Name: 使用基于纳米孔测序的长读长质粒测序与组装工作流程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 学习基于纳米孔测序的长读长质粒测序与组装工作流程，用于分子生物学和基因组学研究。该方法以大肠杆菌为模型，优化质粒DNA产量与测序准确性，支持4至174 kb质粒及高通量并行测序。

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我们非常感谢华盛顿大学的 Steve Salipante 慷慨分享了其发表的一组临床大肠杆菌（E. coli）菌株45。本研究部分得到了加州大学圣克鲁兹分校（UCSC）向 MC 提供的创新与创业发展主任职位的研究支持资金，以及加州大学 Alianza MX 项目“墨西哥高负担和脆弱人群中结核分枝杆菌分离株的基因组特征分析：对传播和耐药性的深入理解”对 MC 的资助。

作者无任何利益冲突需要披露。

质粒的鉴定与表征在公共卫生、临床微生物学和微生物生态学领域备受关注，因为质粒能够在不同生态环境中维持并传播适应性基因1,5，并作为加速进化的平台4。下一代测序（NGS）技术的引入使得微生物分离株及微生物群体基因组的高通量测序成为可能，但组装后对完整质粒或质粒来源的重叠群（contig）进行鉴定通常需要长读长测序数据，因为短读长测序数据无法解析长度超过读长的重复区域。牛津纳米孔测序技术（ONT）已成为一种广受欢迎的长读长测序方法，其应用不仅涵盖全基因组测序和宏基因组学，还包括质粒序列验证、表观遗传修饰的检测与表征、RNA测序，以及串联基因阵列内在不稳定性的评估（详见文献12,49的综述）。
在此，研究人员展示了一种用于纳米孔测序（ONT）质粒的实验流程，适用于染色体序列已知或无需关注的情况。原因是质粒提取过程耗时、费力且成本较高（因为需要培养宿主菌群并进行处理），而利用纳米孔技术对整个基因组进行测序通常足以获得完整的质粒组装结果，同时提供其基因组背景信息。该方案在以下情况中尤为有用：验证质粒基因工程中的质粒序列50,51，提高全基因组测序（WGS）已获得的质粒序列的准确性24，或对通过接合转移从临床或环境样本中捕获的质粒进行表征。
从临床和环境样本中提取DNA可能需要进行一些定制化调整。本文作者报告称，他们所使用的一些临床菌株会产生生物膜基质，容易堵塞滤膜，因此需要多次离心收集菌体，有时还需额外使用两片滤膜。此外，与测序高拷贝数质粒相比，为测序接合性质粒，需要更大体积的培养物，因为自然界中存在的中等及大型质粒通常拷贝数较低2。
该方案已成功实现了对大小在4 kb至173 kb之间的质粒进行测序，此范围完全符合制造商的技术规格（2–200 kb）。最近一项研究分析了NCBI数据库中收录的23,000条质粒序列，发现其大小存在显著差异，且与来源密切相关：来源于人类的质粒中位数大小最小（76 kb），而土壤和植物来源的质粒最大（分别为215 kb和427 kb）；其他所有来源的质粒中位数大小介于79 kb至147 kb之间。因此，本方案应可覆盖大多数质粒，可能仅对巨型质粒52以及土壤或植物来源的质粒存在例外3。
作者加入质粒DNA富集步骤，以提高质粒DNA组装的准确性。大量染色体DNA的存在会导致测序流动池中的细胞孔被非目标序列读长占据，从而显著降低质粒DNA的测序深度。此前已有研究采用质粒DNA富集步骤，尝试对临床样本中的质粒DNA进行完整组装，以检测抗生素抗性基因（ARGs）24。该方法在仅使用纳米孔测序数据完成质粒组装方面表现出显著提升（相对于基准，完整组装率达到78%）。后续又有多个类似研究相继报道50,53,54。
为了提高读长准确性，其中两项研究采用了纳米孔公司（nanopore）开发的一种名为“伪配对读长的配对碱基识别”（paired basecalling on pseudopaired reads）的技术50,53。该方法通过比对同一条DNA分子的正链和反链所产生的原始电信号，使测序准确性提高约一个数量级。伪配对读长的配对碱基识别技术可与多重测序（multiplexing）兼容，前提是实验策略能够识别出同一分子的正向和反向链。因此，该方法不能用于从含有未知质粒组成或混合质粒样本中纯化的质粒。需注意，基因组中质粒的数量通常在0到7个之间（尤其在临床分离株中）2,55。
研究人员注意到样本中存在较高水平的染色体污染（表10）。根据序列比对结果，所分析的10个样本的污染水平在28%至72%之间。然而，当研究人员将该序列数据根据染色体与质粒（或存在的多个质粒）相对大小进行标准化处理后，发现质粒序列的丰度平均比染色体序列高出144倍。若要将此数值转化为质粒DNA的富集程度，则需要知道每个样本中质粒的拷贝数。
MinION 流动池通常可产生约 30 GB 的测序数据输出，理论上能够实现每个运行批次测序超过 96 个质粒。实际上，由于受到 96 种条形码的限制，每个流动池最多可并行处理 96 个质粒，这是实际操作中的上限。然而，染色体 DNA 污染和天然条形码分布不均会降低每个样本的有效测序深度。为确保每个样本具有足够的测序深度，更保守的做法是每个流动池合并约 24 个质粒样本。推荐的质粒序列准确组装所需测序深度为 50 至 70 倍32,56。在本文展示的示例中，作者在一个流动池中运行了 21 个多重样本，获得了平均 109 倍的测序深度，与每个流动池推荐的最佳样本数量相符。
需要注意的是，当测序深度过高时，通过合格/不合格读段划分来评估整体读段质量的信息价值较低。相比之下，由读段长度分布得出的指标能更清晰地反映数据集的质量。其中一个指标是N50，定义为长度等于或大于该值的读段所包含的碱基数占总碱基数的50%。该数值对质量控制步骤极为敏感。例如，使用Filtlong等工具过滤低质量或短读段，会显著去除分布中较短读段的尾部，从而导致N50值被抬高。这一现象在表9中表现明显。
作者使用了ONT的快速条形码试剂盒，该试剂盒利用转座复合物对质粒DNA进行片段化，因此无需预先了解质粒的限制性酶切图谱。先前的一项研究发现，对于小质粒（&#60;20 kb），必须进行酶切片段化，因为小质粒在大多数DNA提取过程中仍保持环状结构，因而缺乏用于接头连接的游离末端54。该研究未使用条形码，而条形码可通过PCR扩增产生额外的游离末端，因此在此情况下，这一问题可能并不成立。OnRamp是用于常规质粒验证的一种高级方法，它通过利用全长质粒读段进行组装，避免了条形码的使用，从而简化了样品制备流程54。然而，在本研究中，作者出于三个原因更倾向于使用条形码。第一个原因是能够不受质粒长度影响地构建组装序列。第二个原因是能够耐受染色体DNA的污染。第三个原因是如上所述，这为多个样本的多重测序提供了可能。
早期的一项研究指出，通过整合不同基因组拼接工具的拼接结果，可以消除各单一拼接平台固有的偏差，从而改善最终的拼接效果24。这种整合分析（meta-analysis）特性已被纳入作者所使用的拼接程序Autocycler34中。与之前版本Trycycler57相比，Autocycler实现了更高的自动化程度；它利用测序数据的多个子集，并（如前所述）使用多种拼接工具进行多次拼接，以生成更精确的一致性拼接结果。然而，大多数拼接工具，即使是最优秀的工具（如Flye28、Canu29和Raven30），在处理具有高度序列同源性的质粒时仍存在困难，容易错误地将不同质粒序列合并，或产生单个质粒的多个拷贝&#160;，并且常常会遗漏小型质粒58,59（另见图4C）。当出现此类问题时，剔除低质量读段并去除短读段有助于解决嵌合重叠群（chimeric contigs）的问题。
为了评估测序方案的整体准确性，作者将仅使用牛津纳米孔技术（ONT）的组装结果与结合长读长和短读长数据进行优化后的组装结果进行了比较，后者（在缺乏PacBio数据的情况下）是目前的金标准。作者还获得了凝胶电泳数据，显示了各样本中质粒的数量及其估计大小（表8，&#160;第三列）。研究人员成功组装出10个样本中存在的全部13个质粒，并获得与组装序列一致的大小。这一成果相当显著，因为长读长序列组装工具通常难以组装具有结构复杂序列的质粒。在更精细的层面上，两组序列之间的成对比较显示准确性存在差异（表8）。在13个质粒组装结果中，有5个在ONT组装序列中存在无覆盖区域，推测这是在仅使用ONT数据进行序列组装过程中人为引入的序列片段所致。其余7个质粒中，3个存在单核苷酸多态性（SNPs），成对差异范围在0.0023%至0.05%之间，另外4个则完全一致。准确性的高低似乎与质粒DNA富集程度或测序深度无关，但与单个样本中是否存在多个质粒相关，可能是因为多个质粒的存在会增加序列复杂性水平（表8）。总之，该工作流程旨在优化质粒序列的产出量和准确性。尽管该流程能够成功组装质粒序列，但在核苷酸水平上的准确性存在一定变异。该方案可用于测序多种不同大小范围的质粒，可耐受至少72%的染色体DNA污染，并且（取决于质粒大小和流动槽状态）可在单个流动槽中同时处理至少24个质粒。

质粒是普遍存在于细菌中的自我复制DNA片段。其大小具有高度变异性，范围从&lt;800 bp到2.5 Mbp不等，通常呈现双峰分布，其中较小的峰对应于高拷贝数的非接合型质粒，较大的峰对应于低拷贝数、通常为接合型的质粒1,2。质粒在微生物生态学中发挥关键作用，携带有助于宿主适应环境挑战或开拓新生态位的基因。质粒还作为加速进化的平台，增强遗传可塑性，并介导菌株、物种、属甚至科之间的水平基因转移3,4。网络分析和比较基因组学研究已证实环境耐药组（resistome）作为临床相关抗生素抗性基因（ARGs）的持久储存库，从而促进这些基因在不同生态环境中的维持与传播5。追踪质粒及其携带的抗生素抗性基因和毒力基因有助于识别传播途径6。因此，质粒的鉴定与表征在公共卫生、临床微生物学及生物技术等多个领域具有重要意义。
新一代测序（NGS）技术的出现使得对未知DNA模板进行高通量测序成为可能，从而为微生物分离株的基因组表征开辟了道路。全基因组测序（WGS）能够追踪新病原体、耐药菌株以及逃避免疫疫苗的变异株的出现、传播和传播途径。该技术也越来越多地被用于帮助识别临床暴发期间的传播路径，从而为未来暴发的预防干预措施提供依据7。最后，WGS还能够对耐药基因（ARGs）进行谱型分析，从而为治疗决策提供参考8，尽管将ARGs与定性及定量的抗生素耐药表型相关联仍处于研究进程中9。
然而，全基因组测序（WGS）大规模产生的短读长（SR）测序数据通常长度在 400–500 bp 范围内。这一长度短于大多数可移动遗传元件（MGEs）的大小，因此无法解析这些元件10。在 WGS 数据中，质粒序列的in silico鉴定还受到覆盖度不完整以及质粒之间、细菌染色体与其他质粒之间存在共享序列的进一步干扰10。因此，组装结果往往高度片段化且不完整，导致无法确定其亚基因组位置（染色体或质粒）10。
长读长（LR）测序技术能够生成高度连续的基因组组装结果，可跨越更多的重复区域，极大地促进了完整质粒组装的获得。目前主要有两种可用的长读长单分子测序技术11,12。其中，纳米孔测序技术由于成本低、周转时间快，且适用于资源有限的环境，在微生物基因组学中正变得越来越受欢迎13,14。
纳米孔测序设备使用含有数千个纳米孔阵列的流动池。DNA被加载到流动池中，由具有解旋酶活性的马达蛋白打开，并在电流差的驱动下通过纳米孔。当单条DNA链中的核苷酸依次通过单个纳米孔时，电流受到干扰，产生特征性信号，该信号由连接至每个纳米孔的电子传感器检测。这些信号通过碱基识别算法进行解码，所得数据随后利用多种生物信息学工具进行进一步的组装与分析。
与短读长测序（SR-sequencing）方法相比，纳米孔测序在电信号数据分析（碱基识别）过程中 tends 产生较低的读段质量（较低的Q值），并在同聚物序列中引入插入/缺失错误15。已有研究指出，天然DNA中邻近的甲基化可能导致系统性的碱基识别错误16。目前普遍采用的解决方案是引入短读长数据用于组装后的错误校正。然而，这一过程（称为“打磨”或“polishing”）会增加成本和操作复杂性17。提高测序深度也可提升准确性，但在技术上并不总是可行。
2024年的研究表明，Oxford Nanopore测序（ONT）R10.4.1流通池与V14化学试剂可为革兰氏阴性菌（G-细菌）生成高质量且连续的基因组组装结果，而在单核苷酸水平的精细分析中，短读长测序（SR-sequencing）数据仍具优势18。然而，长读长（LR）与短读长（SR）测序在准确性方面的差距正逐步缩小。近年来的多项改进包括在提高测序速度的同时实现更精确的数据采样、引入专为原生细菌DNA及甲基化设计的新型碱基识别算法，从而提升碱基识别准确率19，以及更新分析工具，例如用于单倍型分型、变异检测和星型等位基因识别的新算法。还需注意，最新的Dorado算法V.0.9.0（ONT，2025）可用于原始电信号数据（squiggle data）的重新碱基识别。事实上，已有部分全基因组测序（WGS）研究报道，通过纳米孔测序获得的微生物基因组质量已达到无需短读长数据进一步矫正即可获得高可信度一致序列的水平20,21。
质粒通常含有大部分获得性耐药基因，尤其是在肠杆菌科分离株中22。因此，解析质粒序列有助于明确耐药基因的遗传环境，这对于追踪抗菌药物耐药性（AMR）的传播至关重要23,24。纳米孔测序技术已用于研究携带blaKPC基因的质粒的微进化过程25。 MinION设备也已在医院环境中用于临床分离株中质粒的实时台式测序及耐药基因检测26。尽管如此，质粒分析尚未成为常规感染控制实践的一部分。
尽管长读长测序（LR-sequencing）在从基因组序列中恢复质粒方面相较于短读长测序（SR-sequencing）有显著改进27，但仍存在一些问题。Flye28、Canu29 和 Raven30 等长读长组装工具能够生成高质量的染色体组装结果，但在组装质粒序列方面表现不佳。部分原因在于测序覆盖深度不足，因为质粒DNA在全基因组测序（WGS）数据中的丰度较低31。需要注意的是，由于质粒具有模块化结构、富含二级结构且常含有重复序列，其高质量组装所需的测序深度高于染色体DNA（需达到50x的读长深度32）。
富集含有质粒序列的DNA样本是提高测序覆盖深度的有效方法，但在DNA测序前对质粒DNA进行分离或富集对于临床诊断应用而言成本过高或操作繁琐，并且可能因选择性富集特定DNA序列而引入偏差。2017年，研究人员利用质粒富集的DNA尝试对临床样本中的质粒DNA进行完整组装，以检测抗生素抗性基因（ARGs）24。研究对来自六种不同肠杆菌科物种的八个分离株进行测序，以最大化种群和质粒结构的多样性。在尝试了多种基因组组装工具后，结果表明Canu/Canu+Pilon的表现明显优于其他工具；该研究团队还尝试了一种宏组装方法，成功解析出更多质粒结构，最终实现了测序样本中已知质粒总数的78%的完整组装。然而，大重复序列的存在以及（在较小程度上）DNA提取过程中的问题，仍然对所有单重叠群质粒组装的检测构成了重大挑战24。
最近，作为一种富集低丰度质粒序列的补充方法，自适应采样已通过在细菌分离株样本中排除染色体序列得到研究，但该方法需要已知的参考序列33。
本文作者描述了针对质粒DNA富集样本定制的ONT测序方案。通过提高质粒DNA的代表性，并结合最新的文库制备方案、流动池技术及序列组装工具，该工作流程所获得的组装结果在大小上与凝胶迁移率推断的结果一致；在三分之二的案例中，其序列一致性或与短读长测序（SR-sequencing） polished 结果相当，或在成对序列一致性上差异不超过0.05%。质粒DNA序列的富集还最大限度地提高了质粒测序的效率，使得在获得最佳覆盖深度的同时，可并行对多达24个样本进行测序。这些方案并非旨在取代标准的纳米孔全基因组测序（WGS）方法，而是在染色体序列已知或无需关注的情况下，最大限度地提高质粒测序的准确性与效率。
该工作流程包括质粒DNA提取、带条形码的文库构建、接头与马达蛋白的连接、检测流动池、将文库加载到流动池进行测序、对电信号进行数据分析（实时或事后）、使用Autocycler34进行序列组装，以及多种下游分析（图1）。
<img alt="质粒测序工作流程图；DNA提取、文库制备、测序、注释。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70202/70202fig1.jpg" data-altupdatedat="1785816036000" data-alt="图1"> 
图1：使用Oxford Nanopore Technologies进行质粒测序的工作流程。 步骤1：DNA提取；步骤2：文库制备；步骤3：测序；步骤4：组装与注释。使用BioRender创建。Cortés, G. (2026) https://BioRender.com/u3b15st。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70202/70202fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Eppendorf DNA LoBind 管</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EP022431081</td><td>可替换为其他品牌的同类产品</td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管架</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>22-313630</td><td>可替换为其他品牌的同类产品</td></tr><tr><td>15 mL 一次性离心管</td><td>FALCON</td><td>352096</td><td>可以替换为其他品牌的</td></tr><tr><td>15 mL 离心管架</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>8850</td><td>可替换为其他品牌的同类产品</td></tr><tr><td>2.0 mL 微量离心管</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-138</td><td>可替换为其他品牌的同类产品</td></tr><tr><td>250 mL 无菌烧瓶&amp;nbsp;</td><td>PYREX</td><td>5320</td><td>可替换为其他品牌的同类产品</td></tr><tr><td>羧苄青霉素</td><td>GOLD BIOTECHNOLOGY</td><td>C-103-50</td><td>可替换为其他品牌的同类产品</td></tr><tr><td>离心</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>5424R-PR-R</td><td>可替换为其他品牌的同类产品</td></tr><tr><td>离心&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>5810R-P-R</td><td>可替换为其他品牌的同类产品</td></tr><tr><td>离心管</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B1283-4EA</td><td>可替换为其他品牌的同类产品</td></tr><tr><td>一次性接种环：1 &amp;micro;L</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-595</td><td>可替换为其他品牌的同类产品</td></tr><tr><td>电子数字天平</td><td>丹佛仪器</td><td>APX-2001</td><td>可替换为其他品牌的同类产品</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>04-355-720</td><td>可替换为其他品牌的同类产品</td></tr><tr><td>乙醇抗性标记物</td><td>记号笔</td><td>37001; 37002; 37003</td><td>可以替换为其他品牌的</td></tr><tr><td>流通池（R10.4.1）</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>FLO-MIN114</td><td></td></tr><tr><td>流动池清洗试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-WSH004</td><td></td></tr><tr><td>手套</td><td>X-GEN</td><td>44-100M</td><td>任何品牌的腈类手套均可使用</td></tr><tr><td>冰桶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>432128</td><td>可替换为其他品牌的同类产品</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP26184</td><td>可替换为其他品牌的同类产品</td></tr><tr><td>MinION 测序仪&amp;nbsp;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>MIN-101B</td><td></td></tr><tr><td>原生条形码试剂盒 96 V14</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-NBD114.96</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra MIDI 质粒DNA提取试剂盒</td><td>Takara</td><td>740410.5</td><td></td></tr><tr><td>PCR管架</td><td>AXYGEN&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;R96PCRFSP</td><td>可替换为其他品牌的同类产品</td></tr><tr><td>PCR管：（0.2 mL）</td><td>AXYGEN&amp;nbsp;</td><td>PCR-02-C</td><td>可替换为其他品牌的同类产品</td></tr><tr><td>程序自动循环器 v0.5.2</td><td>Ryan Wick / 墨尔本大学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>程序 bcftools v1.22</td><td>惠康桑格研究所（HTSlib / Samtools 团队）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>程序 bwa v0.7.19</td><td>Heng Li，最初就职于布罗德研究所</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Canu v2.3 程序</td><td>加利福尼亚大学戴维斯分校 &amp;和太平洋生物科学公司合作者</td><td></td><td></td></tr><tr><td>flye 程序 v2.9.6</td><td>加利福尼亚大学圣地亚哥分校（Pavel Pevzner 实验室）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>程序鳉 v2.1.1</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>程序 metamdbg&amp;nbsp;v1.2</td><td>INRIA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miniasm v0.3 程序</td><td>Heng Li</td><td></td><td></td></tr><tr><td>程序 minimap2 v2.28</td><td>Heng Li</td><td></td><td></td></tr><tr><td>程序 minipolish&amp;nbsp; v0.2.0&amp;nbsp; &amp;nbsp; &amp;nbsp; &amp;nbsp; &amp;nbsp; &amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Ryan Wick / 墨尔本大学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>程序 porechop v0.2.4</td><td>Ryan Wick / 墨尔本大学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>程序 racon v1.5.0</td><td>新加坡基因组研究所</td><td></td><td></td></tr><tr><td>程序 samtools v1.22.1</td><td>惠康桑格研究所（HTSlib / Samtools 项目）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit&amp;trade; 4 氟光计</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&amp;trade; 检测管</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>快速条形码试剂盒 24 和 96 V14&amp;nbsp;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-RBK114.96</td><td></td></tr><tr><td>一套可分配1至1000微升液体的微量移液器 &amp;ndash; 10 &amp;mu;L（P10），2 &amp;ndash; 20 &amp;mu;L（P20），20 &amp;ndash; 200 &amp;mu;L（P200）和200 &amp;ndash; 1000 &amp;mu;L（P1000）</td><td>RAININ</td><td>17008648; 17008650; 17008652; 17008653</td><td>微量移液器应进行校准</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>335905P</td><td>可替换为其他品牌的同类产品</td></tr><tr><td>10 微升灭菌吸头 &amp;mu;L, 200 &amp;mu;L 和 1000 &amp;mu;L&amp;nbsp;</td><td>日食</td><td>1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler C1000 Touch&amp;nbsp;</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1851196</td><td>可替换为其他品牌的同类产品</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>51221052</td><td>可替换为其他品牌的同类产品</td></tr></tbody></table>

基于纳米孔测序技术流程的长读长质粒测序与组装

Long-Read Plasmid Sequencing and Assembly Using Nanopore Sequencing-Based Workflows

本研究描述了一种旨在最大化质粒DNA产量和测序准确性的纳米孔测序工作流程。研究人员涵盖了该流程的每一步操作，包括质粒DNA提取、快速条形码标记与接头连接的文库构建、将文库加载至流动槽进行测序、实时或事后碱基识别，以及使用Autocycler进行序列组装。作者还明确了计算机配置要求，其主要取决于是否进行实时碱基识别。作者利用该工作流程对来自十个临床菌株的纯化质粒进行了测序。为消除宿主细胞菌株差异这一变量的影响，作者&#160; 还将这些临床菌株与一种常见的受体菌株进行接合，并对接合子进行了测序。这些实验获得的质粒组装结果与凝胶迁移率推断的质粒大小相符，且在三分之二的案例中，与短读长校正后的组装结果一致，或序列两两比对相似性在0.05%以内。质粒DNA序列的富集还最大限度地提高了质粒测序效率，使得在覆盖度最优的情况下可并行测序多达24个样本。该方案是充分的&#160;适用于大小在4至174 kb之间的质粒，且可耐受高达72%的染色体污染而不影响准确性。该方案特别适用于染色体序列已知或无需关注的情形，例如质粒序列验证、提升通过全基因组测序（WGS）已获得的质粒序列的准确性，或对通过接合捕获的质粒进行测序。本研究以以下生物体为例进行说明： 大肠杆菌，这代表了用于重组基因表达以及通过接合转移进行质粒捕获的常用宿主。

本研究描述了一种在染色体序列已知或无需关注时，对质粒进行纳米孔测序的工作流程。初始的质粒DNA富集步骤可确保最佳的质粒测序深度，并最大化每张流动池可测序的样本数量。

本研究描述了一种旨在最大化质粒DNA产量和测序准确性的纳米孔测序工作流程。研究人员涵盖了每一步……

我们研究被称为质粒的自我复制环状DNA元件的复制、维持和传播，这需要确定其序列。本方案通过富集质粒DNA并优化组装方法，解决了长读长测序相关的覆盖度和准确性问题。本方案旨在对染色体序列已知或无关情况下的质粒进行测序。首先，将样品划线接种至添加了适当抗生素的LB琼脂平板上，以筛选相应质粒携带的抗性标记。将平板在37摄氏度下培养24小时。次日，挑取单个孤立菌落，接种于3至5毫升含有适当抗生素的LB培养基中。将培养物在37摄氏度下振荡培养约八小时，或直至其在600纳米处的光密度达到1至2。然后，取400微升的种子培养物接种于400毫升添加了适当抗生素的LB培养基中，并按前述条件进行培养。随后，将培养物转移至适合该培养液体积的离心管中。在 4,200 G 条件下离心 10 分钟，然后按照制造商推荐的试剂体积重悬沉淀。细胞裂解并中和后，在 4,200 G 条件下将裂解液离心 30 分钟。将上清液转移至新管中，再次离心。根据制造商说明书进行平衡、洗涤和DNA洗脱。然后将沉淀的DNA重悬于100 µL无核酸酶水中，以最大限度提高纳米孔文库制备所需的DNA浓度。接下来，为定量DNA，按照下表所示准备检测管。校准荧光计后，将样品管插入荧光计中，并根据仪器说明书记录读数。将PCR仪程序设置为30摄氏度孵育2分钟，随后80摄氏度孵育2分钟。按照所示表格对解冻的试剂盒组分进行离心和混匀。使用热循环仪程序孵育已准备好的用于加标签的PCR管，然后将PCR管置于冰上冷却。将加标签的样品汇集至一个洁净的1.5毫升离心管中，确保总体积不超过1,000 µL。将珠子涡旋混匀后，向混合的条形码样本中加入等体积的珠子。通过轻弹管壁混匀，随后孵育10分钟。然后将珠子置于磁力架上，用1毫升80%乙醇洗涤。去除乙醇，并重复一次。将离心管从磁铁上取下。根据所使用的条形码数量，用适当体积的洗脱缓冲液重悬磁珠，在室温下孵育10分钟。使用荧光计检测洗脱样品的1微升样本，以测定DNA浓度，确认文库构建成功。进行接头连接时，将11微升DNA文库转移至新管并标记。然后在新管中混合所示组分，以稀释解冻后的快速接头。接下来，向11 µL DNA文库中加入1 µL稀释后的快速接头，轻弹管壁以混匀内容物。短暂离心，确保全部液体聚集于管底，室温孵育5分钟。在新的DNA管中配制流动池预启动混合液，通过颠倒和移液操作充分混匀。打开设备盖子，轻轻施加压力将流路池插入设备中，以确保其正确就位。检查引液口内部或附近是否有气泡，如有则回抽20至30微升液体以去除气泡。然后吸取800微升引液混合液，将其注入引液口中，注意避免产生气泡，并让设备静置五分钟。将DNA文库与适量的文库磁珠在新管中混合，具体操作如上所述。将200微升的预变性混合液加入流动池的预变性加样口。调整样品加样口盖，露出加样口。将含有磁珠的DNA文库以每滴75微升的量逐滴加入样品口，每加一滴需等待其完全吸收后再加入下一滴。然后重新盖上样品口盖，并关闭引物孔。关闭仪器盖后，开始测序运行。根据多重检测的质粒数量设置运行时间限制，默认为48小时，最长不超过72小时。选择超高精度碱基识别模式以及相应的快速条形码试剂盒选项。然后选择原始FAST5或POD5数据并开始碱基识别。为了为下游组装生成过滤后的FASTQ文件，使用Filtlong对长读长数据进行修剪，去除约5-10%质量最低的读段，同时保留约90%的总产量。根据推荐设置，使用Autocycler对读段进行子抽样。使用Raven、Flye、Kanu、Miniasm、Myloasm、NECAT、Plassembler以及其他选定的组装软件对每个读段子集进行组装。使用 Bandage 可视化每个组装图文件。评估重叠群的环状结构、不同组装软件间大小的一致性，以及嵌合连接的证据。去除在多个组装软件中缺乏支持的线性重叠群，保留大小估计一致的环状重叠群。在主要质粒环化后、生成一致性序列前，去除未被支持的小片段重叠群。在手动校正完成后，使用Autocycler对经过校正的组装结果生成一致性序列。执行剩余的 Autocycler 命令以生成最终的共识质粒序列。最后，使用经修剪的长读长序列通过 Medaka 对最终组装结果进行优化，以提高共识序列的准确性。所有接合实验均获得了接合子，证实供体菌中含有接合性质粒。组装的质粒序列大小与基于脉冲场凝胶电泳迁移率的估计值一致。纳米孔测序为所分析的所有样本均提供了足够的读长产出和质量。染色体污染率在72.1%至28.0%之间，平均为46.9%。对菌株质粒UPEC_271进行脉冲场凝胶电泳分析，结果显示一条约145千碱基对的质粒条带。其中一个接合子的DNA序列与145千碱基完全相同。对菌株blood 100913进行脉冲场凝胶电泳分析，鉴定出两个大小分别约为70和110千碱基对的质粒。Nanopore测序确认了两个质粒的组装序列，分别为71,182个碱基对和111,226个碱基对。最重要的考虑因素是染色体序列是否为研究目标。如果是，则标准的全基因组测序方案更为合适。本方案所提高的覆盖度为异质性研究打开了大门，即特定群体内质粒序列的变异。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

使用基于纳米孔测序的长读长质粒测序与组装工作流程

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纳米孔DNA测序用于宏基因组土壤分析

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超长读长测序在全基因组DNA分析中的应用

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利用纳米孔技术进行狂犬病病毒快速全基因组测序

基于转录组学的低成本药物筛选

体内组装是一种不依赖连接酶的克隆方法，该方法依赖细菌内在的DNA修复酶通过同源重组将DNA片段组装在一起。该方案既节省时间又降低成本，所需试剂很少，且克隆效率可高达99%。...

使用 体内 高效质粒构建组装

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使用长读长测序技术进行扩增子测序

单细胞测序是一种日益流行且易于获取的工具，可用于高分辨率地研究基因组变化。我们提供了一种利用单细胞测序在单个细胞中鉴定拷贝数变异的实验方案。...

使用单细胞测序检测拷贝数变异

学习基于纳米孔测序的长读长质粒测序与组装工作流程，用于分子生物学和基因组学研究。该方法以大肠杆菌为模型，优化质粒DNA产量与测序准确性，支持4至174 kb质粒及高通量并行测序。

基于纳米孔测序技术流程的长读长质粒测序与组装

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