Name: 大型可重新封闭颅内窗的手术方案，支持小鼠默认模式网络的纵向多模态电生理记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-29T16:25:00.000+00:00
Duration: 14 min 34 s
Description: 学习小鼠大型可重新封闭颅内窗手术方案，结合微皮层脑电图与Neuropixels探针，实现默认模式网络纵向多模态电生理记录。该方法支持清醒行为小鼠的长期稳定数据采集。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作获得了芬兰研究理事会资助项目 #327192 和 347358 以及西格丽德·朱塞&#769;刘氏基金会。作者感谢Castrén实验室和Palva实验室成员在本项目全程中提供的技术支持和有益讨论。

EC 是 Kasvu Therapeutics, Ltd 的联合创始人、董事会成员，并获得该公司的研究资助，同时曾从 Janssen-Cilag 获得演讲费用。其他作者无任何利益冲突需要披露。

本报告详细描述了一种两阶段、保留硬脑膜的外科手术方案，该方法可可靠且高效地在小鼠中创建一个大尺寸、慢性且可重复密封的颅窗。该技术的重要性不仅在于颅窗的尺寸，其主要优势在于能够对大规模脑网络进行跨时间的同步、多尺度研究。通过结合表面微电皮层脑电图（µECoG）网格（提供中尺度局部场电位数据）与深部高密度颅内电极探针（提供微尺度、层析解析的单神经元及局部场电位数据），研究人员可直接探究特定环路活动（例如默认模式网络深部节点内的活动）如何影响皮层上所观察到的网络层级动态的形成。此外，该方法适用于任何大规模脑网络研究，因其可实现对小鼠大脑大部分区域的访问。
该方案的成功依赖于两个关键方面。首先，将手术分为两个阶段，并以48小时的恢复期相隔，是一项至关重要的设计选择。这一策略可最大限度地减少动物所承受的累积生理应激，降低急性炎症反应，并在更具侵入性的开颅手术之前允许组织初步愈合。经验表明，这种分阶段的设计能够提高长期植入物健康存活的可靠性，与已发表的小鼠分阶段颅骨植入方案一致14。其次，保留硬脑膜的开颅技术是整个操作中最关键的一步。通过将颅骨磨...

默认模式网络（Default Mode Network, DMN）最初在人类脑成像研究中被发现，表现为一组在需要外部导向和集中注意力的任务中持续受到抑制的脑区1。目前，该网络被认为是一个支持内部导向认知过程的基本大规模脑网络，这些过程包括自我参照思维、自传体记忆以及对未来事件的规划2,3。在人类中，典型的DMN由一系列解剖上相互连接的核心脑区组成，包括内侧前额叶皮层（mPFC）、后扣带皮层（PCC）、下顶叶小叶（IPL）以及海马结构4。该网络的功能异常是多种神经精神疾病的关键特征。在重度抑郁症（MDD）中，DMN通常表现出过度活跃以及功能连接模式的改变，这些变化被认为构成了MDD核心症状的神经基础，例如反刍思维和负面自我认知5,6。
为了研究驱动默认模式网络（DMN）功能障碍的细胞与环路机制，可靠的动物模型不可或缺。在啮齿类动物中已可靠地鉴定出同源的默认模式网络（DMN），其包含与人类相似的脑区，如内侧前额叶皮层（mPFC）、扣带皮层和后顶叶皮层（RSP），从而验证了小鼠作为机制研究具有转化相关性的模型7,8。此外，慢性应激作为抑郁症的关键因素，已被证明会以类似于人类重度抑郁症（MDD）患者的方式改变啮齿类动物DMN的连接性9。
理解疾病状态或长期治疗干预所引发的神经可塑性变化，需要对神经活动进行纵向观察，因为单次记录无法捕捉神经回路随时间推移发生的动态适应过程10。In vivo 电生理技术能够提供毫秒级的时间分辨率，适用于研究局部场电位（LFP）中的神经振荡与同步性。LFP反映的是局部神经元群体同步化突触活动的总和性细胞外信号，是神经网络通信的基本基础11,12。然而，在清醒小鼠中开展长期、大规模的电生理记录仍面临较高的技术挑战。传统的慢性颅窗最初是为清醒小鼠的光学成像而设计的，至今仍是该用途的标准制备方法，其典型的单半球覆盖范围和透明玻璃盖片结构非常适合相应的光学检测需求13。然而，这些颅窗并非为清醒状态下的多部位电生理记录而设计，其操作空间和光学界面限制了对分布式双侧网络节点（如默认模式网络DMN）进行同步高密度记录的能力14。相比之下，慢性电极植入虽可实现长期记录，但会引发进行性的异物包裹反应及胶质瘢痕形成，导致永久固定电极周围组织反应加剧，随时间推移信号质量逐渐下降15,16。
本文所述的两阶段外科手术方法直接解决了这些局限性。该方法可制备一个较大且可重复密封的颅窗，在实验间期通过被动的聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜、硅胶密封剂以及一个3D打印的盖帽封闭，从而允许多次非终末性地插入µECoG网格，用于中尺度局部场电位（LFP）记录，同时结合多个高密度颅内电极探针，实现微尺度、层析解析的单神经元及LFP活动记录17,18。与以往的慢性记录方法相比，该方法具有显著优势：先前的方法要么依赖永久植入的电极阵列，随着时间推移电极周围会逐渐形成胶质包裹，要么需要终末性的急性开颅手术，无法支持纵向研究设计。而本文所述的颅窗技术可保持硬脑膜完整，并避免长期异物接触15,16,18。此外，在一个验证队列中，颅窗在术后第0、21和22天共三次重新打开但未进行电生理记录，其胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和钙离子结合接头分子1（IBA1）的定量免疫反应性与非手术对照组相比无显著差异，表明在本研究所采用的重复开窗方案下，星形胶质细胞活化和小胶质细胞活化程度较低。该方法特别适用于在清醒、头部固定的实验小鼠中，对包括默认模式网络（DMN）在内的分布式皮层网络进行纵向、多部位记录，同时结合高密度颅内电极探针对深层结构进行层析解析的记录。其主要操作限制在于：需要熟练的显微外科技术以可靠地保留硬脑膜并移除骨瓣，且由于高密度颅内电极探针需要头部固定，因此无法与自由活动记录兼容。

<table><tbody><tr><td>&amp;micro;ECoG 阵列 &amp;mdash; 512通道定制（2 &amp;times; 256 ch</td><td>NeuroNexus</td><td>E256-200-30-80</td><td>包装：IH256。两件16&amp;times;16 个子网格（每个 3.3 mm） &amp;times; 3.5 毫米；200 &amp;mu;m 螺距；80 &amp;mu;m电极直径。表面水平DMN记录。</td></tr><tr><td>三轴左手显微操作臂</td><td>世界精密仪器公司（WPI）</td><td>504926</td><td>10 &amp;mu;微米级分辨率；数字显示；用于手术过程中头板/探针的定位</td></tr><tr><td>3D打印防护帽</td><td>自研（Anycubic Photon Mono 4K）</td><td>N/A</td><td>定制设计；使用 Anycubic High Clear UV 树脂打印；STL 文件可从 https://github.com/RazBalin/ProtectiveDMN_Cap 获取</td></tr><tr><td>丙酮（分析纯）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179973</td><td>粘合剂涂覆前的颅骨表面脱脂与骨膜去除</td></tr><tr><td>Adson 硬脑膜钩（5 mm，精细硬脑膜钩）</td><td>gSource</td><td>gS 25.2570</td><td>用于沿边缘将骨板从硬脑膜剥离；由细钨丝或类似材料制成</td></tr><tr><td>Anycubic 高透UV树脂</td><td>Anycubic</td><td>STMGCL-102B&amp;nbsp;</td><td>使用 Anycubic Photon Mono 4K 打印机制作 3D 打印防护帽所用的光聚合物树脂</td></tr><tr><td>Anycubic Photon Mono 4K 光固化3D树脂打印机</td><td>Anycubic</td><td>PHOTON-MONO-4K</td><td>用于使用 Anycubic 高透树脂打印防护窗帽</td></tr><tr><td>Anycubic UV 树脂清洗液 &amp;amp; Cure Machine 2.0</td><td>Anycubic</td><td>285-550</td><td>3D打印帽状物的打印后清洗与紫外线固化</td></tr><tr><td>带磁性底座的关节臂&amp;times;2)</td><td>哈斯工装</td><td>09-0535</td><td>用于固定 &amp;micro;记录期间置于皮层表面的ECoG子网格</td></tr><tr><td>人工脑脊液（aCSF）</td><td>内部制备</td><td>N/A（内部）</td><td>aCSF 配方：124 mM NaCl，3 mM KCl，26 mM NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，2 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，1 mM MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，1.25 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，10 mM D-葡萄糖；用95% O₂供氧&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; / 5% CO₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 制备后立即使用。目录编号单独列出。</td></tr><tr><td>钝头显微手术刀（环形手术刀）&amp;nbsp;</td><td>Iogen</td><td>374769</td><td>用于颅骨表面刮除和帽状腱膜去除</td></tr><tr><td>布托啡诺（Temgesic）</td><td>Indivior</td><td>BE-112515</td><td>阿片类镇痛药；术前皮下注射 0.05 mg/kg</td></tr><tr><td>C57BL/6JRj 小鼠</td><td>Janvier Labs</td><td></td><td>雄性或雌性；至少10周龄 &gt;手术时体重20 g</td></tr><tr><td>二水合氯化钙（CaCl₂）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7902</td><td>2 mM；分子量 147.02；0.29 g/L。以 Ca 形式配制 &amp;times;100倍浓缩液。自制aCSF的组分。</td></tr><tr><td>卡洛芬（Rimadyl）</td><td>硕腾动物保健</td><td>RXRIM-INJ&amp;nbsp;</td><td>非甾体抗炎镇痛药；术前皮下注射 5 mg/kg</td></tr><tr><td>皮质酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2505</td><td>溶于饮水中用于21天慢性应激/抑郁症模型</td></tr><tr><td>棉签</td><td>&amp;nbsp; Fisherbrand</td><td>&amp;nbsp;22-363-157&amp;nbsp;</td><td>作为30 G硬膜穿刺装置的手柄，并用于丙酮脱脂颅骨表面</td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯胶水 &amp;mdash; Loctite 401</td><td>亨克尔粘合剂</td><td>Loctite 401</td><td>低黏度氰基丙烯酸酯；用于颅骨表面预处理、头固定板和帽固定</td></tr><tr><td>牙科钻头 &amp;mdash; Foredom K.1070</td><td>Foredom</td><td>K.1070</td><td>柔性轴旋转钻；用于开颅减薄和导孔钻孔</td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Dopharma</td><td>1DEX004</td><td>皮质类固醇抗炎；术前皮下注射 2 mg/kg</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7021</td><td>10 mM；分子量 180.20；1.80 g/L。以葡萄糖配制 &amp;times;100倍浓缩液。自制aCSF的组分。</td></tr><tr><td>钻头 钢制圆钻 1/007W</td><td>Hager &amp;和 Meisinger</td><td>18089</td><td>用于参考位点和颅窗</td></tr><tr><td>80% 乙醇（v/v）- A12t Dilutus</td><td>Berner</td><td>13221132</td><td>手术器械及手术层流罩术前浸泡消毒</td></tr><tr><td>气体抽排装置</td><td>RWD生命科学</td><td>R546W</td><td>清除手术区域的废气麻醉气体</td></tr><tr><td>镀金参考电极插座</td><td>DigiKey</td><td>310-13-102-41-001000</td><td>植入左侧小脑；用作皮层脑电图（ECoG）的接地/参考电极</td></tr><tr><td>GRANT 超声波清洗机 &amp;mdash; Model 17002A</td><td>GRANT Instruments</td><td>17002A</td><td>EAN: 4064343191654。热水超声波清洗机；与 TICKOPUR TR 3 配合用于器械清洗</td></tr><tr><td>加热垫 &amp;mdash; Supertech TMP-5B</td><td>Supertech</td><td>TMP-5B</td><td>保持体温在37 &amp;deg;麻醉期间持续监测 C</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Piramal Healthcare</td><td>66794-017-25</td><td>吸入麻醉剂；诱导 4%，维持 1.5%&amp;ndash;2.5%</td></tr><tr><td>Kimtech Science 精密擦拭纸（无纤维组织）</td><td>金伯利·克拉克</td><td>7552</td><td>使用尖头工具吸干残留的ACSF，并辅助PDMS膜与硬脑膜粘附</td></tr><tr><td>Kwik-Cast 无菌弹性密封剂</td><td>世界精密仪器公司（WPI）</td><td>KWIK-CAST-s</td><td>型号：KWIK-CAST-S。生物相容性硅胶；用于在PDMS膜周围形成可移除的密封。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LED 紫外固化笔 405 nm</td><td>CureUV</td><td>514424-405</td><td>用于种植过程中固化紫外激活的牙科粘接剂（Total C-Ram）</td></tr><tr><td>利多卡因-肾上腺素溶液</td><td>Orion Pharma</td><td>05 10 31</td><td>局部麻醉；皮下注射至头皮皮肤下方</td></tr><tr><td>七水硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-7774</td><td>1 mM；分子量 246.48；0.25 g/L。以 Mg 形式配制 &amp;times;100倍浓缩液。自制aCSF的组分。</td></tr><tr><td>金属头板 &amp;mdash; Neurotar Model 13</td><td>Neurotar</td><td>模型 13</td><td>钛合金头颅固定板；圆形开口，直径11 mm；使用氰基丙烯酸酯和牙科水泥固定于颅骨</td></tr><tr><td>NeuroNexus 头戴式适配器</td><td>NeuroNexus</td><td>定制 IH256 64&amp;times;4 Molex&amp;nbsp;</td><td>定制适配器板；夹层式结构 &amp;micro;两个Intan RHD 128通道头戴装置之间的ECoG子网格</td></tr><tr><td>Neuropixels 1.0 探针配金属帽（&amp;times;2)</td><td>IMEC</td><td>PRB_1_4_0480_1_C</td><td>960 个记录位点；10 mm 探针柄。一个探针靶向海马-丘脑-视觉皮层柱，另一个靶向内侧前额叶皮层（mPFC）柱</td></tr><tr><td>NI PXIe-1083 机箱</td><td>国家仪器公司</td><td>PXIe-1083</td><td>9槽PXI Express机箱，用于容纳Neuropixels模块和NI DAQ数据采集卡</td></tr><tr><td>NI PXIe-3839 多功能 I/O 模块</td><td>国家仪器公司</td><td>PXIe-3839</td><td>安装于NI PXIe-1083机箱中；用于同步和辅助I/O</td></tr><tr><td>NI PXIe-6363 多功能数据采集设备</td><td>国家仪器公司</td><td>PXIe-6363</td><td>安装于 NI PXIe-1083 机箱；用于同步的模拟和数字 I/O</td></tr><tr><td>Nova 微型焚烧炉&amp;nbsp; 红外线灭菌器</td><td>Argos Tech</td><td>S3022</td><td>用于可能接触暴露脑组织的任何器械的快速灭菌</td></tr><tr><td>奥林巴斯SZ51体视双目显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td>手术可视化；贯穿开颅和植入步骤使用</td></tr><tr><td>Open Ephys 采集板（One Box，第一代）</td><td>Open Ephys</td><td>OEPS-9029</td><td>接收 &amp;micro;通过 SPI 传输的 ECoG 数据流；开源硬件。参见 open-ephys.org</td></tr><tr><td>Open Ephys GUI</td><td>Open Ephys</td><td>N/A（开源）</td><td>免费、开源的电生理数据采集软件。可访问：open-ephys.org</td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5405</td><td>3 mM；分子量 74.55；0.22 g/L。自制 aCSF 的组分。</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH₂PO₄）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5655</td><td>1.25 mM；分子量 136.09；0.17 g/L。自制 aCSF 成分（Klebs &amp;times;10 倍浓缩储备液。</td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液（BETADINE）</td><td>武田</td><td>45 70 28</td><td>用于手术区域准备的局部消毒剂</td></tr><tr><td>PXIe 采集模块</td><td>Neuropixels</td><td>PXIE_1000</td><td>用于Neuropixels 1.0数据采集的PXI格式模块；安装于NI PXIe-1083机箱</td></tr><tr><td>参考插座连接器</td><td>DigiKey</td><td>342-10-102-00-591000</td><td>与上述参考插座配套的配对连接器；请与 DigiKey 确认部件号</td></tr><tr><td>RHD 128通道头戴式装置（&amp;times;4)</td><td>Intan Technologies</td><td>RHD 128</td><td>每两个头级 &amp;micro;ECoG 子网格；确认型号（例如 RHD2132 或 RHD2164）</td></tr><tr><td>RHD SPI 接口电缆，0.9 m</td><td>Intan Technologies / Open Ephys</td><td>C3203</td><td>标准SPI电缆，用于连接RHD前置放大器与Open Ephys数据采集盒</td></tr><tr><td>RWD 空气泵</td><td>RWD生命科学</td><td>R510-29</td><td>为麻醉回路提供气流</td></tr><tr><td>RWD 动物麻醉蒸发器</td><td>RWD生命科学</td><td>R5835</td><td>用于麻醉诱导与维持的精密异氟烷蒸发器</td></tr><tr><td>11号手术刀片</td><td>Swann Morton</td><td>SM0103</td><td>用于在颅骨表面雕刻交叉纹路，以增强粘附力</td></tr><tr><td>小型动物毛发修剪器 - GT416</td><td>Aesculap Schermaschinen GmbH</td><td>D-98528H</td><td>用于手术前修剪动物头皮</td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaHCO₃）&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-5761</td><td>26 mM；分子量 84.01；2.18 g/L。自制 aCSF 的组分。</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-5886</td><td>124 mM；分子量 58.44；7.25 g/L。自制 aCSF 的组分。</td></tr><tr><td>SOL-M（无菌皮下注射针头 30 G）</td><td>Sol-Millennium Europe</td><td>113005</td><td>弯曲 90&amp;deg; 在尖端固定于棉签上，以制备硬脑膜穿刺装置</td></tr><tr><td>标准操作臂，三轴左侧（Stoelting）</td><td>斯托尔廷公司</td><td>51604</td><td>用于记录过程中插入 Neuropixels 探针</td></tr><tr><td>标准操作臂，三轴右侧（Stoelting）</td><td>斯托尔廷公司</td><td>51606</td><td>用于记录过程中插入 Neuropixels 探针</td></tr><tr><td>立体定向架 &amp;mdash; RWD F67001</td><td>RWD生命科学</td><td>F67001</td><td>标准立体定位仪；用于头部固定和基于坐标参考的植入物放置</td></tr><tr><td>带尺规的外科标记皮肤笔（紫色墨水）</td><td>Fannin</td><td>SM0372</td><td>基于龙胆紫的生物相容性外科皮肤标记剂，用于在骨面上标出计划开颅区域及植入物轮廓。该标记剂耐受氰基丙烯酸酯底涂剂（Loctite 401）处理，在颅骨脱脂和头固定板安装过程中仍保持清晰可见，可实现立体定位坐标的可靠转移至骨表面。</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 硅弹性体试剂盒（PDMS）</td><td>陶氏（德国）</td><td>1673921</td><td>聚二甲基硅氧烷；浇铸成薄层（&amp;lt;1 mm）膜；置于硬脑膜表面以保护大脑</td></tr><tr><td>Tergazyme 酶清洁剂</td><td>Alconox</td><td>1304-1</td><td>使用1%（w/v）蛋白酶清洁剂溶于温热的反渗透水中，用于实验后电极清洗（浸泡45分钟，随后用纯化水冲洗三次）。</td></tr><tr><td>Total C-Ram Automix UV 牙科粘固剂（白色）</td><td>Itena</td><td>R301950</td><td>模型：TTCRAM-BLC；紫外光固化牙科树脂；用于头固定板加固和套管固定</td></tr><tr><td>超声波清洗液（TICKOPUR TR 3）</td><td>&amp;nbsp;Dr. H. Stamm GmbH</td><td>TR-3-913&amp;nbsp;</td><td>柠檬酸基浓缩液；用于超声波清洗机中术后器械的清洗</td></tr><tr><td>维适泰滴眼凝胶 2 mg/g</td><td>爱尔康</td><td>503849</td><td>基于卡波姆的润滑性眼膏；麻醉期间用于角膜以防止干燥</td></tr><tr><td>蔡司 KL1500 LCD 冷光源</td><td>卡尔·蔡司</td><td>KL1500 LCD</td><td>用于手术区域的光纤冷光源照明；可防止热损伤</td></tr></tbody></table>

用于小鼠默认模式网络纵向多模态电生理记录的大尺寸可重复密封颅窗手术方案

Surgical Protocol for a Large, Resealable Cranial Window Enabling Longitudinal, Multi-Modal Electrophysiology Recordings of Mouse Default Mode Network

默认模式网络（DMN）是一个核心的、大规模脑网络，参与多种认知功能，并与多种神经精神疾病（如重度抑郁障碍，MDD）相关。在动物模型中研究DMN复杂的动态特性，有助于深入理解其在健康和病理状态下的功能。然而，在清醒且自由活动的小鼠中，对DMN多个深部且分布广泛的脑区进行稳定、长期、大规模的电生理记录，仍是一项重大挑战。
本文介绍了一种新颖的两阶段手术方案，用于在小鼠中制备一个大尺寸（4 mm × 7.6 mm）、耐用且可重复密封的颅窗。该手术设计旨在保持硬脑膜的完整性，这对于长期脑部健康和记录稳定性至关重要。
该技术通过结合表层微电皮层图（µECoG）与两个高密度颅内电极探针，实现了对超过1000个电极的同步、重复、纵向记录，前所未有地获取了默认模式网络（DMN）的活动信息。该方法为在数周时间内开展多模态、多尺度的全网络电生理动态研究提供了可靠平台，为探索脑部疾病病理生理机制背后的神经可塑性变化，以及评估新型治疗手段的长期效应开辟了新的途径。

成功的手术会在大脑皮层上形成一个清晰透明的观察窗，能够清晰看到血管结构，且炎症或感染迹象极轻微。这种清晰状态可维持超过21天（图1），从而支持长期的纵向研究。该植入装置的稳定性已在为期21天的慢性皮质酮给药实验范式中得到验证，后者是诱导啮齿类动物抑郁样状态的常用模型10,23,24。这证实了该方法适用于慢性疾病建模研究。
通过慢性窗记录的原始电生理信号在纵向时间线上保持高质量。在图2中，并列展示了来自后部压后皮层网格的代表性宽带µECoG信号，以及来自浅层皮层通道的颅内探针局部场电位信号，分别对应首次记录日（第0天）和21天后（第21天）的数据。第21天的记录显示，与同一只动物第0天的记录相比，信号幅度、频谱内容以及运动和噪声伪影的缺失程度均具有可比性，证实了PDMS膜和硅胶密封...

本方案描述了一种两阶段手术方法，用于在小鼠中创建一个大尺寸、可重复密封且保留硬脑膜的颅窗。该技术能够在数周时间内对分布式的深部脑网络（如默认模式网络）进行长期、多模态的电生理记录。

默认模式网络（DMN）是一个核心的大尺度脑网络，参与多种认知功能，并与多种神经精神疾病相关，例如……

默认模式网络（DMN）是一个重要的大规模网络，参与多种认知功能，并与抑郁症等神经精神疾病相关。在动物模型中研究DMN复杂的动态特性，对于理解其在健康和病理状态下的功能具有重要价值。然而，一个重大挑战是在清醒且行为自由的小鼠中，对DMN多个深层且分布广泛的节点进行稳定、长期和大规模的电生理记录。本文介绍了一种由Eero Castren实验室开发的新型双阶段手术方案。该技术可构建一个大尺寸、持久且可重复密封的颅窗，实现同时对超过1,000个电极通道进行多次纵向记录。该方法结合了表面微电极皮层脑电图（micro-ECoG）与两根Neuropixels探针，从而前所未有地实现了对默认模式网络的深入观测。本视频将逐步介绍这一可靠的外科手术操作流程，从动物准备和头固定板植入到慢性颅窗的制备，确保为神经网络科学研究获取高质量、长期的实验数据。所有操作程序均已获得芬兰国家实验委员会批准，并符合欧洲关于用于科学目的动物保护的指令。第一阶段：动物准备与头固定板植入。进行此操作时，首先准备所有必要的手术材料和器械。使用 4% 异氟烷对小鼠进行麻醉，并以每分钟 0.5 升的氧气流速将麻醉维持在 1.5% 至 2.5%。剃除小鼠头部顶部的毛发，并将动物放置在带有内部温度传感器的控温加热垫上，该传感器校准为在整个操作过程中维持体温在 37 摄氏度。涂抹卡波姆眼膏以防止角膜干燥。将小鼠固定于立体定位仪中，使颅骨保持水平，通过皮下注射给予术前镇痛药和抗炎药物，包括卡洛芬、丁丙诺啡和地塞米松。使用聚维酮碘溶液对剃毛区域进行消毒，并在头皮皮下注射含肾上腺素的利多卡因溶液作为局部麻醉。在耳线处做一个小的横向切口，并逐步扩大切口，以完全暴露颅骨表面顶部。用丙酮仔细清洁暴露的颅骨，直至去除所有可见的骨膜，以确保植入物能够牢固粘附。使用钝头圆形手术刀片去除丙酮清洗未能完全清除的残留骨膜和结缔组织碎片。使用立体定位仪，在颅骨上以颅骨缝合点（bregma）为参照，标记一个 4 毫米 × 7.6 毫米的矩形区域。该矩形应从 bregma 向左右两侧各延伸 2 毫米，向前（吻侧）延伸 3 毫米，向后（尾侧）延伸 4.6 毫米。接下来，在右侧大脑半球标记两个颅内探针插入位点。在前囟前方 1.66 毫米、外侧 1.95 毫米处标记头端探针位置，在前囟后方 2.2 毫米、外侧 1.9 毫米处标记尾端探针位置。接下来，使用 11 号手术刀片在指定窗口区域外所有暴露的骨表面刻划交叉网格图案，形成深度约为 0.2 至 0.4 毫米的浅而清晰的凹槽，构成约 1×1 毫米的均匀方格。通过将无菌 30G 针头安装到棉签末端，并将针头弯成 V 形，制备一个精细的胶水涂抹工具。将氰基丙烯酸酯胶水滴入一次性塑料称量皿中，并将涂胶工具浸入胶水容器内。将胶水涂抹于所有暴露和雕刻的骨表面，每个部位仅涂抹一次，确保覆盖完全但不过量。待胶水干燥七分钟后，再进行后续操作。植入参考套管时，选择左侧小脑区域作为钻孔位置，以避开可见的浅表血管。使用圆形钢制磨头以每分钟20,000至25,000转的速度，分5到10秒的短时 bursts 进行钻孔，直至骨孔变得较为半透明，显现出淡粉色。将镀金参考套管插入导孔中，用氰基丙烯酸酯胶水固定，并用紫外光固化牙科水泥加强连接处。使用LED固化笔照射牙科水泥，固化一分钟。接着，在暴露的吻侧颅骨顶端放置少量紫外光固化型牙科水泥，将头固定板置于颅骨下方，使其一端置于围绕参考插座已固化的牙科水泥支架上，另一端置于新鲜的吻侧水泥点上。确保头固定板居中且水平。通过在头板基部周围涂抹牙科水泥，并环绕刻蚀的骨面和参考插座，直至在颅窗预定区域的周边形成连续且密封的封闭结构，以增强整体稳定性。最后，使用LED固化笔光源照射牙科水泥一分钟使其完全固化。待水泥完全固化后，让小鼠从麻醉状态中苏醒。第一阶段现已完成。在进入下一阶段之前，让小鼠恢复至少48小时。第二阶段：慢性颅窗制作。第二阶段所需的工具和药物与第一阶段相同，但不需要局部麻醉药。此外，该阶段还需要一个无菌的薄型聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜、置于冰上的冷人工脑脊液、一种弹性硅胶密封剂以及一个定制的3D打印保护帽。在第一次手术至少48小时后，使用异氟烷重新麻醉小鼠，将其放置在立体定位仪的加热垫上，并给予术前药物，但无需使用利多卡因-肾上腺素局部麻醉药。使用牙科钻头沿第一阶段标记的矩形轮廓开始对骨组织进行减薄，钻机转速设为每分钟25,000转，钻头与骨表面保持90度角，沿矩形边缘进行一至两次略深的 passes，以形成初始切割沟槽。在颅窗附近两个探针插入坐标的骨组织和牙科水泥上钻出浅沟。这些沟槽可作为持久的视觉标记物，在骨瓣移除后仍清晰可见，用于在后续电生理记录会话中重复、准确地重新定位颅内探针。在整个钻孔过程中，定期使用冰冷的无菌人工脑脊液，以防止对下方皮层造成热损伤，并减少出血。随着骨质变薄，逐步将钻头速度降低至每分钟 20,000 转。沿矩形边缘继续钻孔，直至轮廓内的骨质变薄约 90%。切勿完全钻透颅骨。更换为精细的弯头硬脑膜钩。将钩尖极度小心地插入薄骨边缘下方，沿骨窗边缘滑动钩子，仔细将骨瓣与周围颅骨及下方组织分离。使用脑膜钩从后向前小心抬起已成功分离的骨瓣，使其与颅骨表面成约35度角。用镊子夹住抬起的边缘，轻轻左右摇动，直至骨瓣完全松脱。用冰冻的ACSF反复冲洗暴露区域，清除凝固的血液。待出血停止后，将一片无菌的预制PDMS膜直接置于硬脑膜表面。若尺寸合适，该膜将精确覆盖窗口，并被动贴附于硬脑膜上，使其平整地紧贴脑组织。使用硅胶密封剂封闭开颅部位。用牙科水泥填充头固定板与BDMS膜边缘之间的所有缝隙，完全包绕并覆盖BDMS膜的边缘。使用少量氰基丙烯酸酯胶水将定制的3D打印保护帽固定在头固定板上，以保护记录间隙期间的观察窗口。小鼠现已准备好恢复，应转移至其单独饲养的家笼中，以防止植入物受损。成功的手术会在大脑皮层上形成一个清晰透明的观察窗，能够清晰看到血管结构，且炎症或感染迹象极轻微。这种清晰状态可维持超过21天，从而支持长期的纵向研究。通过慢性观察窗记录的原始电生理信号在整个纵向观察期间均保持高质量。此处并排显示了来自一只动物后部压后皮层网格电极在首次记录日和21天后采集的代表性宽带微皮层脑电图（micro-ECoG）信号，以及同时从浅层皮层通道采集的颅内探针局部场电位信号。第21天记录的信号在幅度、频谱成分以及运动和噪声伪影的消除方面均与第0天记录的信号相当，证实了PDMS膜和硅胶密封层的长期存在以及反复的硬脑膜穿刺并未导致浅层皮层区域——即信号退化最可能首先出现的区域——表面电极或颅内探针信号质量的可检测下降。该技术的主要验证依据是能够随时间稳定获取高质量的多模态电生理数据。可重复密封的窗口允许反复插入探针，从而在数周内对相同的神经元群体进行记录。在α频段，通过颅内高密度电极探针尾端通道计算得到的相位锁定值矩阵显示，基线期与治疗后第21天的记录会话之间具有稳定的功能性结构。这表明探针可重复插入至相同的皮层位置，而非对同一单个神经元进行正式的示踪。尽管小腿部位的微小移位使得无法断言记录的是完全相同的神经单元，但α频段相互作用的整体层状和区域结构得以保留，表明慢性窗允许对同一功能环路进行纵向采样。为了直接验证慢性窗是否支持在不同记录会话之间对相同深层结构进行可重复的层状定位，我们利用探针的LFP通道计算了电流源密度（CSD）图谱。刺激诱发的CSD图谱显示，预期的层状电流汇与电流源特征——包括前边缘皮层和前扣带区——在不同会话之间保持一致。两个实验会话之间的层流功率谱重叠度高度相似，皮尔逊相关系数为0.81。在次级运动皮层观察到的差异可能源于记录期间动物运动状态的不同。由于电流源密度（CSD）图包含解剖学信息，因此可在单次实验过程中提供一种非终末式的读数，用以判断每个探针当前正在采集哪些脑区的信号，而无需依赖实验后对脑组织的染色分析。表面微电皮层脑电图（micro-ECoG）电极放置在不同实验周期间的可重复性独立于颅内电流源密度（CSD）读数进行量化。将第0天和第21天由micro-ECoG网格计算得到的频带限制性空间功率图叠加，并分别对吻侧和尾侧子网格计算两幅图的像素级相关性。子网格轮廓相关性保持较高水平，且两个实验周期的空间条形码在阵列的吻侧和尾侧半区均明显共定位于相同的皮层功率热点区域。通过半透明网格可见的正弦对齐队列，以及探针插入坐标处刻有的骨槽，因此可在21天的纵向观察期内实现微小脑皮层电图（micro-ECoG）植入的毫米级可重复性。为进一步验证该技术，在开颅手术约四周后的尸检脑切片上，进行了针对GFAP和IBA1的免疫组织化学染色。GFAP由星形胶质细胞表达，这类细胞在反应性胶质增生（如脑损伤或炎症）中表达上调。另一方面，IBA1 由小胶质细胞表达，这些细胞在神经炎症过程中更为活跃。验证队列由接受完整两阶段手术的动物组成，颅窗在术后第 0、21 和 22 天依次重新打开三次。然而，该队列未进行微阵列皮层脑电图（micro-ECoG）放置，也未实施颅内探针插入。在每次实验之间，窗口被重新密封，如同在进行电生理记录时一样。因此，该队列可将慢性窗口和反复硬脑膜暴露引起的炎症反应与任何探针导致的组织损伤分离开来。在未进行手术的对照组与接受手术的载体组之间，两种标志物均未观察到显著差异。这些代表性显微图像显示，在窗口正下方区域未见明显的反应性胶质增生或小胶质细胞活化的定性证据。然而，分别在探针穿行路径附近以及探针插入半球区域观察到轻微的小胶质细胞和星形胶质细胞活化，这可能归因于颅内探针插入速度过快。成功的手术可使大脑皮层表面形成清晰透明的窗口，且炎症反应极轻微。慢性处理期后，可能会出现一定程度的脑肿胀。可通过密切监测来管理，必要时可给予额外的镇痛剂。对于记录，只需取下帽盖和密封材料，放置微小皮层脑电图网格（micro-ECoG grids）和Neuropixels探针，即可开始对清醒且行为正常动物进行数据采集。综上所述，这种双阶段手术方案为在小鼠中创建大型慢性颅窗提供了一种可靠且高效的方法。该手术的关键优势在于对硬脑膜的损伤极小，并能提供广阔的暴露区域，这对于同时放置表面微米级皮层脑电图（micro-ECoG）网格电极和多个深部脑神经像素（Neuropixels）探针至关重要。该方法使得对默认模式网络（DMN）及其他大规模神经环路中全网络范围的电生理动态进行前所未有的长期纵向研究成为可能。这为深入研究复杂行为的神经基础以及脑部疾病的病理生理学机制打开了大门，最终有助于开发新的治疗方法。

surgical-protocol-for-large-resealable-cranial-window-enabling

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

大型可重新封闭颅内窗的手术方案，支持小鼠默认模式网络的纵向多模态电生理记录

我们介绍了利用硅探针在活动中的啮齿类动物体内进行大规模多单细胞单位和局部场电位记录的方法。文中详细展示了驱动器的制作、探针与驱动器的连接以及探针植入过程，以便于轻松重复操作。...

通过可移动硅探针在行为啮齿类动物中进行大规模神经元记录

本文描述了一种在监测脑电图、肌电图和脑乳酸浓度的同时，利用光遗传学方法调控大脑皮层锥体神经元活性的实验方案。实验记录在带有电缆束缚的小鼠上进行，小鼠处于自然的睡眠/觉醒周期过程中。光遗传学设备由本实验室自行组装，记录设备为 commercially...

同步进行啮齿类动物大脑皮层的脑电图记录、乳酸浓度实时测量与光遗传学神经元活动操控

该方法为小鼠在显微成像或单细胞电生理记录期间提供了一个可感知且熟悉的环境，使其能够在动物头部被牢固固定的情况下进行导航与探索。...

平底式气浮平台：一种将清醒自由活动啮齿类动物行为学与显微成像或电生理记录相结合的新方法

本方案介绍了一种在小鼠大脑皮层的颞区和顶区创建大型单侧开颅窗的方法。该方法特别适用于对大脑半球大范围区域进行实时成像。...

一种用于脑活动介观宽场光学成像的大范围侧颅开颅术

本文介绍了一种用于在清醒且头部固定的活体小鼠中对脑细胞进行长期成像的慢性颅窗植入实验方案。...

植入颅窗以实现重复观察 在体实验 清醒小鼠成像

本文介绍了用于光传递的光纤和用于神经记录的电极阵列组成的光遗传探针系统的制备方法。体内实验利用表达通道视紫红质-2的转基因小鼠，验证了该系统实现光遗传学刺激与电生理记录同步进行的可行性。...

用于光遗传学调控与神经电生理记录同步进行的光极阵列

提出一种低成本脑电图记录系统，并结合毫米级线圈，用于在活体小鼠大脑中进行经颅磁刺激。in...

低成本脑电图记录系统结合毫米级线圈用于活体小鼠脑部经颅刺激 体内

我们开发了一种简化且经济高效的电极制备方法，并在自由活动的小鼠中实现了多个脑区信号的记录。结合光遗传学、多脑区电生理记录和钙信号记录，揭示了癫痫点燃模型中跨脑区的神经元活动特征。...

一种用于多区域体内记录的灵活便捷电生理光导电极的集成制备方法

本方案描述了一种在固定头部的小鼠脑干中获取体内高密度单神经元记录的方法。该方法用于在全身麻醉前和麻醉期间，测量腹外侧导水管周围灰质（即快速眼动（REM）睡眠期间不活跃的脑干区域）神经元的动作电位发放。...

固定头部小鼠脑干的急性单细胞多电极记录

本研究提出了一种可在猪模型中进行重复慢性皮层记录的可扩展、可靠且可重复的方法。该方法适用于神经科学的多个领域，包括疼痛研究和神经系统疾病诊断。...

用于猪麻醉期间重复皮层记录的慢性颅窗技术

本文介绍了在大鼠和小鼠中进行高密度微电皮层记录（µEcoG）的两种方案，包括手术、植入和记录方法。µEcoG记录分别与大鼠听觉皮层的层状多通道电极记录或小鼠体感皮层的光遗传学神经活动操控相结合进行。...

通过整合层状多通道电极、光遗传学与微阵列皮层电图在啮齿类动物中进行皮层处理的多尺度研究

学习小鼠大型可重新封闭颅内窗手术方案，结合微皮层脑电图与Neuropixels探针，实现默认模式网络纵向多模态电生理记录。该方法支持清醒行为小鼠的长期稳定数据采集。

用于小鼠默认模式网络纵向多模态电生理记录的大尺寸可重复密封颅窗手术方案

探索更多视频