ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢马里兰大学医学院的 Mark T. Gladwin 博士（院长兼教授）在研究设计方面提供的指导。同时感谢马里兰大学医学院共聚焦显微镜核心设施（美国马里兰州巴尔的摩市）提供共聚焦显微镜资源的使用权限。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 5R01HL168775，授予 Paola Corti 博士。

所有动物实验程序均经马里兰大学机构动物护理和使用委员会审查并批准（方案编号：AUP–00004632）。
注意：该实验方案需要约2天时间分离小鼠气管上皮细胞（MTEC），随后进行7–10天的扩增培养，5–6天在Transwell小室中增殖，21天分化培养（获得足够数量的多纤毛细胞所需时间），24小时药物处理，以及额外1天用于样品收集、NOA校准、注射和数据采集。
1.&#160;培养基与溶液的配制
注意：有关培养基成分的详细信息，请参见表1。
<ol>
	<li>Ham’s F–12 培养基
	<ol>
		<li>在无菌超净工作台内配制溶液。向无菌瓶中的 500 mL Ham’s F12 培养基中加入 5 mL 100× 青霉素/链霉素抗生素溶液和 0.5 mL 两性霉素 B（Fungizone）。</li>
		<li>轻轻倒置瓶子 5–10 次以充分混匀。在无菌条件下使用 0.22 µm 滤器过滤除菌，并于 4 °C 保存。 
		&#8203;注意：青霉素/链霉素和两性霉素 B 为抗菌剂，可能引起刺激或过敏反应。操作时应佩戴适当个人防护装备，包括手套和实验服。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白酶 K 溶液
	<ol>
		<li>在无菌离心管中将 15 mg 蛋白酶 K 加入 10 mL 无菌 Ham’s F12 培养基中，配制成 0.15% 的蛋白酶 K 溶液。通过轻轻倒置或反复吹打混匀，直至蛋白酶 K 完全溶解。使用前即刻新鲜配制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNase I 溶液
	<ol>
		<li>在无菌离心管中加入 5 mg 粗制胰 DNase I、9 mL Ham’s F12 培养基和 1 mL 10 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）溶液，配制成 0.5 mg/mL 的 DNase I 溶液。</li>
		<li>通过反复吹打轻轻混匀，直至 DNase I 完全溶解，避免产生气泡。完全溶解后，将溶液分装至 1 mL 无菌微量离心管中，于 -20 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>含胎牛血清（FBS）的 Ham’s F12 培养基
	<ol>
		<li>在室温下的无菌超净工作台内配制溶液。在无菌锥形管中向 40 mL 含抗生素的 Ham’s F12 培养基中加入 10 mL 胎牛血清（FBS），得到含 20% FBS 的 F12 培养基。</li>
		<li>轻轻倒置离心管 5–10 次，直至溶液均匀。在无菌条件下使用 0.22 µm 滤器过滤除菌，并于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MTEC 扩增培养基
	<ol>
		<li>在室温下的无菌超净工作台内，将 表 1 所列组分加入无菌瓶中，配制 MTEC 扩增培养基。</li>
		<li>通过轻轻摇动或倒置容器充分混匀，直至所有组分完全混合。在无菌条件下使用 0.22 µm 滤器过滤除菌。</li>
		<li>使用前立即加入 ROCK 抑制剂 Y–27632（5 mM 储存液）至终浓度 10 µM，以及 Notch γ-分泌酶抑制剂 DAPT（10 mM 储存液）至终浓度 5 µM，再轻轻倒置混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MTEC 增殖培养基
	<ol>
		<li>在室温下的无菌超净工作台内，将 表 1 所列组分混合，配制 MTEC 增殖培养基。</li>
		<li>通过轻轻倒置或摇动充分混匀，直至所有组分完全混合。在无菌条件下使用 0.22 µm 滤器过滤除菌。</li>
		<li>使用前立即加入 ROCK 抑制剂 Y–27632（5 mM 储存液）至终浓度 10 µM，以及视黄酸（5 µM 储存液）至终浓度 0.05 µM。使用前轻轻倒置混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MTEC 分化培养基
	<ol>
		<li>在室温下的无菌超净工作台内，将 表 1 所列组分加入无菌容器中，配制 MTEC 分化培养基&#160;。</li>
		<li>通过轻轻倒置或摇动充分混匀，直至所有组分完全混合。在无菌条件下使用 0.22 µm 滤器过滤除菌。</li>
		<li>使用前立即加入视黄酸至终浓度 0.05 µM，并轻轻倒置混匀。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 小鼠气管上皮细胞（MTEC）的分离
<ol>
	<li>根据机构 IACUC 指南，在经批准的安乐死装置中通过吸入二氧化碳（CO2）对三只成年小鼠（8–20 周龄）实施安乐死。在采集组织前确认动物死亡。</li>
	<li>将动物仰卧（胸部朝上）放置于无菌操作台面上。使用洁净镊子轻轻提起皮肤，用手术剪从下唇至腹部剪开皮肤，暴露气管。</li>
	<li>移开唾液腺，清除结缔组织和气管肌以暴露软骨环。完整解剖整段气管，并将其放入含有无菌 Ham’s F12 培养基的培养皿中。将三根气管合并置于同一培养皿中。</li>
	<li>将培养皿转移至超净工作台，并将&#160;气管转移至另一含有新鲜 Ham’s F12 培养基的培养皿中。去除所有气管外组织，并沿管腔纵向剪开气管。</li>
	<li>将所有气管转移至一个含有 10 mL 无菌 0.15% 蛋白酶溶液的 50 mL 螺口锥形管中。于 4 °C 下孵育 16–18 小时。</li>
</ol>
3.&#160;细胞分离与初始扩增
<ol>
	<li>次日，将含有组织的离心管倒置10–15次，以解离上皮细胞，并在4 °C下孵育45分钟。加入含20%胎牛血清（FBS）的10 mL Ham’s培养基以终止pronase反应，再通过倒置10–15次混匀。</li>
	<li>向三个15 mL离心管中各加入10 mL含FBS的Ham’s F12培养基。用巴斯德吸管将气管组织从50 mL离心管中依次转移至第一、第二和第三个15 mL离心管中，每管倒置10–15次，以充分解离气管上皮细胞。完成最终转移后弃去组织。</li>
	<li>将三个15 mL离心管中的全部培养基与50 mL离心管中的培养基合并，于4 °C下以360 × g离心10分钟。小心吸除上清液，加入0.5 mL浓度为0.5 mg/mL的DNase I溶液，冰上孵育5分钟。</li>
	<li>于4 °C下以360 × g离心5分钟，小心弃去上清液，将细胞沉淀重悬于7–10 mL MTEC扩增培养基中。</li>
</ol>
4.&#160;MTEC的扩增与分化
<ol>
	<li>使用10 mL浓度为50 µg/mL的I型胶原蛋白（大鼠尾部来源），在T75细胞培养瓶中进行包被处理，37 °C孵育16–18小时。吸除T75培养瓶中的胶原溶液，用PBS（1×）洗涤培养瓶三次。让培养瓶完全干燥。</li>
	<li>将含有细胞的7–10 mL MTEC扩增培养基细胞悬液接种至胶原包被的培养瓶中。将培养瓶置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养。每2至3天更换一次扩增培养基，并监测细胞数量，直至细胞融合度达到70%。</li>
	<li>当细胞融合度达到70%时，加入1 mL Accutase溶液，37 °C孵育10–15分钟，使细胞单层脱落。用10 mL MTEC增殖培养基重悬细胞，室温下以1057 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于增殖培养基中并进行细胞计数。</li>
	<li>将2 × 105个细胞以0.5 mL体积接种至预先包被胶原蛋白的Transwell小室（膜直径12 mm，膜孔径0.4 µm）中。在每个小室的基底室中加入1.5 mL培养基，并将Transwell小室置于37 °C培养箱中。</li>
	<li>在第3天更换顶腔和基底腔中的培养基，继续培养至细胞融合度达到100%，通常在第5或第6天完成。设置一个不含细胞的小室作为空白对照。</li>
	<li>细胞融合后，用0.5 mL MTEC分化培养基对顶腔进行洗涤。仅在基底腔中加入0.75 mL分化培养基，建立气液界面（ALI），使顶腔中的细胞暴露于空气中&#160;。</li>
	<li>每2–3天用分化培养基清洗顶腔表面，并更换基底腔中的培养基。维持细胞在气液界面条件下分化培养21天。</li>
</ol>
5. 纤毛上皮细胞的免疫标记与成像
<ol>
	<li>在气液界面培养第7、14和21天，使用4%多聚甲醛（PFA）固定细胞。</li>
	<li>采用抗–FoxJ1抗体对细胞进行免疫染色以检测FoxJ1（一种对运动性纤毛发生至关重要的转录因子）25,26，并使用抗–乙酰化α–微管蛋白抗体检测乙酰化α–微管蛋白（运动性纤毛的结构标志物），操作依据已发表的实验方案27,28,29。 
	注意：PFA为危险化学品，固定细胞时须穿戴适当的个人防护装备（至少佩戴腈类手套和实验服）。</li>
	<li>使用40×或60×物镜通过共聚焦显微镜采集免疫染色细胞的图像。采集深度为10 µm的Z–层扫描图像，每步间距为0.5 µm。</li>
	<li>设置激光功率、探测器增益和曝光参数，以避免信号饱和，并确保各样本间的成像参数具有可比性。</li>
	<li>使用FIJI图像分析软件中的细胞计数插件，将FoxJ1阳性或乙酰化微管蛋白阳性细胞数量量化为每个感兴趣区域（ROI）内总细胞数（DAPI阳性）的百分比。</li>
	<li>在GraphPad Prism软件（v. 10.0）中绘制图表，并在使用Shapiro-Wilk检验评估数据正态分布后，采用双尾Student’s t检验进行统计分析。</li>
</ol>
6. 分化气道上皮的药物处理
<ol>
	<li>在 ALI 第 21 天准备&#160;分化培养基（每3个插入式培养皿中的细胞使用3 mL）&#160;在室温下的无菌试管中。</li>
	<li>从100 mM储备液（用10 mM NaOH配制）中取7.5 µL二乙烯三胺-亚硝基化合物（Diethylene triamine–NONOate，DETA/NO），加入3 mL分化培养基中，使终浓度为250 µM。轻轻颠倒混匀，立即使用。</li>
	<li>向每个样品中加入 750 µL 的终溶液&#160;三个含有分化细胞的基底腔室，37 °C 培养 24 h。</li>
	<li>通过将 30 µL 的 100 mM L-NAME 储存液（溶于 DMSO）加入 MTEC 分化培养基中，定容至总体积 3 mL，配制 1 mM Nω-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）。</li>
	<li>向每个样品中加入 750 µL 的终溶液&#160;三个基础腔室，于37 °C孵育24小时。</li>
	<li>向3 mL基础培养基（1% v/v）中仅加入30 µL二甲基亚砜（DMSO）（未处理组）。</li>
	<li>在三个插入式培养小室（未处理）的基底室中各加入 750 µL 最终溶液。</li>
</ol>
7. 样品采集
注意：进行NOA分析时，必须合并样本&#160;来自三个插入物的培养基、顶端冲洗液和细胞裂解物样本。
<ol>
	<li>在气液界面培养第22天，从正在分化的气道上皮中收集样本，首先从每个实验组的三个小室中各取750 µL基础培养基。</li>
	<li>收集未接种细胞的小室中孵育的基础培养基，作为空白对照，以排除潜在的外界亚硝酸盐污染。</li>
	<li>将三个小室的基础培养基合并，并立即在-20 °C下保存，直至注入NOA仪器。</li>
	<li>为收集上皮顶膜黏液中的亚硝酸盐/一氧化氮，向每个小室的细胞表面加入50 µL预热的PBS（1×）缓冲液（无菌、分装并冷冻），在37 °C孵育30分钟。 
	注意：在细胞与PBS孵育30分钟以收集顶膜冲洗液期间，也可向基底室加入PBS，以维持细胞两侧的湿润环境。</li>
	<li>收集覆盖在上皮表面、含有黏液的PBS溶液。</li>
	<li>将三个小室的PBS冲洗液合并，从每个实验条件下获得约150 µL的顶膜黏液/PBS混合液，足以进行两次NOA注射。</li>
	<li>将顶膜冲洗样本在-20 °C下保存，以备后续使用。</li>
	<li>同时保存PBS冲洗缓冲液，作为NOA注射时的空白对照。</li>
	<li>用500 µL预热的PBS对三个小室中细胞的顶膜和基底膜两侧各清洗两次。</li>
	<li>在顶膜侧加入500 µL Accutase溶液，孵育15–20分钟，直至细胞完全从膜上脱离。</li>
	<li>待细胞完全脱落后，向细胞中加入无血清RPMI-1640培养基（培养基与Accutase体积比为3:1）。</li>
	<li>将三个小室中脱落的细胞汇集至同一离心管中。</li>
	<li>在4 °C下以3000 × g离心5分钟。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于50 µL裂解液（RIPA缓冲液 + Halt 1×蛋白酶抑制剂混合液）中，冰上孵育45分钟。</li>
	<li>在4 °C下以14,800 × g离心20分钟，收集上清液。</li>
	<li>取3 µL全细胞裂解液，通过二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白浓度&#160;。</li>
	<li>用RIPA缓冲液将剩余裂解液按1:1比例稀释，以获得足够体积进行两次50 µL的NOA注射。</li>
	<li>将裂解液在-80 °C下保存，直至在-20 °C条件下注入NOA&#160;。</li>
	<li>将用于重悬细胞沉淀的RIPA缓冲液在-20 °C下保存，作为裂解液样本的空白及污染对照。</li>
</ol>
8. NOA 校准与样品进样
<ol>
	<li>通过将400 mg碘化钾和250 mg碘溶解于28 mL冰醋酸和8 mL超纯水中，制备三碘化物试剂。</li>
	<li>在通风橱中使用适当的个人防护装备（实验服、手套和护目镜）进行&#160;三碘化物&#160;试剂的配制。 
	警告：碘和冰醋酸具有危险性，可能对皮肤和眼睛造成刺激和腐蚀。</li>
	<li>室温下储存，并在配制后2周内使用。</li>
	<li>用无亚硝酸盐的水配制1 mM亚硝酸钠储备液。</li>
	<li>将储备液储存在-20 °C直至使用。</li>
	<li>在注射前立即用PBS配制新鲜的工作标准品（0.125–4.0 µM）。 
	注意：用于NOA校准的PBS应为无菌、密封良好的PBS，以尽量减少亚硝酸盐污染。</li>
	<li>打开氮气（N2）载气并启动系统中的气体流动。</li>
	<li>组装玻璃吹扫装置，并向其中加入4 mL三碘化物试剂和20 µL按1:10稀释的消泡剂。</li>
	<li>用隔垫密封装置，并用螺口盖固定，确保气密性。</li>
	<li>向NaOH捕集阱中倒入10 mL氢氧化钠（NaOH）溶液。</li>
	<li>在NOA仪器（nCLD 88）的显示屏上选择 测量，选择气体和量程。</li>
	<li>将仪器设置为 MR2:50.00，对应NO检测范围为0至50 ppb，并选择 快速 滤波模式。</li>
	<li>调节氮气压力，使反应器压力稳定在27–29 psi（186–200 kPa）之间。</li>
	<li>打开连接NOA的计算机上的eDAQ图表软件。</li>
	<li>将采集速率设为10/s，电压设为10 V。</li>
	<li>进入 设置 &#62; 通道设置，选择 通道1。</li>
	<li>在NOA软件中将显示比例设为 2:1。</li>
	<li>启动NOA仪器及软件的数据采集。</li>
	<li>监测基线直至其稳定。</li>
	<li>使用Hamilton注射器通过隔垫向吹扫装置中注入10 µL PBS，以确认基线稳定性。</li>
	<li>记录每次注射后的化学发光信号。</li>
	<li>向吹扫装置中注入10 µL 0.125 µM亚硝酸盐标准品。</li>
	<li>对每个亚硝酸盐标准品重复两次，以获得可后续取平均值的重复测量结果。</li>
	<li>在 注释 标签页中对每次注射进行标注（例如：10 µL 0.5 µM亚硝酸盐）。</li>
	<li>用无尘纸擦拭注射器，并用无菌无亚硝酸盐水冲洗3–4次，以去除残留的三碘化物。</li>
	<li>每次注射后重复此清洗步骤。</li>
	<li>每次注射之间等待信号恢复至基线（20–30 s）。</li>
	<li>打开 流动分析 窗口。</li>
	<li>在分析表中查看每次注射的峰高和时间值。</li>
	<li>选中每个峰并调整选区，以计算曲线下面积（AUC）。</li>
	<li>将显示模式从 S 切换至 C，以启用校准模式。</li>
	<li>在 量 列中输入各标准品已知的亚硝酸盐含量。</li>
	<li>点击 校准曲线 按钮生成标准曲线。</li>
	<li>验证校准曲线是否符合接受标准（R2 ≥ 0.99）。</li>
	<li>将先前从ALI培养物中收集的生物样本在冰上解冻。</li>
	<li>向吹扫装置中注入50 µL空白无细胞培养基。</li>
	<li>向吹扫装置中注入每种基础培养基样本50 µL。</li>
	<li>记录每次注射的化学发光信号。</li>
	<li>对每个样本进行两次重复注射（每次50 µL）。 
	注意：50 µL注射常导致气泡形成。为减少此问题，应定期在吹扫装置中更换含消泡剂的三碘化物试剂。</li>
	<li>在注射前于 注释 标签页中对每个样本进行标注。</li>
	<li>向吹扫装置中注入50 µL无细胞PBS（顶侧空白）。</li>
	<li>注入顶侧洗脱样本（每个样本两次50 µL注射），并记录相应的信号峰。</li>
	<li>先注入RIPA裂解液两次，随后注入裂解物样本（每个样本两次50 µL注射），并记录相应的信号峰。 
	注意：始终等待化学发光曲线回到基线并稳定。等待20–30 s后，再注入下一个样本。</li>
	<li>样本注射结束后，打开 流动分析 窗口。</li>
	<li>选中每个样本峰，计算其曲线下面积（AUC）。</li>
	<li>利用标准溶液生成的校准曲线，确定各样本的亚硝酸盐浓度。</li>
</ol>
9. 数据收集、标准化与分析
<ol>
	<li>将 eDAQ 软件中 Flow Analysis 功能的数据（包括峰高（V）、曲线下面积（V·s）和平均曲线下面积）导出至 Excel 文件。导出的文件将列出整个 NOA 实验过程中信号轨迹的峰高（V）随时间（s）变化的数据表。</li>
	<li>通过将亚硝酸盐浓度（µM）乘以进样体积（µL），计算注入 NOA 的亚硝酸盐的皮摩尔数（pmol）。</li>
	<li>计算对照组（无细胞培养基、PBS 洗涤缓冲液或 RIPA 缓冲液）中测得的亚硝酸盐皮摩尔数（pmol）的平均值。</li>
	<li>从每次 50 µL 样品进样测得的 pmol 值中减去相应的对照值。</li>
	<li>通过将样品进样部分测得的亚硝酸盐 pmol 值乘以实际收集的总样品体积，计算每个样品中亚硝酸盐的总皮摩尔数（pmol）。培养基使用 750 µL，顶侧洗涤液使用 150 µL，裂解液使用约 90–100 µL。</li>
	<li>此外，仅针对裂解液样品，需将总亚硝酸盐 pmol 值乘以 2，以校正稀释倍数。</li>
	<li>将每个样品获得的亚硝酸盐 pmol 值除以相应样品裂解液中的总蛋白含量（µg）（此前通过 BCA 法测定），进行归一化处理。</li>
	<li>对每个样品两次重复进样的亚硝酸盐水平（pmol/µg）取平均值。</li>
	<li>使用 GraphPad Prism 软件绘制每个样品的归一化亚硝酸盐水平（以每微克总蛋白计的 pmol/µg）。</li>
	<li>采用 Shapiro-Wilk 检验评估数据分布的正态性。</li>
	<li>采用双尾 Student t 检验进行统计学分析。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Alc&#225;zar&#8211;Navarrete, B., Ruiz Rodr&#237;guez, O., Conde Baena, P, Romero Palacios, P. J., Agusti, A. Persistently elevated exhaled nitric oxide fraction is associated with increased risk of exacerbation in COPD. Eur Respir J. 2018;51(1):1701457.</li>
	<li>Krantz, C., Janson, C., Alving, K., Malinovschi, A. Nasal nitric oxide in relation to asthma characteristics in a longitudinal asthma cohort study. Nitric Oxide 2021;106:1&#8211;8.</li>
	<li>Thomas, S. R., Kharitonov, S. A., Scott, S. F., Hodson, M. E., Barnes, P. J. Nasal and exhaled nitric oxide is reduced in adult patients with cystic fibrosis and does not correlate with cystic fibrosis genotype. Chest 2000;117(4):1085&#8211;9.</li>
	<li>Shapiro, A. J. et al. Nasal nitric oxide measurement in primary ciliary dyskinesia. A technical paper on standardized testing protocols. Ann Am Thorac Soc. 2020;17(2):e1&#8211;e12 .</li>
	<li>Legendre, M., Zaragosi, L. E., Mitchison, H. M. Motile cilia and airway disease. Semin Cell Dev Biol. 2021;110:19&#8211;33.</li>
	<li>Li, D., Shirakami, G., Zhan, X., Johns, R. A. Regulation of ciliary beat frequency by the nitric oxide&#8211;cyclic guanosine monophosphate signaling pathway in rat airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 2000;23(2):175&#8211;81.</li>
	<li>Rochon, E. R. et al. Cytoglobin regulates NO-dependent cilia motility and organ laterality during development. Nat Commun. 2023;14(1): 8333.</li>
	<li>Mikhailik, A. et al. nNOS regulates ciliated cell polarity, ciliary beat frequency, and directional flow in mouse trachea. Life Sci Alliance 2021;4(5):e202000981.</li>
	<li>Schamberger, A. C., Staab&#8211;Weijnitz, C. A., Mise&#8211;Racek, N., Eickelberg, O. Cigarette smoke alters primary human bronchial epithelial cell differentiation at the air&#8211;liquid interface. Sci Rep. 2015;5:8163.</li>
	<li>Gindele, J. A. et al. Intermittent exposure to whole cigarette smoke alters the differentiation of primary small airway epithelial cells in the air&#8211;liquid interface culture. Sci Rep. 2020;10(1):6257.</li>
	<li>Ghosh, B. et al. Effect of sub-chronic exposure to cigarette smoke, electronic cigarette and waterpipe on human lung epithelial barrier function. BMC Pulm Med. 2020;20(1):216.</li>
	<li>Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. Air-liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: promises, challenges and future directions. Adv Nanobiomed Res. 2021;1(6):2000111.</li>
	<li>Bessa, M. J. et al.&#160;In vitro&#160;toxicity of industrially relevant engineered nanoparticles in human alveolar epithelial cells: Air-liquid interface&#160;versus&#160;submerged cultures. Nanomaterials (Basel) 2021;11(12):3225.</li>
	<li>Allouche, Y. et al. Comparison of submerged and air liquid interface exposure: limitations and differences in the toxicological effects evaluated in bronchial epithelial cells. Environ Res. 2025;279(Pt 2):121856.</li>
	<li>Li, J., LoBue, A., Heuser, S. K., Leo, F., Cortese-Krott, M. M. Using diaminofluoresceins (DAFs) in nitric oxide research. Nitric Oxide. 2021;115:44&#8211;54.</li>
	<li>Jiang S. et al. Real&#8211;time electrical detection of nitric oxide in biological systems with sub&#8211;nanomolar sensitivity. Nat Commun. 2013;4:2225.&#160;</li>
	<li>Brown M. D, Schoenfisch M. H. Electrochemical nitric oxide sensors: Principles of design and characterization. Chem Rev. 2019;119(22):11551&#8211;75.</li>
	<li>Corti, P. et al. Globin X is a six-coordinate globin that reduces nitrite to nitric oxide in fish red blood cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2016;113(30):8538&#8211;43.</li>
	<li>Zhao, X. J. et al. Mechanisms for cellular NO oxidation and nitrite formation in lung epithelial cells. Free Radic Biol Med. 2013;61:428&#8211;37.</li>
	<li>Lundberg, J. O. Weitzberg E, Gladwin MT. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2008;7(2):156&#8211;67.</li>
	<li>Rochon, E. R., Corti, P. Globins and nitric oxide homeostasis in fish embryonic development. Mar Genomics 2020;49:100721.</li>
	<li>Giordano, D., Verde, C., Corti, P. Nitric oxide production and regulation in the teleost cardiovascular system. Antioxidants (Basel) 2022;11(5):957.</li>
	<li>MacArthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S&#8211;nitrosothiols by reductive chemiluminescence. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007;851(1&#8211;2):93&#8211;105.</li>
	<li>Basu, S., Ricart, K., Gladwin, M. T., Patel, R. P, Kim-Shapiro, D. B. Tri-iodide and vanadium chloride based chemiluminescent methods for quantification of nitrogen oxides. Nitric Oxide 2022;121: 11&#8211;19.</li>
	<li>Brody, S. L., Yan, X. H., Wuerffel, M. K., Song, S. K., Shapiro, S. D. Ciliogenesis and left-right axis defects in forkhead factor HFH-4-null mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 2000;23(1): 45&#8211;51.</li>
	<li>Jain, R. et al. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 2010;43(6): 731&#8211;9.</li>
	<li>Eenjes, E. et al. A novel method for expansion and differentiation of mouse tracheal epithelial cells in culture. Sci Rep. 2018;8(1): 7349.</li>
	<li>You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2002;283(6): L1315&#8211;21.</li>
	<li>Pfeiffer, S., Leopold, E., Schmidt, K., Brunner, F., Mayer, B. Inhibition of nitric oxide synthesis by NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME): requirement for bioactivation to the free acid, NG-nitro-L-arginine. Br J Pharmacol 1996;118(6):1433&#8211;40.&#160;</li>
	<li>Rochon, E. R., Corti, P., Gladwin, M. T. Hemoglobin &#945; in Pulmonary Endothelium: Ironing Out Nitric Oxide Signaling. Am J Respir Cell Mol Biol. 2017;57(6):639&#8211;41.</li>
	<li>van Faassen, E. E. et al. Nitrite as regulator of hypoxic signaling in mammalian physiology. Med Res Rev. 2009;29(5):683&#8211;741.&#160;</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

气道上皮中的多纤毛细胞对一氧化氮（NO）的合成与信号传导至关重要，而后者对于调控纤毛摆动、黏液纤毛清除功能及气道稳态具有重要作用6,7,8。NO是一种高活性分子，其水平的微小变化均与气道疾病相关1,2,3,4。因此，维持精确调控的NO水平对于气道正常功能至关重要。本文介绍一种在气液界面（ALI）培养的纤毛气道上皮细胞中，通过检测亚硝酸盐来间接反映NO生成的方法。小鼠气管上皮细胞（MTEC）经分离后在ALI条件下分化，方法在既往已发表方案27,28基础上略作修改，以获得足够数量的多纤毛...

多种气道疾病（包括哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、囊性纤维化（CF）和原发性纤毛运动障碍（PCD））的一个共同特征是，一氧化氮（NO）稳态发生改变，表现为呼出气中NO水平的变化。这些疾病中NO水平变化显著：在COPD和哮喘中升高1,2，而在CF和PCD中则显著降低3,4。这些疾病通常伴有气道上皮运动纤毛的异常，而运动纤毛是黏液纤毛清除功能的关键效应器5。由于NO及其下游信号通路是调控纤毛运动的重要因子，因此了解在这些病理条件下NO的生成与信号传导如何改变，对于阐明黏液纤毛功能障碍的机制至关重要。因此，能够精确定位和检测气道上皮中NO生成与释放的方法，为解析该信号分子的调控机制及其生理作用提供了有力工具。这类方法在实验中尤为有用，因为在实际操作中，由于NO半衰期短且反应迅速，直接测量其浓度具有较大挑战性。
一氧化氮（NO）通过影响纤毛细胞的极性和运动纤毛的协调摆动，调控气道纤毛的生成与功能6,7,8。然而，维持气道内NO稳态的机制尚未完全阐明。在气液界面（ALI）条件下分化培养的气道上皮细胞为研究这些机制提供了有价值的体外系统。目前，该模型已广泛用于研究环境损伤对气道上皮的影响9,10,11，并阐明气道疾病的病理生理过程12。与传统的浸没式培养13,14相比，ALI分化的上皮组织能更真实地再现天然气道的结构与功能，包括上皮细胞极性、黏液纤毛分化以及接近生理状态的气液交换，因此特别适用于研究顶端NO的释放、信号传导及其相关的纤毛功能。该系统因而非常适合用于定量检测在上皮细胞分化或药物干预条件下释放到气道腔内的NO代谢产物的实验研究。
准确测量一氧化氮（NO）浓度至关重要，因为NO水平过高或过低均会损害纤毛功能。目前用于检测NO的荧光探针法（例如二氨基荧光素，DAFs）仅为半定量方法，且受限于对pH敏感、依赖氧气以及缺乏特异性，因其可与细胞内的氧化剂和抗氧化剂发生反应，导致测量结果仅为半定量15。此外，电化学传感器（例如NO敏感的安培电极）虽可实现NO的实时检测16，但由于NO半衰期极短、活性氧化还原物质的干扰、电极表面的生物污染以及难以维持稳定的校准，其在复杂生物系统中的应用存在困难17。其他基于化学发光的方法，包括直接气相NO检测以及针对不同氮氧化物种类的还原性检测法也已有报道，但其在气道上皮培养体系中的应用尚未被探索。这些局限性凸显了对高灵敏度、定量方法的需求，以可靠地检测小体积生物样本中低水平的NO衍生物。为克服上述局限，我们建立了一种利用一氧化氮分析仪（NOA）定量检测气液界面（ALI）分化气道上皮细胞顶部分泌物中NO的实验方案。NOA是一种高灵敏度的基于化学发光的检测器，传统上用于检测化学样品中的NO代谢物，近年来也被改进用于分析生物样本，包括血液、组织匀浆和细胞培养上清液7,18,19。NO是一种高活性的信号分子，在正常氧浓度条件下于组织中迅速被氧化为亚硝酸盐（nitrite），其半衰期极短。因此，作为NO氧化终产物的亚硝酸盐可作为生物系统中NO总生成量的指标20,21,22。这种高灵敏度且可重复的化学发光方法可在皮摩尔（picomolar）水平检测亚硝酸盐/NO23,24，非常适合检测来自MTEC ALI培养体系等小体积生物样本中的微小变化。然而，该方法最适用于亚硝酸盐积累能够反映近期NO生成的情况，且可能受到样本处理方式、背景亚硝酸盐污染以及上皮细胞分化状态等因素的影响。因此，必须设置适当的对照并精心设计实验，以确保结果的准确解读。

<table><tbody><tr><td>4&amp;prime;,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td>免疫染色时按1:2000稀释</td></tr><tr><td>50 mL 离心管滤器（0.22 &amp;micro;m）</td><td>CellTreat</td><td>229710</td><td>用于制备无菌溶液</td></tr><tr><td>500 mL 滤器单元</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>566-0020</td><td>用于无菌培养基制备</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>牛垂体提取物</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13028014</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>霍乱毒素</td><td>Sigma</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td>胶原蛋白I</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>配备Hamamatsu sCMOS相机的W1转盘式Ti2倒置显微镜</td></tr><tr><td>Corning Transwell小室</td><td>Sigma</td><td>CLS3460</td><td></td></tr><tr><td>二乙三胺 NONOate（DETA-NONOate）</td><td>Cayman Chemical</td><td>82120</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12培养基</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Halt 1×蛋白酶抑制剂混合液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1860932</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F1-12营养混合物</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素溶液</td><td>Sigma</td><td>I0516</td><td></td></tr><tr><td>异丙肾上腺素盐酸盐</td><td>Sigma</td><td>I6504</td><td></td></tr><tr><td>角质形成细胞无血清培养基</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005042</td><td></td></tr><tr><td>小鼠表皮生长因子</td><td>Sigma</td><td>E4127</td><td></td></tr><tr><td>N(G)-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）</td><td>Sigma</td><td>N5751</td><td></td></tr><tr><td>NuSerum</td><td>Corning</td><td>355100</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA蛋白检测试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>维甲酸</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Rho激酶抑制剂（Y-27632盐酸盐）</td><td>Cayman Chemical</td><td>TOM-C837Z37</td><td></td></tr><tr><td>RIPA裂解缓冲液</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640培养基</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>亚硝酸钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S2252</td><td></td></tr><tr><td>转铁蛋白</td><td>Sigma</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-乙酰化微管蛋白抗体（小鼠）</td><td>Sigma</td><td>T6793</td><td>免疫染色时按1:200稀释</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-FoxJ1抗体（小鼠）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-9965-80</td><td>免疫染色时按1:200稀释</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-鼠Cy3二抗</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10521</td><td>免疫染色时按1:1000稀释</td></tr><tr><td>&amp;gamma;-分泌酶抑制剂IX（DAPT）</td><td>Sigma</td><td>D5942</td><td></td></tr></tbody></table>

气液界面分化的小鼠气管上皮细胞培养物中一氧化氮生成的测定

Measurement of Nitric Oxide Production in Mouse Tracheal Epithelial Cell Cultures Differentiated at the Air Liquid Interface

在气液界面（ALI）分化的气道上皮细胞培养体系提供了一个生理相关性良好的模型，用于研究纤毛细胞中一氧化氮（NO）的信号传导。本文描述了一种通过检测亚硝酸盐（NO₂⁻）——即NO的稳定氧化产物——来定量NO生成的实验方案，样本来源于ALI分化的原代小鼠气管上皮细胞。收集细胞的顶面灌洗液、基底侧培养基和细胞裂解物，采用基于三碘化物的化学发光法结合一氧化氮分析仪（NOA）进行分析。样品注入反应室后，亚硝酸盐被化学还原为NO，随后通过臭氧介导的化学发光法进行检测。根据标准曲线将信号强度转换为亚硝酸盐的皮摩尔（picomoles）量，并将数值归一化至总细胞蛋白含量。通过药理学手段调控NO水平以验证本检测方法的性能：在使用NO供体Diethylenetriamine NONOate（DETA-NONOate）和NO合酶抑制剂N(ω)-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）处理后，不同条件下亚硝酸盐水平呈现显著差异。其中，顶面灌洗液中的信号最强且可重复性最佳，反映了气道上皮释放的NO总量。该方法可稳定检测ALI分化气道上皮样本中的NO，为定量NO生成及模拟与异常NO代谢相关疾病提供了可靠的体外研究平台。

本实验的总体目标是定量检测在气液界面（ALI）分化的小鼠气管上皮细胞（MTEC）培养物中的一氧化氮（NO）水平。原代细胞的分离与分化依据已建立的方案进行27,28。在气液界面培养21天的过程中，细胞分化为包含纤毛细胞的假复层气道上皮27,28。通过Foxj1或乙酰化α-微管蛋白的免疫标记评估纤毛化水平。随着分化进程，正在分化的细胞核内FoxJ1表达逐渐增加（图1A），同时伴有表达乙酰化α-微管蛋白的多纤毛细胞数量相应增加（图1B）。至气液界面培养第21天，约有10%的气道上皮细胞呈现运动纤毛，与既往报道结果一致27,28。
<p class="jove_conte...

本方案描述了一种通过三碘化物化学发光法测定顶端分泌物中的亚硝酸盐，从而量化气液界面（ALI）分化培养的气道上皮细胞中一氧化氮（NO）生成的方法。

气液界面分化的气道上皮培养物为研究一氧化氮（NO）提供了一种生理学相关的模型……

measurement-nitric-oxide-production-mouse-tracheal-epithelial-cell

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

测量在空气-液体界面分化的小鼠气管上皮细胞培养中一氧化氮生成情况

肺上皮细胞可从小鼠呼吸道分离，并在气液界面培养，作为分化型呼吸道上皮的模型。本文描述了一种分离、培养这些细胞并将其暴露于主流香烟烟雾的实验方案，以研究细胞对这种环境毒素的分子响应。...

小鼠呼吸道上皮细胞的分离及在气液界面暴露于实验性香烟烟雾

转基因小鼠在赋予基因生理功能方面极为有用。因此，总体研究尤其是气道功能研究已显著转向小鼠模型。本文提供了以下实验方案 体外...

体外 利用小鼠进行气管收缩的测量

内皮糖萼/内皮表面层最适合通过活体显微镜进行研究。在肺等运动器官中，活体显微镜技术上具有挑战性。我们展示了如何结合明场与荧光显微镜技术，在自由运动的组织中估算内皮表面层厚度 体内...

in vivo 条件下小鼠肺血管内皮表面层的测量

通过人体志愿者浅表刮取活检获得的鼻上皮细胞，在组织培养插件中进行扩增和转移。当细胞达到汇合状态后，于气液界面培养，从而获得纤毛细胞和非纤毛细胞的培养物。分化的鼻上皮细胞培养物为研究呼吸道黏膜提供了可行的实验模型。...

人鼻上皮细胞在气液界面的培养

本文中，从新生小鼠分离并培养了原代肺内皮细胞。...

原代小鼠肺内皮细胞的分离

近年来，人类诱导性多能干细胞分化技术的进步使得能够逐步获得特定器官的细胞类型。本文详细介绍了由诱导性多能干细胞衍生的气道基底细胞的维持与扩增步骤，以及在气液界面培养条件下将其分化为黏液纤毛上皮细胞的具体方法。...

由人多能干细胞生成气道上皮细胞气液界面培养模型

本文介绍一种可重复、经济且稳健的方法，用于分离和扩增原代支气管上皮细胞，以实现长期生物样本库保存，并通过气液界面培养生成分化成熟的上皮细胞。...

从切除的肺组织中分离支气管上皮细胞用于生物样本库建设及建立高度分化的气液界面培养模型

用于研究香烟烟雾提取物刺激下小鼠气道上皮细胞分化及多组学变化的体外模型

气液界面培养常用于通过分化原代正常人支气管上皮细胞来构建假复层气道上皮，以模拟肺气道的顶面结构。本文介绍一种通过监测其生物物理特性（如纤毛功能和膜完整性）来评估其质量的简便方案。...

测定假复层肺气道上皮的纤毛功能与膜不通透性

一氧化氮（NO）的内源性生成调控着多种生物学功能。越来越多的研究表明，基于NO的信号传导发生中断或失调与许多人类疾病相关。定量检测相关NO代谢物的方法可能为人类疾病提供新的诊断或预后生物标志物。...

用于评估一氧化氮生物活性的分析技术

University of Maryland School of Medicine.  本协议描述了一种通过利用基于三碘化物的化学发光分析法，量化气道上皮培养物中一氧化氮（NO）产生的方法，这些培养物在空气-液体界面（ALI）分化。

气液界面分化的小鼠气管上皮细胞培养物中一氧化氮生成的测定

探索更多视频