通过遗传密码子扩展实现位点特异性赖氨酸乳酸化 E. coli 和哺乳动物细胞

我们开发了一种时钟/RS tRNA系统，以克服模拟作用和酶的局限性，从而实现精确的赖氨酸乳酸化修饰整合，用于研究其生物学功能。该方案可用于研究肿瘤代谢、酶功能以及时钟位点。首先，将约100纳克目标质粒分别与50微升大肠杆菌DH10B感受态细胞共转化。将转化混合物在冰上孵育25分钟，随后在42摄氏度进行45秒的热激处理。

将离心管放回冰上孵育三分钟。加入 350 µL 的 LB 培养基，在 37 °C、220 rpm 条件下剧烈振荡培养一小时。随后将转化后的细胞培养物涂布于含有氨苄青霉素和氯霉素的 LB 琼脂平板上。

将培养皿置于37摄氏度孵育12至16小时。然后从培养皿中挑取单菌落，接种于4毫升含氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基中，过夜培养。次日，将过夜培养物转接至400毫升含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基中扩大培养。

在37°C、220转/分钟的条件下剧烈振荡培养，直至600纳米处的光密度值达到0.6至0.8之间。随后，加入0.2% L-阿拉伯糖和1毫摩尔乳酸赖氨酸诱导培养物，并在30°C、220转/分钟条件下继续孵育16小时。将细胞以每孔1 × 10⁵个细胞的密度接种于12孔板中，每孔加入1毫升DMEM培养基。

孵育24小时，直至细胞融合度达到70%至80%，然后进行转染。配制稀释的DNA溶液时，将0.75微克含有sfGFP报告基因的质粒与pNeu-KlacRS按1:1的比例加入38微升含高糖的无血清DMEM培养基中。轻轻吹打混匀或短暂涡旋振荡以充分混合。

为配制稀释的转染试剂，将 2.25 微升转染试剂加入 38 微升高糖无血清 DMEM 培养基中。轻轻吹打混匀 3 至 4 次，充分混合。立即将稀释后的转染试剂一次性全部加入稀释的 DNA 溶液中。

现在上下吹打3至4次以混匀内容物，并在室温下孵育溶液10至15分钟，使转染复合物与DNA复合物形成。将50微升转染与DNA复合物逐滴加入每孔的培养基中，轻轻摇动培养板以混匀混合物。转染6小时后，更换为含有1毫摩尔乳酸赖氨酸的新鲜DMEM培养基，继续培养细胞24至48小时。

在大肠杆菌中，当向培养基中添加 1 毫摩尔乳酸赖氨酸时，可产生全长的 hENO1-89Klac。免疫印迹实验使用抗 His 标签抗体和抗 L-乳酸赖氨酸抗体证实了全长 hENO1-89Klac 的存在。电喷雾电离飞行时间质谱显示一个主峰位于 48,178 道尔顿，与缺失起始甲硫氨酸的 hENO1-89Klac 预期分子量相符。

三联消化物的串联质谱分析通过完整的B&Y离子系列证实了Klac在第89位残基处的位点特异性掺入，该离子系列对应于修饰后的肽段。在哺乳动物HEK293T细胞中，荧光显微镜显示，当添加Klac培养24小时和48小时后，细胞内均有强烈的sfGFP表达，而在未补充Klac的条件下未观察到荧光。流式细胞术结果显示，在添加Klac 24小时后约有31%的细胞表达sfGFP，48小时后上升至约37%。

该方案可实现对蛋白质功能上特定位点赖氨酸乳酸化效应的研究，并有助于测量由此产生的生物学和功能结果。按照本流程，研究人员可开展机制研究、进行高通量筛选实验，并构建稳定细胞系以进行长期功能分析。我们未来的研究目标是提高效率、实现稳定整合，并开发生物钟的生物合成方法。