基于纳米孔测序技术流程的长读长质粒测序与组装

我们研究被称为质粒的自我复制环状DNA元件的复制、维持和传播，这需要确定其序列。本方案通过富集质粒DNA并优化组装方法，解决了长读长测序相关的覆盖度和准确性问题。本方案旨在对染色体序列已知或无关情况下的质粒进行测序。

首先，将样品划线接种至添加了适当抗生素的LB琼脂平板上，以筛选相应质粒携带的抗性标记。将平板在37摄氏度下培养24小时。次日，挑取单个孤立菌落，接种于3至5毫升含有适当抗生素的LB培养基中。

将培养物在37摄氏度下振荡培养约八小时，或直至其在600纳米处的光密度达到1至2。然后，取400微升的种子培养物接种于400毫升添加了适当抗生素的LB培养基中，并按前述条件进行培养。随后，将培养物转移至适合该培养液体积的离心管中。

在 4,200 G 条件下离心 10 分钟，然后按照制造商推荐的试剂体积重悬沉淀。细胞裂解并中和后，在 4,200 G 条件下将裂解液离心 30 分钟。将上清液转移至新管中，再次离心。

根据制造商说明书进行平衡、洗涤和DNA洗脱。然后将沉淀的DNA重悬于100 µL无核酸酶水中，以最大限度提高纳米孔文库制备所需的DNA浓度。接下来，为定量DNA，按照下表所示准备检测管。

校准荧光计后，将样品管插入荧光计中，并根据仪器说明书记录读数。将PCR仪程序设置为30摄氏度孵育2分钟，随后80摄氏度孵育2分钟。按照所示表格对解冻的试剂盒组分进行离心和混匀。

使用热循环仪程序孵育已准备好的用于加标签的PCR管，然后将PCR管置于冰上冷却。将加标签的样品汇集至一个洁净的1.5毫升离心管中，确保总体积不超过1,000 µL。

将珠子涡旋混匀后，向混合的条形码样本中加入等体积的珠子。通过轻弹管壁混匀，随后孵育10分钟。然后将珠子置于磁力架上，用1毫升80%乙醇洗涤。

去除乙醇，并重复一次。将离心管从磁铁上取下。根据所使用的条形码数量，用适当体积的洗脱缓冲液重悬磁珠，在室温下孵育10分钟。

使用荧光计检测洗脱样品的1微升样本，以测定DNA浓度，确认文库构建成功。进行接头连接时，将11微升DNA文库转移至新管并标记。然后在新管中混合所示组分，以稀释解冻后的快速接头。

接下来，向11 µL DNA文库中加入1 µL稀释后的快速接头，轻弹管壁以混匀内容物。短暂离心，确保全部液体聚集于管底，室温孵育5分钟。在新的DNA管中配制流动池预启动混合液，通过颠倒和移液操作充分混匀。

打开设备盖子，轻轻施加压力将流路池插入设备中，以确保其正确就位。检查引液口内部或附近是否有气泡，如有则回抽20至30微升液体以去除气泡。然后吸取800微升引液混合液，将其注入引液口中，注意避免产生气泡，并让设备静置五分钟。

将DNA文库与适量的文库磁珠在新管中混合，具体操作如上所述。将200微升的预变性混合液加入流动池的预变性加样口。调整样品加样口盖，露出加样口。

将含有磁珠的DNA文库以每滴75微升的量逐滴加入样品口，每加一滴需等待其完全吸收后再加入下一滴。然后重新盖上样品口盖，并关闭引物孔。关闭仪器盖后，开始测序运行。

根据多重检测的质粒数量设置运行时间限制，默认为48小时，最长不超过72小时。选择超高精度碱基识别模式以及相应的快速条形码试剂盒选项。然后选择原始FAST5或POD5数据并开始碱基识别。

为了为下游组装生成过滤后的FASTQ文件，使用Filtlong对长读长数据进行修剪，去除约5-10%质量最低的读段，同时保留约90%的总产量。根据推荐设置，使用Autocycler对读段进行子抽样。使用Raven、Flye、Kanu、Miniasm、Myloasm、NECAT、Plassembler以及其他选定的组装软件对每个读段子集进行组装。

使用 Bandage 可视化每个组装图文件。评估重叠群的环状结构、不同组装软件间大小的一致性，以及嵌合连接的证据。去除在多个组装软件中缺乏支持的线性重叠群，保留大小估计一致的环状重叠群。

在主要质粒环化后、生成一致性序列前，去除未被支持的小片段重叠群。在手动校正完成后，使用Autocycler对经过校正的组装结果生成一致性序列。

执行剩余的 Autocycler 命令以生成最终的共识质粒序列。最后，使用经修剪的长读长序列通过 Medaka 对最终组装结果进行优化，以提高共识序列的准确性。所有接合实验均获得了接合子，证实供体菌中含有接合性质粒。

组装的质粒序列大小与基于脉冲场凝胶电泳迁移率的估计值一致。纳米孔测序为所分析的所有样本均提供了足够的读长产出和质量。染色体污染率在72.1%至28.0%之间，平均为46.9%。对菌株质粒UPEC_271进行脉冲场凝胶电泳分析，结果显示一条约145千碱基对的质粒条带。

其中一个接合子的DNA序列与145千碱基完全相同。对菌株blood 100913进行脉冲场凝胶电泳分析，鉴定出两个大小分别约为70和110千碱基对的质粒。Nanopore测序确认了两个质粒的组装序列，分别为71,182个碱基对和111,226个碱基对。

最重要的考虑因素是染色体序列是否为研究目标。如果是，则标准的全基因组测序方案更为合适。本方案所提高的覆盖度为异质性研究打开了大门，即

特定群体内质粒序列的变异。