Name: 皮内肿瘤移植作为小鼠肿瘤内免疫治疗研究的稳健模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-02T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: 了解皮内肿瘤移植方法用于小鼠肿瘤内免疫治疗研究，使用B16F10黑色素瘤模型建立可见且可精确注射的肿瘤。该技术通过卡尺测量实现肿瘤生长监测，提高临床前免疫治疗评估的重复性和准确性。

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AS 感谢免疫学培训基金（T32 AI007363）的支持。KSK 衷心感谢斯伦贝谢基金会通过“未来教师”项目为其提供的资助。

所有操作均经机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并遵循其指南5。所有动物实验均在达特茅斯动物实验中心进行。使用6至8周龄的雌性C57BL/6小鼠，在通风笼架中按照标准条件饲养，自由摄食饮水。所用试剂和设备列于材料表中。&#160;
1. 小鼠脱毛
注意： 所有人员在进行这些操作之前，必须完成机构提供的活体动物操作和麻醉培训。
<ol>
	<li>在进行皮内注射前，按照下述方法剃除每只小鼠 flank 部的毛发；注射操作及以下所述步骤均使用右侧 flank。在接种肿瘤细胞的前一天剃毛。</li>
	<li>将小鼠置于稳定的表面上。用左手拇指和食指捏住小鼠颈背部皮肤使其固定，并轻轻将小鼠左侧身体 tucked 进手掌中，以暴露右侧体侧。用无名指和/或小指固定左侧腿部和尾巴，确保右侧 flank 完全暴露。</li>
	<li>从后肢向上至下部肋骨区域剃除毛发，以形成清晰的注射区域。</li>
	<li>如果需要额外的操作练习空间，可同时剃除两侧 flank 的毛发。 
	注意：初学者在学习剃毛和正确固定小鼠时，可对小鼠实施麻醉。</li>
</ol>
2. 使用染料练习注射
注意：练习可在活体上进行&#160;（麻醉后）安乐死的小鼠，且适用于任一性别。雄性小鼠的皮肤通常比雌性更厚且延展性较差，使操作在技术上更具挑战性。因此，在雄性小鼠上进行练习有助于熟练掌握该技术。
<ol>
	<li>在1.5 mL离心管中将食用色素与磷酸盐缓冲液（PBS）混合，直至溶液呈现深色（本研究使用蓝色食用色素）。</li>
	<li>获取练习用小鼠，并根据机构动物护理指南进行麻醉。在双眼涂抹眼用软膏，以防止角膜干燥。</li>
	<li>将麻醉后的小鼠置于鼻罩下，倾斜身体以暴露右侧腹侧区域。通过轻轻夹捏足垫并观察无反应来确认麻醉充分。</li>
	<li>用29 G、½英寸针头的0.3 mL胰岛素注射器吸取30 µL染料溶液，排尽所有气泡。</li>
	<li>用非惯用手轻轻捏住并拉伸腿部/皮肤，以形成平整、紧绷的表面（避免将皮肤向上提起）。将针头斜面朝上以与皮肤平行的浅角度刺入真皮层。保持针头在皮下可见，以确认注射位置准确。 
	注意：练习过程中，尝试不同的手握位置，以在保持手指远离针头路径的同时维持皮肤张力稳定。将针头插入皮肤约2 mm。为减少回流，可先将针头插入约3 mm，然后稍许回撤，形成“囊袋”后再进行注射，有助于染料保留在注射部位。</li>
	<li>缓慢注入全部30 µL染料溶液，直至皮肤表面下形成一个微小而清晰的“水泡” 
	注意：若未见明显水泡，提示注射可能进入皮下而非真皮内。保持针头斜面朝上有助于准确定位于真皮层，并防止注射过深。</li>
	<li>持续练习，直至能够稳定形成真皮内水泡。每侧最多可进行六至八次注射。</li>
	<li>完成练习注射后，按照经批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）方案对小鼠实施安乐死5。</li>
</ol>
3. 注射用肿瘤细胞的制备
注意：所有与细胞相关的操作步骤均须在无菌操作台中进行。请注意，不同的小鼠肿瘤细胞系生长特性各不相同。
<ol>
	<li>在皮内注射前数天解冻肿瘤细胞（本研究使用 B16F10 细胞）。</li>
	<li>将细胞培养至 70%–80% 汇合度，同时保持充足的培养基更新 
	注意：避免细胞汇合度达到 100%，否则会停止增殖并影响肿瘤生长。</li>
	<li>收获细胞并用 1× PBS、无血清 RPMI 或其他用于培养细胞的培养基将细胞重悬至 7 × 106 个细胞/mL。 
	注意：本实验室使用的 B16F10 肿瘤模型为每 30 µL 注射液中含 2 × 105 个细胞。30 µL 的注射体积是合适的，但可根据需要调整细胞数量以建立所需的肿瘤模型。细胞在管底会逐渐沉降聚集，因此为确保细胞浓度均匀，需定期轻柔混匀以维持细胞悬浮状态。</li>
	<li>处理后将细胞置于冰上&#160;，并尽快进行注射。长时间冰上存放会降低细胞活力，导致注射的活细胞数量减少，从而对肿瘤的建立产生不利影响6。 
	注意：细胞收获后在实验室中立即使用。细胞处理并置于冰上后，应在 20–60 分钟内完成注射。处理大样本量时建议与合作者共同操作，以尽量缩短细胞在冰上的停留时间。</li>
</ol>
4. 皮内注射
<ol>
	<li>对实验小鼠进行麻醉。&#160;在双眼涂抹眼药膏，以防止角膜干燥。 
	注意：本实验室使用异氟烷气体进行麻醉，但也可使用注射类麻醉剂。</li>
	<li>诱导麻醉后，将小鼠置于鼻罩下，并调整体位以充分暴露右侧 flank（侧腹部）。</li>
	<li>轻轻倒置细胞悬液，确保混合均匀。</li>
	<li>用带有29 G、½”针头的0.3 mL注射器吸取30 µL细胞悬液。去除气泡。</li>
	<li>用非惯用手轻轻将腿部/皮肤向一侧拉伸，使其平整紧绷（不要向上提起）。将针头斜面向上，以浅表平行角度插入真皮层。针头应保持在皮下可见，以确保插入深度不过深。 
	注意：针头插入皮肤深度应约为2 mm。为避免细胞回流，将针头插入皮肤约3 mm后稍向后退出，形成一个可供细胞注入的“口袋”，这可显著减少回流。</li>
	<li>缓慢注射全部30 µL细胞悬液，直至皮下形成一个微小且可见的“气泡”。拔针前等待5–10秒。 
	注意：拔针过快可能因压力导致溶液从皮肤中溢出。</li>
	<li>对每只小鼠重复上述操作。每完成一笼（4–5只小鼠）后更换注射器，以防止针头变钝。</li>
	<li>监测所有小鼠，直至其完全从麻醉中恢复。</li>
	<li>监测小鼠肿瘤形成情况及整体健康状况。</li>
</ol>
5. 瘤内注射
注意：肿瘤通常在移植后7–10天达到适当大小，即可进行治疗。实验室采用的适当大小为使用以下公式计算的体积达到约50 mm3或更大：体积 = (长度/2) × (宽度×宽度)7,8。
<ol>
	<li>提前准备好所有处理溶液（例如，本研究中使用了1× PBS）。根据具体处理要求，将溶液置于冰上或室温保存。</li>
	<li>按照机构指南诱导麻醉。</li>
	<li>将小鼠置于鼻罩下以维持麻醉状态，并调整体位使肿瘤暴露。</li>
	<li>用29 G、½”针头的0.3 mL胰岛素注射器吸取所需体积（例如，本实验中使用30 µL），并排除气泡。 
	注意：体积取决于所选处理方式及优化条件。</li>
	<li>将针头水平插入肿瘤，并向肿瘤中心推进。 
	注意：避免从顶部或以较陡角度插入，以免注射过深或进入周围组织。本研究所描述的处理方式为单次注射。剂量和给药频率均取决于所选处理方式及优化条件。对于较小的肿瘤，单次注射即可充分分布药物；而对于较大的肿瘤，可能需要多次注射以确保药物在肿瘤组织内均匀分布。</li>
	<li>缓慢而稳定地注射处理液。注射完成后暂停10秒，再缓慢拔出针头，以尽量减少回流或渗漏。某些肿瘤内部压力较高，需注意防止液体从针孔处渗出。</li>
	<li>对每只小鼠重复上述操作。每处理4–5只小鼠后或更换处理组时均应更换注射器，以防止交叉污染。</li>
	<li>麻醉后密切观察小鼠，直至其恢复活动能力和正常呼吸。之后每日持续监测治疗反应及整体健康状况。 
	注意：不同细胞系可能导致肿瘤在不同时间发生溃疡。每项实验及每个IACUC方案均有明确规定的实验终点和排除标准。在本实验室中，小鼠实验的终点为肿瘤体积达1500 mm3，且出现的溃疡被接受，不作为排除标准。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhang, W., Moore, L., Ji, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+cancer+research.">Mouse models for cancer research.</a> Chin J Cancer. 30 (3), 149-152 (2011).</li><li>Silihe Kamga, K., Fiering, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral+immunotherapy+prior+to+cancer+surgery+a+promising+therapeutic+approach.">Intratumoral immunotherapy prior to cancer surgery a promising therapeutic approach.</a> Front Immunol. 16, 1545000 (2025).</li><li>Carlson, P. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depth+of+tumor+implantation+affects+response+to+in+situ+vaccination+in+a+syngeneic+murine+melanoma+model.">Depth of tumor implantation affects response to in situ vaccination in a syngeneic murine melanoma model.</a> J Immunother Cancer. 9 (4), e002107 (2021).</li><li>Bonnotte, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intradermal+injection+as+opposed+to+subcutaneous+injection+enhances+immunogenicity+and+suppresses+tumorigenicity+of+tumor+cells.">Intradermal injection as opposed to subcutaneous injection enhances immunogenicity and suppresses tumorigenicity of tumor cells.</a> Cancer Res. 63 (9), 2145-2149 (2003).</li><li>Garber, J. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).</li><li>Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+for+pre-clinical+study+of+human+cancer+immunotherapy.">Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy.</a> Curr Protoc Immunol. 109, 20.1.1-20.1.43 (2015).</li><li>Mao, C., Beiss, V., Ho, G. W., Fields, J., Steinmetz, N. F., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ.+vaccination+with+cowpea+mosaic+virus+elicits+systemic+antitumor+immunity+and+potentiates+immune+checkpoint+blockade.">In situ. vaccination with cowpea mosaic virus elicits systemic antitumor immunity and potentiates immune checkpoint blockade.</a> J Immunother Cancer. 10 (12), e005834 (2022).</li><li>Ho, G. W., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral+expression+of+IL-12+and+CD40+ligand+(CD154)+from+plasmids+generates+antitumor+responses+that+eliminate+tumoral+T+regs.">Intratumoral expression of IL-12 and CD40 ligand (CD154) from plasmids generates antitumor responses that eliminate tumoral T regs.</a> Sci Rep. 15 (1), 24439 (2025).</li><li>Kim, Y. C., Jarrahian, C., Zehrung, D., Mitragotri, S., Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+systems+for+intradermal+vaccination.">Delivery systems for intradermal vaccination.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 351, 77-112 (2012).</li><li>Chen, X. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+adjuvants+for+intradermal+vaccination.">Emerging adjuvants for intradermal vaccination.</a> Int J Pharm. 632, 122559 (2023).</li><li>Hickling, J. K., Jones, K. R., Friede, M., Zehrung, D., Chen, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intradermal+delivery+of+vaccines:+potential+benefits+and+current+challenges.">Intradermal delivery of vaccines: potential benefits and current challenges.</a> Bull World Health Organ. 89 (3), 221-226 (2011).</li></ol>

作者声明无利益冲突。

该方案的成功（图4）依赖于保持一致的皮内注射深度和精确的针头定位，以确保将物质注入真皮层而非皮下层。如果针头角度过陡或注射压力过高，染料或肿瘤细胞可能穿透皮肤进入皮下间隙。注射后，在缓慢拔出针头前短暂停顿，有助于防止液体渗漏或在 flank 部位形成双灶性肿瘤（“雪人”样外观）。在练习注射和操作小鼠时，应始终牢固握持小鼠，以最大限度降低意外针刺伤的风险。若出现问题，可通过观察是否形成可见的“水泡”来排查，该现象表明针头位于皮内；同时确保注射器在使用前不含气泡。保持皮肤紧绷可提高注射准确性，定期更换注射器则可避免针头变钝，从而维持操作精度。在雄性小鼠上进行练习有助于建立稳定的技术，因其皮肤较厚且延展性较差。
使用 freshly prepared 肿瘤细胞悬液也至关重要，因为长时间在冰上保存会降低细胞活力和成瘤率。在注射过程中通过轻柔倒置悬液可保持细胞分布均匀，确保小鼠间肿瘤生长的一致性。在比较不同实验组之间的肿瘤生长动态或免疫反应时，必须注意这些技术细节。当肿瘤生长至适合瘤内注射的大小时，应小心处理所有治疗溶液。确保每种溶...

小鼠肿瘤模型是癌症研究中不可或缺的工具。在理想的小鼠模型中，能够诱导出在基因和形态学水平上都高度模拟人类肿瘤的肿瘤1。这使得研究人员能够在不同领域评估新型治疗方法的有效性，包括肿瘤内免疫治疗（ITIT）。ITIT 是癌症治疗中的一个新兴领域，其方法是将免疫刺激剂直接注射到肿瘤微环境（TME）中。这种局部给药方式可增强局部免疫激活，逆转免疫抑制性的肿瘤微环境，并引发全身性的抗肿瘤免疫反应，即所谓的远端效应2。然而，肿瘤内注射的效率、准确性和一致性取决于在不同肿瘤模型中对注射参数进行可视化和控制的能力。
大多数临床前癌症研究采用皮下肿瘤移植模型。然而，这种方法在进行瘤内治疗时存在局限性，因为在注射过程中无法直接观察肿瘤，除非实施手术。许多瘤内免疫治疗策略需要将试剂精确递送至小鼠的微小肿瘤中，并且通常需要多次完成该操作。若缺乏可视化确认，皮下肿瘤的注射准确性和试剂保留率将难以控制，这可能导致实验数据的误读或出现较大变异3。
皮内肿瘤植入为肿瘤的观察、测量以及瘤内注射提供了一种直接、易于操作、可直观监测且可重复的方法，从而提高了实验的一致性。此外，研究显示，与皮下注射相比，皮内植入的肿瘤可增强肿瘤细胞的免疫原性，并抑制其致瘤性4。皮内接种的肿瘤能够迅速且强烈地诱导树突状细胞向淋巴结迁移，从而更早、更有效地激活肿瘤特异性细胞毒性T细胞4。本研究详细描述了一种在C57BL/6小鼠中建立皮内B16F10黑色素瘤肿瘤并进行后续瘤内治疗的可重复实验方案。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 天然离心管</td><td>USA Scientific&amp;nbsp;</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>150 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 细胞培养瓶</td><td>康宁</td><td>430825</td><td></td></tr><tr><td>Fluriso</td><td>Vet One</td><td>13985-528-60</td><td>异氟烷</td></tr><tr><td>食用色素</td><td>Durkee</td><td></td><td>用于练习</td></tr><tr><td>胰岛素注射器 0.33 x 12.7 mm</td><td>Exel</td><td>26018</td><td></td></tr><tr><td>迷你 Arco</td><td>Wahl</td><td>08787-450A</td><td>使用电推剪为小鼠剃毛</td></tr><tr><td>PBS，1×，无钙 &amp;和镁</td><td>康宁</td><td>06325002</td><td>pH 7.4 ± 0.1</td></tr><tr><td>RPMI 1640, 1x</td><td>康宁</td><td>12225004</td><td></td></tr><tr><td>SomnoFlo 低流量电子蒸发器</td><td>Kent Scientific&amp;nbsp;</td><td>SF-01</td><td>麻醉机</td></tr></tbody></table>

皮内肿瘤移植作为小鼠肿瘤内免疫治疗研究的稳健模型

Intradermal Tumor Implantation as a Robust Model for Murine Cancer Intratumoral Immunotherapy Studies

建立可重复的小鼠肿瘤模型对于评估癌症生物学和免疫治疗策略至关重要。瘤内免疫治疗通过向已形成的肿瘤注射免疫刺激试剂，以逆转局部免疫抑制并激发全身性抗肿瘤免疫反应。目前大多数小鼠癌症研究将肿瘤建立在皮下空间，但由于无法观察瘤内注射过程，该方法在实验性瘤内免疫治疗中存在固有挑战。通过表皮内注射肿瘤细胞可可靠地生成可视化的肿瘤，从而支持准确且可重复的瘤内注射，并便于监测肿瘤生长动力学及治疗反应。本文以C57BL/6小鼠中使用小鼠B16F10黑色素瘤模型为例，介绍一种建立和治疗表皮内肿瘤的可重复方法。将肿瘤细胞悬液进行表皮内注射，在肿瘤植入后7–10天，当肿瘤体积达到约60 mm3时，可直接进行瘤内注射免疫刺激剂，或施加电穿孔、加热等物理治疗。该方法可实现治疗药物的精确定位递送，并使用游标卡尺准确测量肿瘤生长，避免了因无法观察而导致的多次皮下肿瘤治疗所固有的变异性问题。本文通过详细阐述该技术，旨在支持瘤内免疫治疗领域临床前研究的可重复性并推动其发展。

使用染料练习注射时，可通过观察注射部位是否形成可见的“水泡”来确认皮内注射是否成功，而无需处死小鼠。正确的皮内注射会产生一个大而清晰且隆起的“水泡”（图1A–F）。若水泡较小或扁平，提示注射可能部分进入皮下组织。若未形成“水泡”，且染料或细胞在皮肤下扩散，则注射很可能已进入皮下层（图1G–J）。若在练习注射后处死动物，可切开皮肤以识别是否有注射液泄漏至皮下间隙。
皮内注射后约5天，肿瘤应变得可见，7–10天后应适合进行治疗。为确认肿瘤位于皮内而非皮下，可采用两种验证方法。首先，可用非优势手轻轻提起小鼠背部皮肤，用优势手触诊肿瘤以进行检查。皮内肿瘤通常触感坚实、固定且不可移动（图2A、B）；而皮下肿瘤触感较软或呈“松软”状，通常可自由移动，边界较不清晰（图2C</s...

随着人们对肿瘤内免疫治疗的兴趣日益增加，选择易于操作且实用的肿瘤模型至关重要。皮下肿瘤虽然易于建立，但难以观察和操作。在本方案中，我们描述了建立皮内肿瘤的方法，该方法可提供更佳的可见性和可及性。

建立可重复的小鼠肿瘤模型对于评估癌症生物学和免疫治疗策略至关重要。瘤内免疫治疗可治疗……

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