以最小输入绘制婴儿免疫图谱：整合单细胞与多组学分析
2026年4月3日
本方案描述了从新生儿和儿科患者采集和保存血液样本，并应用scRNA-seq、蛋白质组学和光谱流式细胞术来表征这些样本中的免疫细胞群体。
我们的研究通过从小血容量进行纵向高维多组学分析，定义了早期免疫在出生后如何适应。该方案可应用于新生儿和儿科研究，针对健康、感染和炎症等有限生物样本进行纵向免疫分析。首先，在37摄氏度的水浴中迅速解冻一瓶装有溶解婴儿红细胞的小瓶。
将解冻后的细胞转移到一个15毫升锥形管子中，内含10毫升温热且完整的RPMI培养基，温度为37摄氏度。在室温下以400克离心管五分钟，然后丢弃上清液。将细胞沉淀重新悬浮在三毫升完整的RPMI培养基中，并计数细胞总数。
如果浓度太高无法计数，就稀释样品。计数完细胞后，重复离心步骤，并将细胞重新悬浮在完整的RPMI培养基中，以获得每毫升一百万个细胞的浓度。将含有100万个细胞的100微升液体转移到96孔V型底板的每个孔中。
在764克下离心板，温度四摄氏度，离心两分钟。丢弃上清液。接着，将100微升活死染料稀释1至2000微升，含FC块和稀释单核细胞块，加入除未染色对照组外的所有样本。
将样本在四摄氏度下孵育15分钟。清洗细胞时，加入100微升PBS。将板子以764克离心，温度为4摄氏度，离心两分钟，然后小心丢弃上清液。
除未染色对照样本外，向所有样品加入100微升表面抗体混合物，并用1至200微升的荧光激活细胞分选液（FACS缓冲液）稀释。在4摄氏度下孵育30分钟。然后用100微升FACS缓冲液清洗细胞，离心机处理，丢弃上清液。
在每个样本中加入100微升4%对甲醛固定细胞。在室温下黑暗中孵育15分钟，然后再次清洗细胞，再重新悬浮于200微升FACS缓冲液中。准备UltraComp补偿珠作为单色对照。
采用与样品相同的方法染色单色控制珠，包括如果样品固定后进行固定。同时，以同样方式制备一个或FMO控制的荧光。在常规或光谱流式细胞仪上运行样本、单色对照、未染色对照和荧光-1对照。
打开FlowJo，选择感兴趣的样本进行分析。使用合适的等型和FMO控制设置门。利用FSC与SSC对白细胞门进行排除碎片，并根据细胞大小和粒度选择细胞。
用FSCA排除双重态，而不是FSCH。使用活细胞活性染料排除死细胞。从活细胞分裂为CD33阴性淋巴细胞和CD-33阳性骨髓细胞。
在CD33阳性细胞中，识别CD14阳性单核细胞。然后在CD33阳性细胞中识别CD14阴性、CD11C阳性的树突状细胞。现在，在CD33阴性淋巴细胞中，步态为CD3阳性T细胞和CD3阴性、CD56阳性自然杀手细胞。
在CD3阳性T细胞中，识别CD8阳性和CD4阳性亚组，并识别CD3阴性、CD56阴性和CD19阳性B细胞。首先，将一瓶冷冻保存的红细胞溶解在37摄氏度的水浴中。将悬浮液转移到一个15毫升锥形管内，内含10毫升T细胞培养基，并在430克离心机下以4摄氏度离心五分钟。
丢弃上清液。在用一毫升PBS重新懸浮細胞沉淀后，再向样本中加入九毫升PBS。将管子以430克离心，离心五分钟，温度为4摄氏度，然后丢弃上清液。
计数细胞并使用蓝锥排换法评估存活能力。如果存活率低于70%，请按照以下方式使用死细胞清除套件。首先，将20倍结合缓冲液与无菌双蒸馏水稀释，制备1x结合缓冲液。
将细胞沉淀重新置于每10个10毫升死细胞去除微珠中，达到总共七个细胞的幂次方。搅拌均匀，在室温下孵育15分钟。将磁性分离柱放入相应的磁性支架中，并放置收集管。
然后用500微升1x结合缓冲液冲洗，使色谱柱平衡。将细胞悬浮液体积提升至500微升，并使用1倍结合缓冲液。更换收集管后，将细胞悬浮液施加在柱上，并在新的1.7毫升微离心管中收集流动液。
接着，用500微升结合缓冲液清洗柱子两次，并将流动液收集在同一个微离心管中。将洗出液以300克离心10分钟，然后丢弃上清液。计数细胞数，并再次使用锥蓝排除法评估存活能力。
将2万个活细胞放入一根新的1.7毫升微离心管中。然后用300克离心机离心10分钟，去除上清液。用含0.04%BSA的40微升PBS重新悬浮细胞。
最后，将装有细胞的管子冰封，立即送往基因组核心设施进行文库生成和测序。收集测序结果，格式为细胞游侠输出。处理了早产儿和对照组的干血斑样本。
并且定量了92种免疫相关蛋白的归一化蛋白表达。与足月脐带血相比，早产儿两个月龄的外周血中淋巴细胞激活基因3和信号阈值调节跨膜接头1的表达显著高于足月脐带血。采用了全面的门控策略，从红细胞溶解白细胞样本中识别白细胞群体。
在T细胞群体中，区分了CD4阳性和CD8阳性亚组。经过筛选，捕获并分析了超过12万个细胞，并分析了单细胞核糖核酸测序数据集。降维和聚类分析识别出14个不同的细胞簇。
细胞簇基于差异表达的基因和已知的细胞标记进行注释。14个簇中有12个对应免疫细胞谱系，包括T细胞、自然杀伤细胞、B细胞、髓系细胞和中性粒细胞。堆叠条形图展示了一周、一个月和两个月龄中每个簇细胞的相对比例。
本研究能够从有限体积血液样本中纵向测量细胞、转录组、蛋白质组和功能免疫特征。未来的研究可以利用这些方法定义健康的免疫轨迹，并发现与疾病相关的早期免疫反应失调。
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概述
本文介绍了利用极小血量对新生儿进行高维免疫谱型分析的优化方案。通过整合流式细胞术、蛋白质组学和单细胞RNA测序等先进技术，该研究能够对新生儿免疫系统的发育进行全面的纵向分析，即使是对极低出生体重或早产婴儿也同样适用。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 新生儿与儿科研究
- 单细胞分析
背景
- 新生儿免疫系统在出生后会迅速适应新的、富含刺激物的环境。
- 生命早期的免疫反应是针对发育需求特异性调节的，而不仅仅是未成熟的表现。
- 由于可用于研究的血液量有限，新生儿免疫系统的研究面临挑战。
- 全面的免疫谱型分析需要采用能够从小样本中最大化获取数据的方法。
研究目的
- 开发并示范从微量新生儿血液样本中进行高维免疫谱分析的实验方案。
- 实现对新生儿和早产儿免疫系统发育的纵向研究。
- 随时间推移捕捉细胞、转录组和蛋白质组层面的免疫特征。
使用的方法
- 新生儿裂解红细胞样本的解冻与处理。
- 采用详细设门策略的流式细胞术，用于鉴定免疫细胞亚群（T细胞、B细胞、NK细胞、髓系细胞、树突状细胞、单核细胞、中性粒细胞）。
- 干血斑样本的蛋白质组学分析，定量检测92种免疫相关蛋白。
- 单细胞RNA测序，包括死细胞去除、文库构建及对超过120,000个细胞的聚类分析。
- 在多个时间点（一周、一个月、两个月）进行纵向采样。
主要结果
- 该方案能够利用适合新生儿和早产儿的极小血液体积进行免疫谱型分析。
- 与足月脐带血相比，早产儿在两个月时淋巴细胞活化基因3和信号阈值调节跨膜适配蛋白1的表达显著升高。
- 鉴定并注释了14个不同的细胞簇，其中12个对应于已知的免疫细胞谱系。
- 可视化呈现早期生命阶段免疫细胞比例的动态变化。
结论
- 所述方法可利用有限的新生儿血液样本进行全面、纵向的免疫谱型分析。
- 这些方法有助于研究健康免疫系统的发育过程，并识别与疾病相关的失调免疫应答。
- 这些实验方案广泛适用于新生儿及儿科免疫学研究。
常见问题
行业重要性概述
利用极少量新生儿血液样本进行整合性的单细胞与多组学分析，可前所未有地揭示生命早期免疫系统的发育过程，克服儿科研究中关键的样本量限制。该方法支持对免疫发育轨迹进行高分辨率描绘，有助于在人类免疫系统发育的最早阶段开展靶点验证和机制性风险评估。这些实验方案可实现纵向、定量的免疫监测，直接为儿科及新生儿治疗项目的转化研究决策提供依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 利用极少量生物样本即可直接研究新生儿免疫细胞群体及其通路。
- 通过获取发育不同时间点的转录组和蛋白质组特征，支持功能靶点的验证。
- 揭示生命早期独特的免疫适应机制，为儿科免疫学项目提供机制层面的风险评估依据。
- 提高针对新生儿及儿科适应症靶点选择的可预测性与信心。
筛选与检测方法开发
- 建立经过验证且可重复的低样本量免疫细胞鉴定与定量工作流程。
- 标准化流式细胞术的设门策略与对照方案，确保检测的可靠性与可比性。
- 实现免疫表型及蛋白质表达谱的可扩展、高维度筛选。
- 为下游化合物评价和生物标志物发现提供稳健的生物系统准备。
转化与临床前研究
- 将免疫谱型分析结果与疾病相关的儿童及新生儿模型相匹配。
- 支持针对生命早期免疫失调的纵向生物标志物发现与验证。
- 通过实现重复采样和分析，提供从发现到临床前验证的连续性。
- 通过绘制婴儿健康与失调免疫轨迹，降低转化研究的风险。
流程与工作流整合
这种整合分析方法通过利用有限的新生儿样本实现全面的免疫分析，将早期发现、筛选和转化研究连接起来。
- Discovery Biology：促进在生命早期免疫背景下进行假设验证和通路解析。
- Screening：提供定量、可重复的免疫细胞和蛋白质测量结果，适用于高通量工作流程。
- Analytics：提供多组学读数和统计输出，用于对发育状态和疾病状态进行稳健比较。
- Translational Research：支持在儿科和新生儿项目中进行生物标志物匹配及风险调整后的进展评估。
- Enterprise Reuse：为跨多种儿科研究计划的免疫谱分析提供标准化、可扩展的平台。
运营与企业影响
- 科学价值：提高儿科免疫学研究的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：仅需极少量样本输入，即可实现标准化、可重复且可扩展的免疫谱型分析。
- 战略价值：通过有限样本提供高维度数据，优化决策流程，提升资本使用效率。
- 项目组合影响：支持对儿科及新生儿治疗资产进行基于风险调整的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备流式细胞术、单细胞RNA测序和蛋白质组学数据分析的专业知识。
- 需要获得先进的仪器设备和生物信息学基础设施，以支持多组学数据整合。
- 要求各团队在样本处理、设门策略和对照方案方面进行严格统一的标准化。
- 通过优化实验方案，可适用于多种儿科和新生儿模型系统。
- 受限于对测序和蛋白质组学所需的专用试剂及核心设施支持的需求。
