表达的时间较短，无法进行长期实验。然而，通过初步的转染实验，可以确定最优的CAR设计，以便根据需要进一步开展病毒转导实验。
最后，可根据实验设计更换抗体或其偶联的荧光染料。然而，必须充分考虑各荧光染料相应的激发和发射光谱，以确保结果的可靠解读。此外，在预实验中可依次进行单一抗体染色，以确保多色染色 panel 的正确补偿。尽管本研究中所提出的抗体 panel 无需进行光谱补偿，但在更换抗体 panel 时，可能需要建立相应的补偿矩阵。
本文介绍的体外转录（IVT）与电穿孔方案为将CAR结构导入原代人T细胞提供了一种简单且灵活的非病毒转导替代方法。由于该方法完全依赖RNA递送，因此可在不具备BSL-2级生物安全设施的实验室中进行，显著降低了开展CAR T细胞研究的技术门槛。尽管病毒转导效率较高，且在CAR领域中被广泛使用，但其存在与基因组整合相关的安全风险，可能导致继发性恶性肿瘤，同时病毒制备过程也较为耗时且成本高昂33，34。此外，由于CAR表达具有瞬时性，该方法特别适用于对多种CAR设计方案进行快速、并行的筛选35，使研究人员能够以高通量方式比较不同构建体的功能表现。该方法的局限性在于CAR表达时间较短，通常在电穿孔后6–12小时达到峰值22，24，35，36。由于转染为瞬时表达，无法进行长期培养实验（如反复刺激检测），因CAR表达会随时间下调。因此，我们建议先通过mRNA电穿孔筛选出最具潜力的CAR构建体，再针对少数候选分子转向稳定的表达系统进行后续研究。
将mRNA电穿孔导入原代细胞是一种多功能技术，可用于在包括外周血单个核细胞（PBMCs）、T细胞、B细胞、NK细胞和树突状细胞在内的多种细胞类型中表达蛋白质（如抗原）。37值得注意的是，另一种用于瞬时CAR递送的方法是脂质纳米颗粒（LNPs）。36,38，可实现&#160;无需病毒载体即可将编码CAR的mRNA或DNA递送至T细胞，并实现无整合的CAR表达。相比之下，睡美人转座子系统39,40,41 无需病毒成分即可实现稳定整合。T细胞转染或转导方式的最适选择取决于预期应用以及可扩展性和生产工艺的考量。基于mRNA的CAR-T细胞已在针对多种不同疾病的临床前和临床研究中成功应用，包括血液系统恶性肿瘤、实体瘤以及自身免疫性疾病。42,43,44瞬时表达的CAR相较于稳定表达的CAR具有优势，因为其表面表达水平有限，可预防或减轻副作用25.
综上所述，该实验流程提供了一种简单、逐步的原代T细胞分离、活化、培养、分析及转染以生成CAR T细胞的方案。该方法易于实施，无需BSL-2级实验室设施，可轻松整合到具备常规分子生物学和细胞培养设备的实验室中。

原代人T细胞是研究T细胞生物学以及开发和评估包括CAR工程在内的细胞疗法的一种生理相关且多功能的模型。与永生化细胞系不同，来自健康供体的T细胞能够更真实地反映T细胞的功能多样性、活化状态、表型异质性及信号转导动态 体内，从而更准确地反映免疫反应和治疗效果1,2此外，最常用的Jurkat T细胞系源自淋巴母细胞白血病，据报道在长期培养过程中会出现基因组不稳定性，这是细胞系中常见的现象。3 虽然T细胞系，包括报告基因细胞系4，可作为早期筛查的有力工具并实现快速读取结果，但使用患者来源的原代T细胞更能真实反映最终应用情况。然而，患者来源T细胞的可获得性有限且质量欠佳，往往限制了其应用，尤其是在临床前产品开发的早期阶段5,6,7使用健康供体的细胞可进一步减少由疾病相关免疫改变及既往治疗所引入的变异，从而能够在多个供体间可重复地评估T细胞功能、活化状态及转基因表达。
鉴于原代T细胞的可获得性，原代T细胞的分离、活化与扩增方案是对其进行遗传操作和功能检测的关键前提。常用的活化策略包括使用包被抗体的磁珠、含有T细胞激动剂的聚合物试剂，或可溶性抗体制剂。通常，这些活化试剂通过CD3复合物模拟生理性T细胞受体（TCR）活化，并通过CD28提供共刺激信号，从而产生比仅通过CD3活化更强的激活效应。8使用CD3/28磁珠可精确控制激活强度及磁珠与细胞的比例。在初始刺激阶段后，磁珠可选择性地从培养体系中去除，或保留在培养体系中以实现持续激活。T细胞通常在三至四周内快速扩增，随后细胞生长速度减缓。相比之下，TransAct含有胶体聚合物基质，过量试剂可通过离心并更换上清液的方式轻松去除。因此，TransAct提供了一种替代方案，可在培养过程中实现均一的T细胞激活，且其刺激强度较CD3/28磁珠更低。然而，其诱导的增殖持续时间约为两周，若需更长时间的扩增，则需进行再次刺激。在使用激活试剂完成T细胞初始激活后，T细胞进入培养与扩增阶段。 体外 在用于实验之前，需要培养一到四周。值得注意的是，激活试剂的种类、细胞因子的选择9,10,11，扩增时间会影响T细胞的绝对数量、表型和活化状态。通常，应首先通过实验测试并确定最佳条件，例如试剂浓度、培养密度、细胞因子添加以及扩增时间，以实现有效的细胞增殖，同时避免引起活化诱导的细胞死亡或T细胞耗竭。本文对两种不同活化方案进行了并行比较，展示了其对原代人T细胞分化和活化特征的影响，以支持研究者在选择活化试剂及实验时间点时做出合理决策。
此外，我们建议使用一种流式细胞术检测方案，可用于分析T细胞的表型组成和活化状态，以支持实验设计。对于原代T细胞的遗传修饰，采用电穿孔法对信使核糖核酸（mRNA）进行瞬时转染，是一种安全、高效且灵活的病毒转导替代方案12。虽然慢病毒载体能够实现转基因的稳定和长期表达，但其需要复杂的生物安全措施，涉及整合至宿主基因组，并可能因整合位点不同而导致表达水平不稳定。此外，慢病毒上清液的制备、T细胞转导以及转导细胞的筛选过程耗时较长。相比之下，mRNA电穿孔可在不发生基因组整合或引入病毒成分的情况下，实现目标基因的快速且瞬时表达，从而降低监管负担，并支持对不同构建体进行快速、迭代式测试。这一优势在早期研发阶段尤为突出，例如需筛选和评估多个CAR候选分子时。近期多项研究已探索将mRNA转染作为治疗性平台13,14,15。我们建议，采用mRNA进行瞬时转染16是一种易于实施的方法，尤其适用于不具备在生物安全二级（BSL-2）环境中开展慢病毒操作条件的实验室。有关慢病毒转导前不同活化方案的平行比较，可参见其他文献报道17。
本方案描述了使用抗CD3/28磁珠或TransAct激活并结合mRNA电穿孔实现短暂CAR表达的方法，用于原代人T细胞的分离、激活、培养、扩增和瞬时转染。所述工作流程可重复地生成具有功能的CAR T细胞，适用于后续应用，如细胞毒性检测、表型表征或 体外 过继性T细胞疗法的建模

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量离心管，高性能</td><td>VWR</td><td>525-1164</td><td></td></tr><tr><td>12孔板，平底，TC处理&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>734-2324</td><td></td></tr><tr><td>24孔板，平底，经组织培养处理</td><td>VWR</td><td>734-2325</td><td></td></tr><tr><td>6孔板，平底，TC处理&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>734-2323</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD 染色液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-568</td><td></td></tr><tr><td>抗Flag DYKDDDDK抗体，APC，REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-119-584</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II 临床流式细胞仪系统</td><td>BD 生物科学</td><td>FACSCanto II</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>默克</td><td>A4503-10G</td><td>重力流分离法</td></tr><tr><td>CD134（OX40）抗体，抗人，REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-126-048</td><td>偶联物：PE</td></tr><tr><td>CD137（4-1BB）抗体，抗人，REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-764</td><td>偶联物：APC</td></tr><tr><td>CD154（CD40L）抗体，抗人，REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-114-142</td><td>偶联物：PerCP-VIO 700</td></tr><tr><td>CD25抗体，抗人，REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-114-541</td><td>偶联物：PE-Vio 770</td></tr><tr><td>CD3 抗体，抗人，REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-132-352</td><td>偶联物：PE-Vio 670</td></tr><tr><td>CD4 抗体，抗人，REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-223</td><td>偶联物：APC-Vio 770</td></tr><tr><td>CD4 微珠，人</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101</td><td>用于重力流分离</td></tr><tr><td>CD45 抗体，抗人，REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-775</td><td>偶联物：VioBlue</td></tr><tr><td>CD45RA 抗体，抗人，REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-132-270</td><td>偶联物：Vio Bright V600</td></tr><tr><td>CD62L 抗体，抗人，REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-127-499</td><td>偶联物：Vio Bright R720</td></tr><tr><td>CD69 抗体，抗人，REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-800</td><td>偶联物：VioGreen</td></tr><tr><td>CD8抗体，抗人，REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-677</td><td>偶联物：FITC</td></tr><tr><td>CD8 微珠，人</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-201</td><td>用于重力流分离</td></tr><tr><td>Cellstar 96孔悬浮培养板，U型底</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650 185</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810&amp;nbsp;R</td><td>Eppendorf</td><td>5811000015</td><td></td></tr><tr><td>CO2 培养箱 ICO150</td><td>Memmert</td><td>ICO150</td><td></td></tr><tr><td>CoolNat 制冰机</td><td>Ziegra Eismaschinen GmbH</td><td>ZBE 30-10</td><td></td></tr><tr><td>Corning CoolCell 冷冻容器</td><td>康宁</td><td>CLS432000</td><td></td></tr><tr><td>计数室，B&amp;uuml;rker-T&amp;uuml;rk 模式，BLAUBRAND</td><td>品牌</td><td>719520</td><td></td></tr><tr><td>CryoPure 管，2 mL，QuickSeal 螺口盖</td><td>Sarstedt</td><td>72,380</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX LX 流式细胞仪</td><td>贝克曼库尔特</td><td>C11185</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核苷酸（dNTP）溶液混合物</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）细胞培养级</td><td>AppliChem</td><td>A3672</td><td></td></tr><tr><td>不含钙、镁的DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads 人 T 细胞激活剂 CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>4 mm间隙电穿孔比色皿，黄色盖</td><td>VWR</td><td>732-1137</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 移液器，0.1&amp;ndash;2.5 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 移液器，100&amp;ndash;1000 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 移液器，2&amp;ndash;20 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 移液器，20&amp;ndash;200 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>默克</td><td>E6758-100G</td><td>用于重力流分离</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL 聚丙烯离心管，锥形底</td><td>康宁</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL 圆底聚苯乙烯试管</td><td>康宁</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 聚丙烯离心管，锥形底</td><td>康宁</td><td>325098</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，经济型 FBS</td><td>Gibco</td><td>A52567-01</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll PM 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4375-10G</td><td>用于密度梯度分离</td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;无菌刻度移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13469108</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell 全系统</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>1652660</td><td>含PC模块和CE模块</td></tr><tr><td>HiScribe T7 ARCA mRNA 试剂盒（含加尾）</td><td>New England Biolabs</td><td>E2060S</td><td></td></tr><tr><td>人IL-15，研究级</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-955</td><td></td></tr><tr><td>人IL-7，研究级</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-367</td><td></td></tr><tr><td>Integra Biosciences Corp&amp;nbsp;PIPETBOY acu 2 移液器辅助器</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0085685</td><td></td></tr><tr><td>LE 琼脂糖</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>重力流分离</td></tr><tr><td>96孔微孔板，聚苯乙烯，V型底，透明，非结合表面</td><td>Greiner Bio-one</td><td>651901</td><td></td></tr><tr><td>Monarch RNA 纯化试剂盒 (50) &amp;mu;g)</td><td>New England Biolabs</td><td>T2040S</td><td></td></tr><tr><td>Monarch Spin PCR &amp;amp; DNA 纯化试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>T1130S</td><td></td></tr><tr><td>MSC-Advantage II级生物安全柜</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>51028226</td><td></td></tr><tr><td>奥林巴斯 IMT-2 显微镜</td><td>斯帕赫光学</td><td>OLYMPUS-IMT2</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 低血清培养基，不含酚红</td><td>Gibco</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Pancoll 人淋巴细胞分离液，密度：1.077 g/mL</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-60100</td><td>用于密度梯度分离</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Q5 高保真 DNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS 分离器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>重力流分离</td></tr><tr><td>RosetteSep 人 T 细胞富集试剂盒</td><td>StemCell Technologies</td><td>15021</td><td>用于密度梯度分离</td></tr><tr><td>Rotiphorese 50x TAE 缓冲液</td><td>Carl Roth</td><td>CL86.2</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基，含 GlutaMAX 补充物</td><td>Gibco</td><td>61870-044</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基，无酚红</td><td>Gibco</td><td>11835030</td><td></td></tr><tr><td>SafeSeal SurPhob 吸头，1000 &amp;micro;L，无菌</td><td>Biozym</td><td>VT0260</td><td></td></tr><tr><td>SafeSeal SurPhob 吸头，20 &amp;micro;L，无菌</td><td>Biozym</td><td>VT0220</td><td></td></tr><tr><td>SafeSeal SurPhob 吸头，200 &amp;micro;L，无菌</td><td>Biozym</td><td>VT0240</td><td></td></tr><tr><td>SafeSeal SurPhob 吸头，10 &amp;micro;升，无菌</td><td>Biozym</td><td>VT0200</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管，标准刻度线，10 mL</td><td>VWR</td><td>612-3700</td><td></td></tr><tr><td>血清学移液管，标准刻度线，2 mL</td><td>VWR</td><td>612-3704</td><td></td></tr><tr><td>移液管，标准刻度线，25 mL</td><td>VWR</td><td>612-3698</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管，标准刻度线，5 mL</td><td>VWR</td><td>612-3702</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管，标准刻度线，50 mL</td><td>VWR</td><td>612-3696</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin 聚苯乙烯 30 mL 容器</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>128A</td><td></td></tr><tr><td>人源 T 细胞激活试剂 TransAct</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-160</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 无 DNase/RNase 灭菌蒸馏水</td><td>Fisher Scientific</td><td>11538646</td><td></td></tr><tr><td>VWR，细胞培养瓶，TC处理，182 cm²&amp;sup2;</td><td>VWR</td><td>734-2315</td><td></td></tr><tr><td>VWR，细胞培养瓶，TC处理，25 cm²&amp;sup2;</td><td>VWR</td><td>734-2311</td><td></td></tr><tr><td>VWR，细胞培养瓶，TC处理，75 cm²&amp;sup2;</td><td>VWR</td><td>734-2313</td><td></td></tr></tbody></table>

分离、培养及瞬时转染人原代t细胞以生成嵌合抗原受体（car）t细胞

Isolation, Cultivation, and Transient Transfection of Primary Human T Cells to Generate Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells

为了评估嵌合抗原受体（CAR）T细胞的疗效与活性，对原代人T细胞进行分离、激活、扩增、表征及基因工程改造至关重要。相较于常用的T细胞系，原代细胞能够提供更为真实的模型系统，因其具有高度异质性、具备介导T细胞杀伤的能力，并能够发生分化。本文提供了原代T细胞培养全过程的逐步操作方案，包括从血液制品中分离T细胞、激活T细胞、 体外 扩增和瞬时转染。我们描述了使用两种不同试剂激活后，原代T细胞在扩增动力学和分化方面的差异，并提供了一套用于流式细胞术分析T细胞表型和活化状态的抗体组合。本文详细说明了通过电穿孔将编码CAR的mRNA转染入人T细胞的操作步骤，以及随时间评估CAR表达动力学的方法。本方案给出了进行CAR T细胞后续效力与功效检测的理想时间点建议，并阐述了不同mRNA用量对信号强度的影响。鉴于该方法具有瞬时表达的特性，可为并行测试和比较多种CAR结构提供一种快速且易于实施的策略。

原代人T细胞的活化与扩增 
原代T细胞在第0天解冻，并使用CD3/28磁珠或TransAct进行活化，随后扩增23天，每2-3天计数一次（图2A）。在计数日，将细胞密度调整至0.3–0.5 × 106 个细胞/mL。在第0、2、5、9、14和20天，取T细胞进行流式细胞术分析，以评估其表型及活化标志物的表达水平。活化后的第一周内，两种活化试剂均能诱导T细胞快速增殖和扩增（图2B），但经TransAct活化的T细胞在后续几天的扩增倍数略低（图2C）。值得注意的是，通过显微镜观察也可看到T细胞的活化现象，表现为T细胞在活化试剂周围形成细胞簇（图2D）。
<img alt="T细胞扩增时间线、实验图表、显微镜图像；CD3/28磁珠法与TransAct方法对比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig2v3.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图2"> 
图2：使用两种不同激活试剂激活并扩增原代T细胞。（A）实验时间线的示意图。细胞在第0天使用CD3/28磁珠或TransAct进行激活，并培养23天。蓝色圆点表示细胞计数的日期，红色圆点表示通过流式细胞术分析细胞的日期，紫色圆点表示同时进行两种分析的日期。（B）和（C）原代T细胞在培养期间的扩增情况：（B）第一周内，或（C）16天内的扩增情况。数据表示来自4名（CD3/28磁珠）或3名（TransAct）不同健康供体的T细胞的平均值±标准差。（D）激活后第1天和第2天激活T细胞的代表性显微图像，可见明显的细胞聚集成簇现象。图像使用倒置显微镜拍摄。标尺对应200 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
T细胞表型及活化标志物的染色 
用于流式细胞术分析的门控策略如下（图3）：首先设置一个门（FSC-Height 对 SSC-Height）以去除细胞碎片和微珠，随后对单个细胞进行门控（FSC-Width 对 SSC-Area）。CD3+细胞的比例应在98–100%范围内。进一步的子门控分析可获得CD4+（辅助性）T细胞和CD8+（细胞毒性）T细胞的比例，并利用标志物CD45RA和CD62L对不同表型的T细胞亚群进行进一步分群。此外，对CD3+ T细胞还分析了其活化标志物（CD25/CD69/CD134/CD137/CD154）的表达情况。
<img alt="流式细胞术设门图解，包含散点图；CD3+ 淋巴细胞分析，CD4/CD8 比值评估。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig3v3.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图 3"> 
图 3：流式细胞术分析的设门策略。展示了一名T细胞供体在第5天经CD3/28磁珠激活后的代表性散点图（n = 4）。缩写：TEMRA = 重新表达CD45RA的效应记忆T细胞；TSCM = 干细胞样记忆T细胞；TEM = 效应记忆T细胞；TCM = 中央记忆T细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
使用CD3/28磁珠活化后，CD4+ T细胞相对于CD8+ T细胞的比例随时间逐渐下降，活化后第5天CD4+ T细胞占74.3%（± 7.4%），至第20天下降至14.6%（± 3.4%）。CD8+ T细胞则从第5天的20.7%（± 6.4%）上升至第20天的82.4%（± 3.1%）（图4A）。使用TransAct活化后也观察到类似趋势，但在第20天时CD8+ T细胞的比例略低（72.5% ± 0.7%）。因此，TransAct活化后观察到的T细胞扩增速度稍慢，对应于扩增期间CD8+细胞比例较低而CD4+细胞比例较高。两种活化试剂引起的T细胞表型组成差异相似（图4B）。然而，重新表达CD45RA的记忆效应T细胞（TEMRA）的频率总体上在CD8+细胞中高于CD4+细胞。相应地，CD4+ T细胞中中央记忆T细胞（TCM）和干细胞样记忆T细胞（TSCM）的比例更高（图4B）。
CD134 是T细胞解冻后即已上调的唯一活化标志物，使用 CD3/28 磁珠活化的T细胞中 CD134+ 细胞比例为 37.6%（± 4.1%），TransAct 活化的T细胞中 CD134+ 细胞比例为 36.1%（±4.4%）（图 4C）。在两种活化策略中，CD25、CD69 和 CD134 均在第2天显著上调。对于 CD3/28 磁珠活化组，CD69 和 CD134 的表达在第2天达到峰值，而 CD25 在第5天达到峰值。TransAct 活化的T细胞也表现出类似结果。CD134 和 CD154 仅在第14天于 CD3/28 磁珠和 TransAct 活化的细胞中均出现上调。总体而言，两种活化试剂所呈现的趋势非常相似。然而，在第14天，CD3/28 活化T细胞的 CD69 表达略高于 TransAct 活化T细胞（97.1% ± 0.9% 对比 86.5% ± 5.1%）。这与 CD3/28 磁珠活化细胞表现出的持续高扩增率相一致。综上所述，所建议的活化标志物组合包含在活化后早期和晚期均上调的标志物，不同活化标志物之间的敏感性有所差异，但两种活化试剂的整体趋势相似。
<img alt="T细胞记忆表型分析；显示CD4/CD8表达的柱状图；频率与时间点的关系。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig4.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图4"> 
图4：在20天培养期间，使用不同激活试剂对T细胞表型及活化标志物表达的分析。（A）使用CD3/28磁珠（左）或TransAct（右）激活后，在培养过程中CD4+/CD8+ T细胞的百分比。（B）使用CD3/28磁珠（左侧两个图）或TransAct（右侧两个图）激活后的T细胞分化情况，分别针对CD4+或CD8+细胞。表型通过标志物CD45RA和CD62L进行评估。TEMRA：CD45RA+ CD62L-，TEM：CD45RA- CD62L-，TCM：CD45RA-CD62L+，TSCM：CD45RA+ CD62L+。（C）使用CD3/28磁珠或TransAct激活后，在扩增期间活化标志物的表达情况。显示的是CD3+ T细胞亲代群体中的频率[%]（来自4名[CD3/28磁珠]或3名[TransAct]不同健康T细胞供体的平均值±标准差）。缩写：TEMRA = 重新表达CD45RA的效应记忆T细胞；TSCM = 干细胞样记忆T细胞；TEM = 效应记忆T细胞；TCM = 中央记忆T细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
原代T细胞的瞬时转染及CAR表达分析 
在使用CD3/28磁珠或TransAct激活后的第7天，通过电穿孔法将mRNA转染至原代T细胞中。所用mRNA模板编码一种靶向软骨素硫酸蛋白聚糖4（CSPG4）的第二代嵌合抗原受体（CAR），其包含CD28共刺激结构域和CD3ζ信号结构域。该CAR序列中包含DYKDDDDK标签（flag标签），以便进行流式细胞术检测。在电穿孔后3、6、24和48小时检测T细胞的存活率及CAR表达水平。染色操作按第6部分实验方案所述进行。
尽管在电穿孔后3小时，CD3/28磁珠和TransAct激活的T细胞活力均较低，但总体而言，转染后CAR T细胞的活力范围为51–85%，且两种激活策略之间无显著差异（图5A）。CAR在电穿孔后的早期阶段即可被检测到。尽管CAR+细胞的比例随时间逐渐下降，但在电穿孔后24小时内可检测到最高频率的CAR+细胞（图5B，左图）。值得注意的是，信号强度在电穿孔后前6小时内保持稳定，之后逐渐下降（图5B，右图）。48小时后CAR表达几乎消失，表明细胞操作具有瞬时性，也凸显了选择早期时间窗口进行下游检测的重要性。一名供体的CAR表达代表性散点图见图5C。对于两种激活试剂，CAR转染细胞与MOCK转染细胞之间的CD4/CD8比例均无差异（图5D）。与我们之前的结果一致，使用CD3/28磁珠激活的T细胞中CD8+ T细胞的比例略高于使用TransAct激活的细胞。由于不同供体间存在较大差异，表型分析仅展示一名代表性供体的结果（图5E）。虽然激活试剂和CD4/CD8状态均会影响T细胞表型，但与MOCK转染细胞相比，CAR表达本身并未引起表型改变。
为了评估mRNA浓度对表达水平的影响，使用0.1、0.3、1、3或6 µg的mRNA将编码GFP突变体（muGFP）的mRNA转染至原代T细胞中。电穿孔后24小时，通过流式细胞术检测GFP信号。结果表明，即使使用低至0.1 µg的mRNA也能检测到GFP信号，并且随着mRNA用量的增加，信号强度呈梯度增强。在我们的实验中，1 µg的mRNA已达到饱和，更高剂量（3和6 µg mRNA）并未进一步增强GFP信号（图5F）。这表明可通过调整mRNA用量来滴定表达水平，该策略在研究不同CAR或靶抗原表达水平的影响时具有重要应用价值28。
<img alt="电穿孔后CAR T细胞的活力和频率；流式细胞术数据分析，mRNA滴定。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig5v3.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图5"> 
图5：CAR表达动力学及转染后CAR T细胞的表型分析。（A）使用编码CAR的mRNA进行电穿孔后CAR T细胞的活力。在染色缓冲液100 µL中加入2 µL 7-AAD，孵育10分钟后评估细胞活力。n = 2–3个独立供体。（B）使用抗DYKDDDDK抗体（与APC偶联，终稀释度1:50）对CAR表达进行染色。在圈选活细胞后，分析CAR阳性细胞占MOCK转染对照组的比例（左图），或分析整个细胞群体的几何平均荧光强度（GeoMean，右图）。图示为n = 3个独立供体的平均值±标准差（S.D.）。（C）来自（B）的一名供体的代表性散点图，显示CAR表达随时间变化的动力学。（D）电穿孔后24小时，对CD4+/CD8+ T细胞进行分析，并比较MOCK转染与CAR转染T细胞以及两种不同激活策略的效果。图示为n = 3个独立供体的平均值±S.D.。（E）电穿孔后24小时，对（B）中所示的MOCK转染和CAR转染T细胞进行表型分析。图示为n = 3个供体中的一个代表性供体。（F）电穿孔后24小时，使用不同量mRNA转染后muGFP表达的分析。在定量GFP的GeoMean前，先对活细胞进行圈选。图示为n = 3个供体的平均值±S.D. 缩写：CAR = 嵌合抗原受体；mRNA = 信使核糖核酸；7-AAD = 7-氨基放线菌素D；RT = 室温；muGFP = 突变型绿色荧光蛋白；S.D. = 标准差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了原代T细胞培养的关键步骤，包括其分离、活化、扩增以及通过mRNA电穿孔进行的瞬时转染。此外，还提出了一套用于流式细胞术分析表型、活化标志物、细胞活力以及嵌合抗原受体（CAR）表达的实验流程和抗体组合。

分离、培养及瞬时转染人原代T细胞以生成嵌合抗原受体（CAR）T细胞

为了评估嵌合抗原受体（CAR）T细胞的疗效和效力，必须对CAR T细胞进行分离、激活、扩增、表征以及遗传学分析……

我们的实验室致力于研究新一代的T细胞疗法，即表达嵌合抗原受体（简称CAR）的T细胞。T细胞系难以充分代表原代人T细胞的多样性。本方案提供了用于分离、改造和分析原代T细胞以生成CAR T细胞的详细指南。实验开始前，获取处于对数生长阶段的原代T细胞，并于实验前一天将其用完全T细胞培养基稀释至密度为0.3 × 10⁶ 个细胞/毫升。转染当天，将所有所需培养基预热至37°C。根据电穿孔后所需达到的终浓度为0.5 × 10⁶ 至1.0 × 10⁶ 个细胞/毫升，计算所需的接种体积。在12孔板中加入完全T细胞培养基，调整至所需密度，并将培养板预热至37摄氏度，直至进行电穿孔。计数T细胞，并计算所需体积，使每份嵌合抗原受体信使核糖核酸递送使用1×10⁶至5×10⁶个细胞。将所需体积的T细胞悬液转移至锥形离心管中。在室温下以300g离心5分钟，弃去上清液。通过在细胞沉淀上加入20毫升含酚红但不含补充物的RPMI培养基，进行第一次洗涤步骤。在室温下以300g离心5分钟，弃去上清液，并重复洗涤两次：第一次使用不含酚红和补充物的RPMI培养基，第二次使用低血清培养基。最后一次洗涤后，用移液器彻底吸除上清液，注意不要扰动沉淀。每份电穿孔样品中，将细胞沉淀重悬于100 µL低血清培养基中。在T细胞最终洗涤步骤期间，从冷冻保存中取出所有所需的mRNA等分试样，并置于冰上保存。标记电穿孔小室和含有预温培养基的培养板，并使用 Gene Pulser Xcell Total System 设置电穿孔仪的参数。选择方波电穿孔程序并设定所需的参数。待 T 细胞悬液准备就绪后，取 100 µL 悬液与每次电穿孔所需的 3 至 5 µg mRNA 混合，轻轻混匀，避免反复吹打。现在，将mRNA和T细胞混合物转移至电穿孔比色皿中。确保悬液完全覆盖比色皿底部，避免反复吹打。接着，迅速将比色皿转移至电穿孔仪中，并使用先前设定的参数进行电穿孔。电穿孔后，向电穿孔杯中加入100微升来自孔板的预热完全T细胞培养基，以恢复T细胞。将细胞转移回孔板中。再用额外的100微升培养基冲洗电穿孔杯，并将冲洗液转移至同一孔中。将转染的T细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。转染后24小时内，将每染色反应50,000至100,000个细胞转移至合适的聚苯乙烯圆底管中。加入一毫升染色缓冲液（含0.5%胎牛血清的磷酸盐缓冲液，即PBS）洗涤细胞。在4°C条件下以300g离心5分钟。从此步骤开始，将细胞置于冰上，并使用预冷的试剂。配制含有染色所需荧光素偶联抗体的混合液。根据需要将抗体稀释至终体积为50微升的染色液中。离心细胞后，通过移液彻底弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。将每份沉淀重悬于50微升已配制好的抗体混合液中。将试管置于4°C避光孵育至少30分钟。每管直接加入1毫升染色缓冲液以洗涤细胞。在4°C下以300×g离心5分钟，并用移液器彻底吸除上清液，去除残留液体。每管中加入 100 微升染色缓冲液重悬细胞沉淀。最后，在开始检测前，每管加入 2 微升 7-Aminoactinomycin D 溶液，充分混匀。室温避光孵育 10 分钟，随后立即进行荧光检测。转染嵌合抗原受体（CAR）T细胞的存活率在51%至85%之间，且CD3/28磁珠激活与TransAct激活的T细胞之间无显著差异。CAR阳性细胞的最高频率在电穿孔后24小时内即可检测到。CAR表达的信号强度在电穿孔后的前六小时内保持稳定，之后逐渐下降。48小时后，CAR表达几乎消失，表明细胞操作具有瞬时性，也凸显了为下游检测选择较早时间窗口的重要性。无论使用哪种激活试剂，CAR转染与MOCK转染T细胞之间的CD4阳性与CD8阳性比例均无差异。与MOCK转染细胞相比，CAR表达未改变T细胞表型。电穿孔转染低至0.1微克的mRNA后24小时即可检测到突变型绿色荧光蛋白信号。随着mRNA用量增加至1微克，信号强度随之增强，而当用量增至3微克或6微克时，信号未进一步增强。一个关键挑战是原代T细胞存在供体依赖性的变异。因此，充足的生物学重复对于确保实验结果的可重复性和可靠解读至关重要。本方案可与CAR T细胞功效分析相结合，包括细胞毒性实验、重复刺激实验，或循环细胞因子的检测，以实现更全面的功能评估。

isolation-cultivation-transient-transfection-primary-human-t-cells-to

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

分离、培养并短暂转染原代人类T细胞，生成嵌合抗原受体（CAR）T细胞

本视频展示了一种制备嵌合抗原受体（CAR）T细胞的技术 离体...

一种用于制备嵌合抗原受体T细胞的离体技术

本视频展示了一种用于体外生成肿瘤抗原特异性嵌合抗原受体（CAR）T细胞的技术。将携带转基因RNA的逆转录病毒载体与脾细胞混合，置于添加白细胞介素-2的培养基中，以促进T细胞的存活与增殖。随后将混合物转移至包被有重组人纤维连接蛋白片段的培养板中，并进行离心，以促进病毒与细胞的融合，从而使RNA整合到宿主基因组中，并表达可靶向肿瘤抗原的细胞表面结合型CAR。...

一种体外生成肿瘤特异性嵌合抗原受体T细胞的技术

本视频演示了一种通过逆转录病毒转导生成抗原特异性嵌合抗原受体（CAR）T细胞的技术。将活化的小鼠CD8+...

一种生成抗原特异性CAR T细胞的技术

我们介绍了一种可靠生成嵌合抗原受体（CAR）T细胞的方法，并在体外和体内检测其分化与功能。...

制造用于过继性免疫治疗的嵌合抗原受体（CAR）T细胞

本文详细介绍了用于临床的嵌合抗原受体T细胞的制备工艺，特别是使用能够进行病毒转导和T细胞培养的自动化细胞处理设备。我们提供了相关建议，并描述了在早期临床试验的工艺开发与实施过程中应注意的潜在问题。...

自动化细胞处理器上的嵌合抗原受体T细胞制备

该方案简化了逆转录病毒载体的制备及小鼠T细胞的转导过程，有助于高效生成小鼠CAR-T细胞。...

高效生成小鼠嵌合抗原受体（CAR）-T细胞

本方案提供了一种简化的流程，用于生成和检测人源嵌合抗原受体调节性T细胞（CAR...

人源嵌合抗原受体调节性T细胞的制备

本方案概述了使用非整合型mRNA生成瞬时嵌合抗原受体（CAR）T细胞以用于癌症免疫治疗的详细步骤，并提供了评估CAR-T细胞及其细胞毒功能的可靠方法。...

一种利用mRNA生成非病毒性短暂嵌合抗原受体T细胞用于癌症免疫治疗的方法

本文介绍了一种制备双乳液滴的方法，该液滴包封单个T细胞和一个癌细胞靶标，用于在单细胞水平上研究细胞杀伤作用。该方法能够在大量T细胞中同时定量检测细胞毒性分子和靶细胞的凋亡情况。...

基于液滴的单细胞水平评估嵌合抗原受体T细胞毒性的检测方法

提供了一种详细的方案，用于利用CRISPR/Cas9技术在原代人T细胞中实现大片段、多顺反子结构的高效靶向敲入。 通过...

非病毒法改造人原代T细胞 通过 同源介导的末端连接靶向整合大型DNA模板

学习分离、培养并短暂转染原代人类T细胞以生成嵌合抗原受体T细胞的方法。该方案涵盖电穿孔转染、流式细胞术表型分析及CAR表达动力学评估，为免疫治疗研究提供快速筛选CAR结构的可靠技术平台。

分离、培养及瞬时转染人原代T细胞以生成嵌合抗原受体（CAR）T细胞

探索更多视频