Name: 抗菌肽及其仿态物的生产与测试 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-10T13:08:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 学习抗菌肽Mel4及其仿态物RK-758的合成、纯化与生物活性评估方法。该方案整合抗菌活性测定与细胞毒性测试，为抗感染药物研发提供标准化、可重复的实验流程。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者谨此致谢新南威尔士大学的马克·温赖特分析中心和重组产品设施（RPF），特别是生物分析质谱设施在高分辨质谱分析方面的支持，以及核磁共振设施在核磁共振仪器使用方面提供的便利。

<ol><li>Naghavi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+bacterial+antimicrobial+resistance+1990%E2%80%932021%3A+a+systematic+analysis+with+forecasts+to+2050%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global burden of bacterial antimicrobial resistance 1990–2021: a systematic analysis with forecasts to 2050.</a> Lancet. 404 (10459), 1199-1226 (2024).</li>
<li>Antimicrobial resistance. , World Health Organization. Available at: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antimicrobial-resistance">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antimicrobial-resistance</a> (2023).</li>
<li>Puri, B., Vaishya, R., Vaish, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+resistance%3A+Current+challenges+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+J.+Armed+Forces+India%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial resistance: Current challenges and future directions.</a> Med. J. Armed Forces India. 81 (3), 247-258 (2025).</li>
<li>Zhang, T., Jin, Q., Ji, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+and+their+mimetics%3A+promising+candidates+of+next-generation+therapeutic+agents+combating+multidrug-resistant+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides and their mimetics: promising candidates of next-generation therapeutic agents combating multidrug-resistant bacteria.</a> Adv. Biol. 9 (4), 2400461(2025).</li>
<li>Pasupuleti, M., Schmidtchen, A., Malmsten, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides%3A+key+components+of+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides: key components of the innate immune system.</a> Crit. Rev. Biotechnol. 32 (2), 143-171 (2012).</li>
<li>Oliveira Júnior, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides%3A+structure%2C+functions+and+translational+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides: structure, functions and translational applications.</a> Nat. Rev. Microbiol. , (2025).</li>
<li>Keshri, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LL-37%2C+the+master+antimicrobial+peptide%2C+its+multifaceted+role+from+combating+infections+to+cancer+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Antimicrob.+Agents%22%5BJournal%5D)">LL-37, the master antimicrobial peptide, its multifaceted role from combating infections to cancer immunity.</a> Int. J. Antimicrob. Agents. 65 (1), 107398(2025).</li>
<li>Alzain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides%3A+mechanisms%2C+applications%2C+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Drug+Resist%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides: mechanisms, applications, and therapeutic potential.</a> Infect. Drug Resist. , 4385-4426 (2025).</li>
<li>Kuppusamy, R., Willcox, M., Black, D. S., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+cationic+peptidomimetic+antimicrobials%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Short cationic peptidomimetic antimicrobials.</a> Antibiotics. 8 (2), (2019).</li>
<li>Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptides+chemistry%2C+manufacturing%2C+and+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Peptide+Science%3A+Chemical+Ligation%2C+Lead+Generation%2C+and+Therapeutic+Advances%22%5BJournal%5D)">Peptides chemistry, manufacturing, and controls.</a> Peptide Science: Chemical Ligation, Lead Generation, and Therapeutic Advances. , 471-508 (2025).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+antimicrobial+peptide+buforin+IIb+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of antimicrobial peptide buforin IIb in Escherichia coli.</a> Biotechnol. Lett. 33 (11), 2121-2126 (2011).</li>
<li>Cai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+synthesis%3A+a+review+of+classical+and+emerging+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Peptide synthesis: a review of classical and emerging methods.</a> Biofabrication. 18 (1), 012001(2026).</li>
<li>Gentilucci, L., De Marco, R., Cerisoli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modifications+designed+to+improve+peptide+stability%3A+incorporation+of+non-natural+amino+acids%2C+pseudo-peptide+bonds%2C+and+cyclization.%C2%A0Curr.+Pharm+pseudo-peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Des%22%5BJournal%5D)">Chemical modifications designed to improve peptide stability: incorporation of non-natural amino acids, pseudo-peptide bonds, and cyclization. Curr. Pharm pseudo-peptide.</a> Des. 16 (28), 3185-3203 (2010).</li>
<li>Kuppusamy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+the+anthranilamide+peptidomimetic+design+to+selectively+target+planktonic+bacteria+and+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Tuning the anthranilamide peptidomimetic design to selectively target planktonic bacteria and biofilm.</a> Antibiotics. 12 (3), 585(2023).</li>
<li>Kuppusamy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanidine+functionalized+anthranilamides+as+effective+antibacterials+with+biofilm+disruption+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Biomol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Guanidine functionalized anthranilamides as effective antibacterials with biofilm disruption activity.</a> Org. Biomol. Chem. 16 (32), 5871-5888 (2018).</li>
<li>Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar+and+broth+dilution+methods+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+%28MIC%29+of+antimicrobial+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.</a> Nat. Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).</li>
<li>Ji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+and+morphology+analysis+of+bovine+serum+albumin+on+a+micropillar-enhanced+quartz+crystal+microbalance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Adsorption and morphology analysis of bovine serum albumin on a micropillar-enhanced quartz crystal microbalance.</a> J. Phys. Chem. B. 128 (41), 10247-10257 (2024).</li>
<li>Yasir, M., Dutta, D., Willcox, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+antimicrobial+peptides+and+ciprofloxacin+against+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Activity of antimicrobial peptides and ciprofloxacin against Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Molecules. 25 (17), (2020).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+determination+of+susceptibility+of+bacteria+to+antimicrobial+agents.+terminology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Infect%22%5BJournal%5D)">Methods for the determination of susceptibility of bacteria to antimicrobial agents. terminology.</a> Clin. Microbiol. Infect. 4 (5), 291-296 (1998).</li>
<li>Saetan, T., Sukwattanasinitt, M., Wacharasindhu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mild+photocatalytic+synthesis+of+guanidine+from+thiourea+under+visible+light%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">A mild photocatalytic synthesis of guanidine from thiourea under visible light.</a> Org. Lett. 22 (20), 7864-7869 (2020).</li>
<li>Woodring, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupting+the+conserved+salt+bridge+in+the+trimerization+of+influenza+A+nucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Disrupting the conserved salt bridge in the trimerization of influenza A nucleoprotein.</a> J. Med. Chem. 63 (1), 205-215 (2019).</li>
<li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production%3A+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).</li>
<li>Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazolium+dyes+as+tools+in+cell+biology%3A+new+insights+into+their+cellular+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Annu.+Rev%22%5BJournal%5D)">Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction.</a> Biotechnol. Annu. Rev. 11, 127-152 (2005).</li>
<li>Deni, W. H., Gao, T., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+reconstituting+peptides%2Fpeptidomimetics+from+DMSO+to+aqueous+buffers+for+circular+dichroism+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for reconstituting peptides/peptidomimetics from DMSO to aqueous buffers for circular dichroism analyses.</a> STAR Protoc. 5 (1), 102850(2024).</li>
<li>Lou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+production+systems+and+optimization+strategies+of+antimicrobial+peptides%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microbial production systems and optimization strategies of antimicrobial peptides: a review.</a> World J. Microbiol. Biotechnol. 41 (2), 66(2025).</li>
<li>Hancock, R. E., Sahl, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+and+host-defense+peptides+as+new+anti-infective+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies.</a> Nat. Biotechnol. 24 (12), 1551-1557 (2006).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文所述方案为阳离子抗菌肽 Mel4（可修改后用于其他抗菌肽）和肽模拟物 RK758 的制备及其功能评价提供了全面的框架。该工作流程结合了多步化学合成或在 E. coli 中的重组表达，以及抗菌活性和细胞毒性检测。这些方法的整合为系统性抗菌肽研究提供了一个多功能平台，能够对化学合成肽与生物表达肽进行直接比较。本方案中的多个步骤对于成功实现肽的制备和活性评估尤为关键。
RK758 是一种基于蒽兰酰胺骨架的合成肽模拟物。在筛选新型抗菌肽（AMP）模拟物的化合物阶段，很难使用 计算机模拟 筛选以设计化合物库。因此，基于能够实现化合物库多样性的骨架来构建这些类似物显得尤为重要。基于此，选择了蒽氨酰胺骨架。采用蒽氨酰胺类骨架的另一个优势在于，RK758的代谢产物5-溴蒽氨酰酸已被证实具有抗菌活性。
先前优化RK758及其类似物结构与抗菌活性的研究采用了不同的合成方法。最初的结构优化研究探讨了不同阳离子基团以及蒽酚酸苯基上的取代基对活性的影响。因此，合成始于异吲哚-1,3-二酮衍生物与L-色氨酸甲酯发生开环反应。随后可对产物进行修饰，如Kuppusamy等人的研究所示15。后续研究进一步考察了疏水基团的结构及其连接位置，结果表明溴代骨架在萘基位置可耐受多种疏水基团，且中间体4在溴代位点可进行Suzuki偶联反应，如图8所示。
当前研究已解决了以往方法存在的一些问题。在图示方法中 图4，尽管中间体11的合成已有报道并进行了纯化 通过 用乙醚进行 trituration（研磨洗涤）后，后续尝试重复该结果时，均得到黏稠的不纯混合物，需经柱层析纯化。此外，采用该方法时，中间体6也需通过柱层析进行纯化。总体而言，原始研究通过六步反应以21%的收率得到中间体7 L-色氨酸甲酯盐酸盐。第二种方法15，尽管产率较低（从 Cbz- 起始为 14%）L-色氨酸），生成的中间产物更易于处理且步骤更少。
本研究发现，将Cbz-L-Trp与N-Boc-乙二胺偶联时需要优化反应条件，以确保产物中无残留DMF，此问题在初始放大反应研究中已被观察到。采用体积比为3:8（v/v）的DMF与DCM混合溶剂体系可减少DMF用量，便于后处理过程中去除；然而，使用氯化溶剂可能引发环境影响方面的担忧。该改进还使产率提高至87%，这可能归因于EDC生成的脲副产物在DCM混合体系中析出，从而推动反应进行。此外，氢化反应也被确认为一个瓶颈步骤，因为此类反应通常产率&#62;90%。本研究发现，以THF替代甲醇作为溶剂后，化合物3的产率达到定量，相较于先前研究中的85%有所提升，同时将反应时间缩短至4小时。这一改进也可能与起始原料纯度更高有关，因为早期研究中可能残留DMF，从而毒化钯催化剂。总体而言，与以往方法相比，从Cbz-L-色氨酸出发经5步反应制备中间体7的总产率已提高至48%。在前期实验（如上所述）中，总产率为21%，后续反应产率为14%；而本研究中化合物7的总产率达到48%，展示了从适当取代的异吲哚酮酸酐衍生物出发可合成结构多样化的类似物。
在氨基苯甲酰胺4中，由于胺基的活性极低（见图8），需要使用三当量的酰氯才能实现高效反应。若仅使用化学计量的酰氯，则4向6的转化不完全，由于中间体4和6在色谱行为和溶解性方面相似，导致纯化困难。作者承认这是该骨架结构的一个局限性，目前正在努力开发新方法以减少所需过量酰氯的使用。
将硫脲8连接到胺7的倒数第二步反应需要使用氯化汞(II)，该试剂具有高毒性，且对环境极为有害，可能限制该方法在大规模合成中的应用。本研究采用了这一方法，因为汞(II)介导的硫脲连接反应可在室温下进行。另一种使用硫脲8的方法涉及对硫原子进行烷基化，随后与胺类底物发生亲核取代反应，如图9所示。此类反应已有文献报道，但在许多情况下需要升高温度并在碱性条件下进行，可能导致底物生成副产物20,21。此外，Saetan等人报道了一种光催化方法，使用结构相似的甲基化硫脲底物20。他们指出，该反应在白色LED光照下于常温进行，适用于多种伯胺和仲胺，产物收率超过80%。对于最后一步反应，通过乙醚研磨后冷冻干燥，通常可获得无需进一步纯化的产品（&#62;95%纯度，由MeOD-d4中的1H NMR测定）。主要杂质为残留的高沸点1,2-乙二硫醇，可通过其特有的类似卷心菜的气味轻易识别。Mel4的重组表达需要在最佳光密度（OD600 0.5–0.6）时诱导，并严格控制诱导温度，以在维持细菌活性的同时最大化包涵体的形成22。
抗菌和细胞毒性检测还包括获得准确、可重复结果所必需的步骤。必须精确制备接种物并进行肽的系列稀释，因为细菌密度或肽溶解度的微小变化都可能显著影响测得的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）值16。在MTT细胞毒性检测中，准确的细胞计数、均匀接种以及甲臜的完全溶解对于获得可靠的代谢读数至关重要23。
针对常见问题，可对实验方案进行若干修改。对于水溶性有限的多肽，可用含0.01%乙酸的溶液溶解16；而多肽或其类似物也可用DMSO溶解24，或添加0.1–0.2% BSA17以防止在测定最小抑菌浓度（MIC）过程中吸附到塑料表面。重组包涵体可通过调节盐酸胍或尿素浓度进行溶解，并随后通过逐步透析实现复性。在MTT实验中，轻柔振荡并确保DMSO完全溶解，可降低吸光度读数的变异性。
本方案的意义在于整合了互补的制备与评价策略，相较于传统的单一方法具有显著优势。许多研究仅专注于一种多肽或类似物的制备方法，但并无一种方法适用于所有化合物；根据多肽的特性选择合适的方法，可确保获得最佳的产率和功能活性。例如，化学合成法能够精确引入非天然氨基酸和多肽模拟物4，而这些在重组表达系统中可能难以实现。相反，重组表达法在制备高阳离子性多肽方面具有成本效益25，而这类多肽在化学合成过程中容易发生聚集。通过将这两种方法与标准化的功能检测相结合，本方案实现了对抗菌肽（AMP）活性和细胞毒性的严格表征，超越了仅使用最小抑菌浓度（MIC）检测的传统范围26。
与传统的独立方法相比，本方案广泛适用于抗菌肽研究及治疗开发。该方案可进行调整，用于探索结构-活性关系、优化肽的活性强度以及评估毒性。此外，这些方法还可支持肽库的高通量筛选、细菌耐药机制的研究，以及与传统抗生素联用的联合疗法评价。除抗菌应用外，该工作流程还可应用于抗病毒或抗真菌肽的测试、用于感染控制的表面涂层，以及生物膜破坏或免疫调节等生物医学应用。
综上所述，本方案为抗菌肽及其肽类类似物的制备、纯化和功能评价提供了一种通用且可重复的实验流程。通过解决关键的方法学问题，提供故障排除策略，并支持多种应用，该方案为抗菌及生物医学研究建立了坚实的基础。

抗菌耐药性（AMR）已成为一项重大的全球健康威胁1。根据世界卫生组织（WHO）的数据，2019年AMR直接导致约127万人死亡，并与全球约495万例死亡相关2。现有抗生素的过度使用和不当使用加剧了多重耐药病原体的出现，导致针对细菌、真菌、病毒和原生动物等微生物的治疗选择极为有限2,3。这一AMR危机促使人们开始寻找有效、稳定且不易引发耐药性发展的替代抗菌策略。其中最具前景的候选者是抗菌肽（AMPs）及其合成类似物4。
抗菌肽（AMPs）是一类天然存在的分子，在人类、动物和植物的先天免疫系统中发挥着至关重要的作用5。它们通常通过破坏细胞膜、干扰微生物代谢以及调节免疫反应等机制，表现出广谱的抗菌活性6。例如，人源防御素肽LL-37已被证实对细菌、真菌和病毒均具有强效活性7。然而，尽管其具有良好的应用前景4，天然AMPs的大规模临床应用常受限于其天然丰度较低。此外，从天然来源获取具有活性形式的AMPs也存在挑战，因为许多肽类需要特定的翻译后修饰才能具备功能活性8。
为克服天然抗菌肽（AMPs）相关的局限性，研究人员已开发出合成类似物和肽模拟物。这些模拟物可以是小分子、经过合理设计的化合物，能够在保留天然抗菌肽抗菌功效的同时，提供更优的稳定性、选择性和药代动力学性能9。
近年来，肽化学和分子生物学的进步使得通过固相肽合成（SPPS）、液相肽合成（LPPS）以及重组表达系统等方法高效制备抗菌肽（AMPs）成为可能，从而能够精确控制序列组成、电荷分布和两亲性等关键结构参数10。重组表达系统适用于大规模生产以及较长或更复杂的多肽。一旦优化完成，重组方法——通常采用发酵或生物反应器系统——可为治疗性肽的工业化生产提供一种经济且可放大的途径11。
本文展示了抗菌肽（AMPs）及其模拟物的制备与评价的互补方法。尽管固相化学合成法广泛用于多肽的合成，但对于较长序列或高度阳离子化的多肽，由于易发生聚集、产率低以及纯化困难，该方法可能效率低下且成本较高12。相比之下，化学合成在生成具有精确结构修饰和非天然氨基酸残基的短肽模拟物方面仍具有显著优势13。而重组表达系统则能够在微生物宿主中实现较长或结构复杂多肽的低成本、可放大的生物合成，克服了完全依赖化学合成时在长度和产率方面的限制12。通过整合化学与生物生产策略，这种联合方法框架比单独使用任一方法具有更高的灵活性、可扩展性和转化潜力，特别适用于机制研究和治疗开发。
在化合物制备完成后，通过两项关键实验对其进行生物学评价。抗菌活性实验用于测定每种肽或模拟物对代表性微生物的抑制能力，从而揭示其抗菌谱和活性强度。毒性实验则利用哺乳动物细胞系评估其细胞相容性，以确保其安全性和选择性。通过整合实验步骤的设计、合成及功能测试，本实验方案为表征抗菌肽（AMPs）及其合成类似物的有效性与安全性提供了全面的框架。这些方法共同建立了一套系统性的策略，用于开发和验证新型抗菌剂，以应对日益严峻的全球抗菌耐药性（AMR）挑战。

<table><tbody><tr><td>1,2-乙二硫醇</td><td>奥克伍德&amp;nbsp;</td><td>M03555</td><td></td></tr><tr><td>100倍抗生素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5955-20ML</td><td></td></tr><tr><td>1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐</td><td>组合模块</td><td>SS-7536</td><td>下文简称EDC</td></tr><tr><td>2-萘甲酰氯</td><td>组合模块</td><td>OR-0173</td><td></td></tr><tr><td>乙酸&amp;nbsp;</td><td>Ajax Finechem</td><td>R18401O</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>20060.35</td><td></td></tr><tr><td>碱性磷酸酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0525S</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1933</td><td></td></tr><tr><td>阳离子调节的穆勒-欣顿肉汤（CAMHB）</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>212322</td><td></td></tr><tr><td>Cbz-L-Trp</td><td>组合模块</td><td>QB-6691</td><td></td></tr><tr><td>多粘菌素E&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4461</td><td></td></tr><tr><td>Dey-Engley（D/E）中和肉汤</td><td>Oxoid</td><td>R453042</td><td></td></tr><tr><td>硅藻土（Celite 545）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>102693</td><td>0.02–0.1 mm 粒径</td></tr><tr><td>二氯甲烷（DCM）</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>23366.327</td><td></td></tr><tr><td>乙醚</td><td>Chem-Supply</td><td>EA036</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Chem-Supply 公司&amp;nbsp;</td><td>LCS-CHEM-0098</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>J15397.03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM培养基</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>UCS-BIO-0058</td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌BL21(DE3)宿主</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70235-M</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>NEON1SK</td><td></td></tr><tr><td>乙酸乙酯</td><td>Chem-Supply</td><td>EA011-2.5L-P</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>118432500</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12003C-500ML</td><td></td></tr><tr><td>带 His 标签的 TEV 蛋白酶&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4455</td><td></td></tr><tr><td>羟基苯并三唑水合物</td><td>Chem-Implex</td><td>24755</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>288-32-4</td><td></td></tr><tr><td>异丙基 &amp;beta;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani 培养基（LB）&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12795027</td><td></td></tr><tr><td>裂解缓冲液&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>89822</td><td></td></tr><tr><td>氯化汞（II）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>215465</td><td></td></tr><tr><td>甲醇（HPLC 级）</td><td>VWR</td><td>A452-4K</td><td></td></tr><tr><td>MTT试剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2128-100MG</td><td></td></tr><tr><td>N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3440</td><td></td></tr><tr><td>N,N-二甲基甲酰胺（DMF）</td><td>Chem-Supply</td><td>RP1051</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ND-ONE</td><td></td></tr><tr><td>N-Boc-乙二胺</td><td>组合块</td><td>AM-1613</td><td></td></tr><tr><td>NTA亲和树脂柱</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70666</td><td></td></tr><tr><td>碳载钯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>205699</td><td>10% w/w Pd</td></tr><tr><td>质粒纯化试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯微量滴定管&amp;nbsp;</td><td>SARSTEDT&amp;nbsp;</td><td>72.690.008</td><td></td></tr><tr><td>用于快速柱层析的硅胶</td><td>Silicycle</td><td>R12030B</td><td>硅胶 60，230-400 目&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>硅胶薄层色谱板</td><td>默克</td><td>1055540001</td><td>0.2 毫米厚铝背衬层，含 254 纳米荧光指示剂</td></tr><tr><td>0.2 M 磷酸钠缓冲液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>J63816.AP</td><td></td></tr><tr><td>带盖无菌平底96孔聚丙烯微孔板</td><td>康宁</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>三乙胺（Et3N）</td><td>Chem-Supply</td><td>TR02151000</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸（TFA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>J62848.AK</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A16046.AE</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>MP BIOMEDICALS 澳大利亚有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049-500ML</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆琼脂&amp;nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>211043</td><td></td></tr><tr><td>尿素&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>29700</td><td></td></tr><tr><td>载体（T7 启动子）</td><td>-</td><td></td><td>高拷贝数质粒</td></tr></tbody></table>

抗菌肽及其模拟物的制备与检测

Production and Testing of Antimicrobial Peptides and Their Mimics

抗菌肽（AMPs）及其合成模拟物正成为传统抗生素的有前景替代品，尤其在应对日益严重的抗菌素耐药性威胁方面。天然存在的AMPs是先天免疫系统的重要组成部分，对多种微生物病原体具有广谱抗菌活性；而其合成模拟物，包括肽拟似物和基于聚合物的类似物，则旨在增强稳定性、降低毒性并改善药代动力学特性。本研究旨在展示AMPs及小分子肽模拟物的制备、表征与生物学评价。AMPs通过重组表达系统或固相肽合成方法获得，从而实现对氨基酸序列和结构特性的精确控制。小分子肽模拟物则采用化学合成策略制备，其中包括使用蒽氨酰酸（2-氨基苯甲酸）骨架以增强结构稳定性和药理性能。合成后的化合物在进行生物学测试前需经过纯化和化学表征。抗菌活性通过以下方法评估： 体外 最小抑菌浓度（MIC）测定，以及针对哺乳动物细胞系进行细胞毒性评估以确定选择性。代表性结果表明，抗菌肽及其模拟物均表现出对 肺炎克雷伯菌 和 大肠杆菌，突显其广谱抗菌潜力。总体而言，本方案为抗菌肽及其类似物作为新一代抗感染药物的开发与系统性评价提供了全面且可重复的框架。

RK758的合成 
中间体7之前的分析数据已发表过14。RK758及中间体8–9的分析数据如下：
叔-丁基 (2-(3-苯基硫脲基)乙基)氨基甲酸酯 (8)： 
产物 8 为类白色固体（1.89 g，87%）；熔点 167.4–168.3 °C；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 9.58 (s, 1H), 7.71 (s, 1H), 7.44–7.29 (m, 4H), 7.11 (t, J = 12.0 Hz, 1H), 6.88 (br s, 1H), 3.55–3.53 (m, 2H), 3.13 (q, J = 4.0 Hz, 2H), 1.59 (s, 9H)；13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ 180.9, 156.3, 139.5, 129.1, 124.7, 123.7, 78.2, 44.3, 28.7；HRMS (ESI+)：m/z 计算值 C14H21N3O2SNa+ [M + Na]+：318.1247，实测值：318.1252。
叔丁基 (S,Z)-(3-((1H-吲哚-3-基)甲基)-1-(2-(2-萘甲酰胺基)-5-溴苯基)-1,4-二氧代-9-(苯基亚氨基)-2,5,8,10-四氮杂十二烷-12-基)氨基甲酸酯 (9)： 
产物 9 为白色固体（0.253 g，产率 62%）；熔点 173.4–174.9 °C；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 12.23（s，1H），10.86（s，1H），9.61（s，1H），9.27（d，J = 8.0 Hz，1H），8.57–8.54（m，2H），8.44（s，1H），8.11（d，J = 4.0 Hz，1H），8.06–8.03（m，3H），7.84（dd，J = 4.0, 12.0 Hz，1H），7.78（d，J = 12.0 Hz，2H），7.69–7.60（m，2H），7.36（t，J = 8.0 Hz，2H），7.27–7.23（m，5H），7.01–6.97（m，3H），4.82–4.78（m，1H），3.14–3.13（m，10H），1.32（s，9H）；13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ 172.3，167.8，165.1，156.3，154.4，138.9，136.5，135.4，134.9，132.6，131.7，129.9，129.1，128.7，128.4，128.2，127.6，127.6，126.4，124.8，124.1，123.6，122.8，121.4，118.9，118.7，115.1，111.8，110.9，78.4，55.2，42.3，41.9，39.4，38.3，29.5，28.6，27.9；HRMS（ESI+）：m/z 计算值 C45H47BrN8O5 [M + H]+：859.2926，实测值：859.2925。
(S,E)-N-(2-((1-((2-(3-(2-氨基乙基)-2-苯基胍基)乙基)氨基)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基)甲酰胺基)-4-溴苯基)-2-萘甲酰胺 (RK758) (10)： 
RK758 为类白色固体（0.039 g，产率 75%）；熔点 240.0–240.9 °C；1H NMR （400 MHz，MeOD-d4）：δ 8.39 (s, 1H), 8.27 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 7.98–7.95 (m, 3H), 7.88 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 7.71–7.60 (m, 4H), 7.40 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.30–7.20 (m, 4H), 7.16 (s, 1H), 7.05–6.97 (m, 2H), 4.88–4.86 (m, 1H), 3.33–3.32 (m, 3H), 3.27–3.24 (m, 5H)；13C NMR （100 MHz，MeOD-d4）：δ 174.3, 168.5, 166.4, 154.6, 137.1, 136.7, 135.1, 134.7, 131.4, 132.6, 131.3, 130.8, 129.8, 128.9, 127.97, 127.8, 127.9, 127.6, 127.5, 127.2, 126.8, 125.6, 123.5, 123.24, 123.2, 118.6, 117.8, 116.1, 111.1, 109.6；HRMS (ESI+)：m/z 计算值 C40H39BrN8O3 [M + H]+：759.2401，实测值：759.2407。
RK758 的合成以 Cbz-L-色氨酸为起始原料，经过 7 步反应，总收率为 17%（图 4）。该路线至关键中间体 7 的总收率为 44%，至 RK758 的总收率为 19%。1H NMR 数据表明最终化合物纯度较高，未检测到主要杂质。
菌落PCR筛选证实，在所选转化子中成功插入了Mel4和His-KSI-Mel4表达盒（图5A）。对质粒小提物进行的PCR分析进一步验证了预期扩增片段的大小，表明在转入BL21(DE3)菌株进行表达前，目标重组质粒已正确构建（图5B）。
高阳离子抗菌肽 Mel4 的重组表达与纯化 
尽管 Mel4 是从 AusPep 肽公司商业获得，纯度不低于 90%，其最初通过固相肽合成（SPPS）方法制备，但本研究也采用了重组表达策略以实现 Mel4 的生物合成。在本实验方案结束时，通过对裂解菌体沉淀获得的总细胞蛋白（TCP）进行 Western 印迹分析，证实了 HIS-KSI-Mel4 融合蛋白的成功表达。蛋白样品经 SDS-PAGE 分离，并使用蛋白分子量标准参照物进行显影。观察到一条与预期分子量相符的清晰条带，表明目标蛋白在宿主细胞中成功表达（图 5B）。
根据所选基序的蛋白质序列，计算了理论氨基酸组成，并与从纯化的HIS-KSI-TEV-Mel4包涵体肽获得的实验氨基酸分析结果进行了比较。比较结果显示，预测的氨基酸比例与实验测定值之间具有良好的相关性，证实了表达肽序列的准确性及其在包涵体组分中成功分离（表2）。
天冬酰胺转化为天冬氨酸，谷氨酰胺转化为谷氨酸。氨基酸分析方法对半胱氨酸和色氨酸不敏感，因此这些氨基酸无法通过该方法进行分析。在分析结果时必须考虑这一因素。
Mel4 与 RK758 的抗菌活性 
RK758、Mel4 和多粘菌素对两种革兰氏阴性菌株 K. pneumoniae JIE 2709 和 E. coli NCTC 13846 的最低抑菌浓度（MIC）进行了评估（表 3）。RK758 对 K. pneumoniae 和 E. coli 的 MIC 均为 16 µg/mL（21 µM）。相比之下，Mel4 对 K. pneumoniae 的 MIC 为 62.5 µg/mL（26.6 µM），对 E. coli 为 125 µg/mL（53.2 µM），表明其活性低于 RK758。以多粘菌素作为对照抗生素，其对 K. pneumoniae 的 MIC 最低，为 1 µg/mL（0.87 µM），而对多粘菌素耐药的 E. coli 参考菌株的 MIC 为 8 µg/mL（6.9 µM）。
Mel4 和 RK758 的细胞毒性效应 
采用MTT法评估Mel4和RK758在连续浓度作用24小时后对L929小鼠成纤维细胞（ATCC CCL-1）的细胞毒性。两种化合物均表现出典型的S型剂量-反应曲线，通过非线性回归（“inhibitor”模型）进行分析。 与 归一化响应 - 变量斜率”模型（GraphPad Prism，版本 9.5.1），证实对细胞活力的浓度依赖性抑制。RK758 显示出 CC50 172.6 µM，而Mel4表现出略高的细胞毒效价，其CC50 147.5 µM，比RK758的细胞毒性约高1.17倍图6 和 图7).
<img alt="带有T7启动子、KSI融合蛋白和T7终止子的质粒图谱中的基因表达示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70178/70178fig1.jpg" data-altupdatedat="1779768095000" data-alt="图1"> 
图1： p15TV-L-His-KSI-Mel4表达盒的示意图。 p15TV-L表达载体的示意图，显示了T7启动子、核糖体结合位点（RBS）、6×His纯化标签、酮类固醇异构酶（KSI）融合伴侣、TEV蛋白酶切割位点以及Mel4肽序列，其后为T7转录终止子。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70178/70178fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="SDS-PAGE凝胶电泳；蛋白质分离；蛋白标准品、过滤后、穿流液；kDa分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70178/70178fig2.jpg" data-altupdatedat="1779768095000" data-alt="图2"> 
图2：重组蛋白表达的SDS-PAGE和Western印迹分析。（A）粗细胞裂解液经过滤及穿流后的包涵体和总细胞蛋白的SDS-PAGE分析。（B）总细胞蛋白的Western印迹分析。绿色箭头指示目标蛋白在预期分子量处的位置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70178/70178fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="BCA 蛋白定量柱状图，蛋白浓度，包涵体与 TEV 切割比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70178/70178fig3.jpg" data-altupdatedat="1779768095000" data-alt="图 3"> 
图 3： TEV 切割前后重组蛋白的定量分析。 柱状图显示通过 BCA 法测定的分离包涵体组分以及 TEV 蛋白酶处理后获得的切割型重组 Mel4 的蛋白浓度。误差线表示测量之间的实验变异。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70178/70178fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="RK758 合成路径图，展示化学反应、方程式和中间体。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70178/70178fig4.jpg" data-altupdatedat="1779768095000" data-alt="图 4"> 
图 4： 获得 RK758 的整体合成路线。 反应方案概述了从 Cbz-L-色氨酸出发，经七步化学合成制备 RK758 的过程，包括中间体的形成、官能团转化以及最终去保护以获得肽模拟物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70178/70178fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示DNA标记物和His-KSI-Mel4条带以进行大小比较的电泳凝胶结果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70178/70178fig5.jpg" data-altupdatedat="1779768095000" data-alt="图5"> 
图5：重组质粒的琼脂糖凝胶电泳。（A）His-Mel4和His-KSI-Mel4转化子的菌落PCR结果。（B）质粒小量提取后进行PCR验证。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70178/70178fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞活力随浓度变化的曲线；CC&lt;sub&gt;50&lt;/sub&gt; 为 172.6 µM；对细胞产生半最大效应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70178/70178fig6.jpg" data-altupdatedat="1779768095000" data-alt="Figure 6"> 
图6．RK758对L929成纤维细胞的细胞毒性。剂量-反应曲线显示了RK758在不同浓度下对细胞活力的影响。 CC50值通过GraphPad Prism软件使用“抑制剂与标准化反应—可变斜率”模型进行非线性回归分析计算得出，证实RK758对细胞活力的抑制作用具有浓度依赖性。数据表示三次独立生物学重复实验的平均值±标准差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70178/70178fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="细胞活力与浓度关系图，CC50 为 147.5 μM，对数刻度，细胞毒性分析结果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70178/70178fig7.jpg" data-altupdatedat="1779768095000" data-alt="图 7"> 
图 7：Mel4 对 L929 细胞的细胞毒性。剂量-反应曲线显示 Mel4 对细胞活力的浓度依赖性效应。 CC50 值通过 GraphPad Prism 中的“抑制剂与标准化反应—可变斜率”模型进行非线性回归分析计算，证实 Mel4 对细胞活力的抑制作用具有浓度依赖性。数据表示三次独立生物学重复实验的平均值 ± 标准差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70178/70178fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示Suzuki交叉偶联步骤、反应、化合物及产率的化学合成示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70178/70178fig8.jpg" data-altupdatedat="1779768095000" data-alt="图8"> 
图8： 从Cbz-L-色氨酸出发的改进合成策略。 该替代合成路线展示了使用Cbz-L-色氨酸制备蒽酰胺中间体，并通过后续官能团化步骤实现结构多样化的途径。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70178/70178fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用CH3I和胺合成咪唑的化学反应图解，展示结构变化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70178/70178fig9.jpg" data-altupdatedat="1779768095000" data-alt="图9"> 
图9：硫脲的烷基化反应，随后与胺类底物发生亲核取代反应。 提出的反应路径包括硫脲硫原子的烷基化，随后与胺类底物发生亲核取代反应，生成含胍基的产物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70178/70178fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>部分</td>
			<td>名称/特征</td>
			<td colspan="4">序列</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>引物</td>
			<td>XbaI_KNRPR_Start</td>
			<td colspan="4">5’-TAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATT-3’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>T7_TERM_REV</td>
			<td colspan="4">5’-CCAAGGGGTTATGCTAGTTATTGCTCA-3’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>基因盒</td>
			<td>His-KSI-Mel4 氨基酸序列</td>
			<td colspan="4">MDHHHHHHMIDETQRKATVLEYFERVNAKDLDGVVKLF 
			ATDAVVADPVGAPPVAGEEALRAYFQRVLHEFDTHDVPGV 
			PSGAQDGQSVALPLKATINNPQDPTGGVRLDVNLVSVFTIG 
			EDGLISEMRAYWGLTDIAPAGASSGRENLYFQGKNKRKRRR 
			RRRGGRRRR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>DNA 序列</td>
			<td colspan="4">5’-TAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGA 
			GATATACCATGGATCACCACCACCATCACCACATGATTGACGAGAC 
			GCAACGTAAAGCGACGGTCTTAGAGTATTTTGAACGCGTGAATGCAA 
			AAGACTTGGATGGCGTGGTTAAACTCTTTGCGACGGACGCCGTTGT 
			AGCCGACCCTGTTGGTGCACCACCAGTGGCTGGTGAGGAGGCACTC 
			CGTGCCTACTTCCAGCGCGTCTTGCATGAATTTGACACCCATGATGTCC 
			CGGGCGTTCCATCTGGTGCTCAGGATGGCCAATCAGTCGCACTCCCAC 
			LTTAAAGCAACCATCAACAATCCTCAAGATCCAACAGGCGGGGTCCGCC 
			TTGATGTGAACTTAGTGAGCGTATTCACGATTGGCGAAGACGGGTTAAT 
			CTCCGAGATGCGTGCGTACTGGGGGTTGACTGATATTGCTCCGGCAGGT 
			GCAAGCAGTGGTCGCGAGAACTTGTACTTCCAAGGTAAGAACAAGCGTA 
			AGAGACGCCGGCGCCGCCGGGGAGGACGGAGACGTCGCTAATCGAAC 
			TCGAGATCCGGCT-3’</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：用于PCR验证及最终质粒构建体全基因盒序列的引物序列。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>氨基酸</td>
			<td>计算值</td>
			<td>实测值</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组氨酸 </td>
			<td>4.70%</td>
			<td>4.70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>丝氨酸</td>
			<td>3.60%</td>
			<td>3.40%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>精氨酸</td>
			<td>10.70%</td>
			<td>9.20%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>甘氨酸 </td>
			<td>9.50%</td>
			<td>11%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>天冬氨酸</td>
			<td>11.30%</td>
			<td>11.50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>谷氨酸 </td>
			<td>8.90%</td>
			<td>8.90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>苏氨酸 </td>
			<td>4.70%</td>
			<td>4.60%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>丙氨酸</td>
			<td>9.50%</td>
			<td>9.70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>脯氨酸</td>
			<td>5.30%</td>
			<td>5.30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>赖氨酸</td>
			<td>4.10%</td>
			<td>4.50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>酪氨酸</td>
			<td>2.40%</td>
			<td>2.20%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>甲硫氨酸</td>
			<td>1.80%</td>
			<td>1.90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>异亮氨酸</td>
			<td>3.00%</td>
			<td>3.20%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>亮氨酸</td>
			<td>7.10%</td>
			<td>7.40%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>苯丙氨酸</td>
			<td>3.60%</td>
			<td>3.60%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>缬氨酸</td>
			<td>9.50%</td>
			<td>8.90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>色氨酸</td>
			<td>0.60%</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：氨基酸组成分析。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">细菌菌株</td>
			<td colspan="3">MIC µg/mL (µM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RK758</td>
			<td>Mel4</td>
			<td>Colistin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K. pneumoniae JIE 2709</td>
			<td>16 (21)</td>
			<td>62.5 (26.6)</td>
			<td>1 (0.87)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli NCTC 13846</td>
			<td>16 (21)</td>
			<td>125 (53.2)</td>
			<td>8 (6.9)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3： RK758、Mel4和多粘菌素对革兰氏阴性菌的最小抑菌浓度（MIC）。

本方案描述了一种制备并评估阳离子肽Mel4及肽模拟物RK758的抗菌活性与细胞毒性的方法。通过整合化学合成、重组表达及标准化功能检测，该方法为肽类分子及小分子模拟物的制备与测试提供了简化的操作流程。

抗菌肽（AMPs）及其合成类似物正成为传统抗生素的有前景替代品，尤其是在应对……

本方案描述了一种合成阳离子肽Mel4及肽模拟物RK-758并检测其抗菌活性与细胞毒性的方法。以往发表的研究较为零散且缺乏标准化，限制了实验的可重复性与转化应用。本研究将合成、生物学检测和机制研究整合为一个统一的工作流程。首先，获取蒽酰胺肽模拟物 RK-758 和高阳离子抗菌肽 Mel4。将肽类溶于无菌水中，配制成 20 毫摩尔的高浓度溶液，并使用 0.22 微米针头滤器对肽储备液进行过滤除菌。将待测的细菌分离物划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂平板上，以获得纯且分离良好的单菌落。将平板在约36摄氏度条件下有氧培养18至24小时。次日，使用无菌接种环选取3至5个形态相似且分离良好的菌落。将菌落转移至含有5至10毫升阳离子调节的Mueller Hinton肉汤的无菌试管中，轻轻摩擦接种环于倾斜试管内壁，以获得均匀的菌悬液。将肉汤培养物在约36摄氏度、180转/分钟振荡条件下培养18至24小时。培养结束后，在25摄氏度下以3000 ×g离心过夜培养物10分钟。弃去上清液，并用无菌PBS洗涤菌体沉淀三次。向无菌容器中加入两毫升磷酸盐缓冲液（PBS）。加入50至100微升洗涤后的细菌悬液，涡旋混匀5到10秒。取200微升该细菌悬液加入96孔板中，并加入等体积的PBS作为空白对照。使用分光光度计在600纳米处测定光密度。目标吸光度值为0.1，相当于约每毫升1至2×10⁸个菌落形成单位。将调整后的细菌悬液以1:100的比例稀释于阳离子调节的穆勒-欣顿肉汤中，以获得终浓度约为每毫升10⁶个菌落形成单位的接种物。用无菌平底96孔板，标记细菌菌株、抗菌肽名称、日期及科研人员姓名缩写。在板盖上标明测试孔、空白孔和对照孔的位置。将最高浓度的抗菌肽溶液200微升加入到板的第一列中，然后从第二列至第十二列的其余各孔中每孔加入100微升阳离子调节的Mueller-Hinton肉汤。使用多通道移液器，将抗菌肽从第一列到第十列进行两倍系列稀释。接着，除空白孔外，向其余各孔加入100 µL浓度为10⁶ 菌落形成单位/毫升的制备好的细菌接种物。向空白孔中加入100 µL未调节阳离子的Mueller Hinton肉汤，使最终体积达到200 µL。用培养皿盖盖好，并用封口膜密封以防止蒸发。在36°C条件下孵育18至24小时。孵育结束后，使用酶标仪测定每孔在600纳米处的光密度。计算相对于未处理生长对照的生长抑制百分比，并确定最低抑菌浓度。随后确定最低杀菌浓度。将L-929小鼠成纤维细胞接种于一个75平方厘米的培养瓶中，培养基为添加了10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素（包括硫酸链霉素和青霉素G）的DMEM。在37°C、5%二氧化碳条件下培养细胞，直至细胞融合度达到75%至80%。待细胞融合后，用 PBS 洗涤细胞，然后加入 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 使细胞脱落。取 50 微升细胞悬液与 50 微升 0.4% 台盼蓝混合，将 10 微升混合液加入血细胞计数板中。计数血细胞计数板四个角的方格中的活细胞（未染色）和死细胞（蓝色），并使用公式计算细胞活力。接着，用DMEM将细胞终浓度调整为每毫升5×10⁴个细胞。将100 µL细胞悬液接种至无菌96孔板的每个孔中，在37°C、5% CO₂条件下培养24小时，使细胞贴壁。接下来，使用先前配制的母液，在不含FBS和抗生素的DMEM中配制Mel4和RK-758的工作液。随后，吸去每孔中的培养基，并向各孔中加入100 µL相应的工作液。然后，向对应的孔中分别加入100 µL DMEM作为阴性对照，DMSO作为阳性对照，PBS作为空白对照。在 Mel4 或 RK-758 处理 24 小时后，小心吸出培养基，避免扰动 L-929 小鼠成纤维细胞。用普通 DMEM 将 5 毫克/毫升的 MTT 储存液稀释 9 倍，配制成 0.5 毫克/毫升的 MTT 工作液。向每个孔中加入 100 微升配制好的 MTT 工作液。用铝箔覆盖培养板，在37摄氏度下孵育两小时，直至出现紫色甲臜结晶。孵育结束后，在显微镜下观察细胞中是否有紫罗兰色沉淀生成。小心移除各孔中的MTT溶液，每孔加入100 µL DMSO以溶解甲臜结晶。将培养板置于摇床上振荡五分钟，以确保完全溶解，并使用酶标仪在570纳米处测定吸光度。减去空白对照的吸光度值后，利用公式计算细胞活力，随后计算IC50或CC50值。RK-758对克雷伯菌的最低抑菌浓度为16微克/毫升。肺炎克雷伯菌 JIE 2709 和大肠杆菌 NCTC 13846 菌株。Mel4 对肺炎克雷伯菌的最低抑菌浓度为 62.5 微克/毫升，对大肠杆菌的最低抑菌浓度为 125 微克/毫升。作为对照抗生素使用的多粘菌素E对肺炎克雷伯菌的最低抑菌浓度为每毫升1微克，对多粘菌素耐药的大肠杆菌参考菌株的最低抑菌浓度为每毫升8微克。RK-758在L-929成纤维细胞中表现出浓度依赖性的细胞活力抑制作用，其CC50值为172.6微摩尔。Mel4在L-929细胞中的细胞毒性略高于RK-758，其CC50值为147.5微摩尔。本实验方案展示了肽模拟物RK-758的可扩展化生产，以及对肽类及其模拟物的评估，为后续药物发现提供支持。后续分析可包括相关模型中的机制研究、稳定性测试、制剂优化、耐药性产生以及高级疗效研究。进一步的研究可致力于多肽模拟物的绿色生产，提高成本效益，并评估其在体内的疗效、安全性及临床转化潜力。

production-and-testing-of-antimicrobial-peptides-and-their-mimics

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

抗菌肽及其仿态物的生产与测试

肽类叔酰胺（PTAs）是一类包含但不限于肽、肽拟物和N-甲基化肽的肽模拟物超家族。本文描述了一种结合了 结合裂分-混合与单体前体策略，合成单珠单化合物的PTA库。...

裂分与混合合成及肽类叔酰胺库的表征

本文概述了一种利用微波辐射合成环肽的简单且通用的方法。该方法能够在保留侧链和药效团部分的同时，合成具有多种不同构象的骨架环肽，从而可用于筛选生物活性构象。...

利用微波辐射构建骨架环状肽库作为潜在抗寄生虫治疗药物

本文介绍了快速筛选和表征具有抗菌活性酶的实验方案。微载玻片扩散法和染料释放法利用目标细菌作为底物，分别对酶活性进行定性和定量评估。...

定性与定量检测及表征蛋白质类抗菌物质的实验方法

本文介绍了一种在同一序列中合成具有混合阳离子功能的肽模拟物（赖氨酸型和精氨酸型单体）的方案，并描述了这些化合物对引起皮肤利什曼病的原虫寄生虫Leishmania...

一种高效合成含混合型赖氨酸/精氨酸单体的肽拟物及其抗利什曼原虫活性评价方法

一种简便且可适应的肉汤微量稀释法，用于筛选抗真菌化合物和提取物。...

微量肉汤稀释法 体外 筛选：一种检测新型抗真菌化合物的简便快速方法

该方案介绍了 大肠杆菌基于选择性压力将非天然氨基酸（ncAAs）引入乳酸乳球菌抗菌肽乳酸链球菌肽（nisin）中。其特性可在重组表达过程中被改变 通过...

通过非经典氨基酸的选择性压力整合产生的抗菌肽

本文介绍了一种制备革兰氏阴性大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）球状体和革兰氏阳性巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium，B.

细菌球状体和原生质体的制备与可视化以表征抗菌肽的定位

在pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO细胞中表达的重组抗体蛋白以及利用传统杂交瘤技术产生的单克隆抗体均可识别并结合猪氨肽酶N（APN）蛋白。...

靶向猪肠道黏膜上皮氨肽酶N的单克隆抗体的制备

本方案描述了一种获取肽类及其他化合物（如小分子抗真菌剂）对白色念珠菌（Candida...

量化肽类物质对真菌的抗真菌活性 白色念珠菌

我们介绍了利用荧光显微镜证明配体结合于台湾乳白蚁肠道内纤维素消化原生动物表面膜的方法，并展示了将配体与裂解肽偶联可杀死这些原生动物的实验流程。 体外 （厌氧原生动物培养）和 体内...

测试配体裂解肽对白蚁肠道原生动物的杀原虫活性 体外 （原生动物培养）和 体内 （白蚁后肠的显微注射）

学习抗菌肽Mel4及其仿态物RK-758的合成、纯化与生物活性评估方法。该方案整合抗菌活性测定与细胞毒性测试，为抗感染药物研发提供标准化、可重复的实验流程。

抗菌肽及其模拟物的制备与检测

探索更多视频