大型可重新封闭颅内窗的手术方案，支持小鼠默认模式网络的纵向多模态电生理记录

默认模式网络（DMN）是一个关键的大规模网络，涉及多种认知功能和神经精神疾病，如抑郁症。在动物模型中研究DMN复杂的动态，为了解其在健康和病理状态下的功能提供了宝贵的见解。然而，一个重大挑战是对清醒且行为正常的小鼠进行多个深层且分布的节点DMN进行稳定、长期且大规模的电生理记录。

在这里，我们介绍了Eero Castren实验室开发的一种新型两阶段手术方案。该技术创造了一个大型、耐用且可重新密封的颅窗，使得可同时从超过1000个电极通道进行重复纵向记录。这是通过将地表微皮质电图（micro-ECoG）与两个Neuropixels探针结合实现的，实现了前所未有的默认模式网络访问。

本视频将逐步指导这一稳健的外科手术过程，从动物准备、头板植入到慢性颅脑窗的创建，确保网络神经科学研究中高质量、长期的数据采集。所有展示的程序均经芬兰国家实验委员会批准，符合欧洲保护科学动物的指令。第一阶段，动物准备与头盔植入。

进行此手术时，首先要准备所有必要的手术材料和设备。用4%异氟醚麻醉小鼠，维持1.5%至2.5%的麻醉，氧气流量为每分钟0.5升。剃去头顶的毛发，将动物放在配备内置温度传感器的受控加热垫上，该加热垫在整个过程中能将体温保持在37摄氏度。

涂抹碳糖球眼膏以防止角膜干燥。将小鼠固定在立体定向框架中，使头骨平放，并通过皮下注射、卡洛芬、丁丙诺啡和地塞米松给术前止痛药和抗炎药。用聚维酮碘液消毒剃须区域，并在头皮下注射利多卡因-肾上腺素溶液作为局部麻醉剂。

在耳线处做一个小横切口，并逐渐扩大切口，使头骨表面完全暴露。用丙酮仔细清洁暴露的颅骨，直到所有可见的骨膜被清除，以确保植入物牢固附着。使用钝的圆形手术刀去除丙酮洗液未能完全解决的残留骨膜和结缔组织碎片。

用立体定向装置，在颅骨上标记一个相对于bregma的4毫米×7.6毫米矩形区域。矩形应从布雷格玛两侧延伸2毫米，前方3毫米，后方4.6毫米。接着，标记右半球的两个颅内探针插入点。

标记前端探针位置位于距bregma前方1.66毫米和外侧1.95毫米处，尾侧探针位置位于距bregma后方2.2毫米和外侧1.9毫米处。接着，使用11号手术刀片在指定窗户区域外的所有裸露骨骼表面雕刻交叉图案，形成约0.2至0.4毫米深的浅而明显的沟槽，形成约一乘一毫米见方的均匀网格。通过将一根无菌的30克针头插入棉签尖端，将针弯成V形，制作细胶粘剂。

将氰基丙烯酸盐胶水倒入一次性塑料称重船中，然后将涂抹器浸入胶水储罐中。在每个暴露和刻有骨头的表面上涂抹沉积胶，每个部位最多涂一次沉积，确保覆盖全面但绝不过多。让胶水干燥七分钟后再进行。

植入参考套筒时，应选择钻孔部位位于左小脑位置之上，以避免明显的浅层血管。用圆形钢刀以每分钟20,000到25,000发的速度，每分钟5到10秒间钻孔，直到孔变得更透明，露出淡粉色。将镀金参考套筒插入导向孔，用氰基丙烯酸酯胶固定，并用可紫外线固化的牙科胶水加固连接处。

用LED固化笔灯固化牙胶一分钟。接着，在暴露的前端骨顶端涂上少量可紫外线固化的牙科胶水，并将头板置于颅骨下方，使一边靠在围绕参考牙槽固化的牙水泥脚手架上，另一边则放在新鲜的前端水泥dab上。确保头板居中且水平。

通过在头板基部涂上牙科胶水，环绕刻骨和参考牙槽，直到形成一个连续且密封的包覆区域，围绕未来颅窗的周边。最后，用LED固化笔灯固化了牙胶一分钟。水泥完全固化后，让老鼠从麻醉中醒来。

第一阶段现已完成。让小鼠恢复至少48小时后再进入下一阶段。第二阶段，慢性颅窗的创建。

第二阶段需要与第一阶段相同的工具和药物，只是局部麻醉不同。此外，这一阶段还需要无菌薄的PDMS膜、冷藏人工脑脊液冰藏、弹性硅胶密封剂以及定制3D打印保护帽。首次手术后至少48小时，再次用异氟醚麻醉小鼠，将其放在立体定向框架的加热垫上，并像第一阶段一样施用术前药物，除了利多卡因-肾上腺素局部麻醉外。

开始用牙钻沿着第一阶段标记的矩形轮廓进行骨头变薄，起始速度为每分钟25,000发，钻孔装置相对于骨面呈90度角，沿矩形边缘进行一到两次稍深的切割，以建立初始切割槽。在骨头和牙缝中钻浅槽，靠近颅骨窗的两个探针插入坐标处。这些沟槽作为骨瓣取出后仍可见的视觉标志，用于在后续电生理治疗中重新定位颅内探针。

钻探过程中应定期使用冰冷无菌人工脑脊液，以防止对下层皮层的热损伤并减少出血。随着骨头变薄，逐渐降低钻头速度至每分钟20,000发。沿矩形边缘继续钻孔，直到轮廓内的骨头变薄约90%。

不要完全钻穿头骨。换成细弯曲硬膜钩。极其小心地将钩尖插入薄骨边缘，沿着窗户边缘滑动，小心地将骨瓣与周围的头骨及下方组织分离。

用硬脑膜钩小心地将成功脱落的骨瓣从后到前方向抬起，约在颅骨表面上方35度。用产钳抓住被抬起的边缘，轻轻左右摇摆，直到钢板完全松开。用冰冷的ACSF反复清洗，轻柔地清除暴露区域的凝血。

出血减退后，将一块无菌预制PDMS膜直接放在硬膜表面下方。当尺寸合适时，它能精确覆盖窗户，并被动地附着于硬膜，使其贴合大脑。通过涂抹硅胶密封剂封闭开颅手术。

填满牙科胶水密封箱与头板内缘之间的每一个缝隙，完全包围并重叠BDMS膜的边缘。在录音间隙间，将定制的3D打印保护盖固定在头板上，并加入少量氰基丙烯酸酯胶水，以保护窗户。小鼠现在已准备好恢复，应将其转移到自己的笼子，以便单独安置，以防止植入物受损。

成功的手术会在皮层上方形成一个透明透明的窗户，血管可见，炎症或感染的迹象极少。这种清晰度可持续超过21天，支持长期纵向研究。通过慢性窗口记录的原始电生理信号在纵向时间线上保持了高质量。

这里，首次记录日和记录后21天并列展示了从后脾后网格采样的代表性宽带微ECoG痕迹，以及同时从浅层皮层通道采样的颅内探针局部场电位痕迹。第21天的记录显示信号振幅、频谱内容及运动和噪声伪影与同一动物第0天记录相当，证实无论是PDMS膜和硅胶密封的慢性存在，还是多次硬膜穿刺，都未在表层皮层中引入可检测到的表面或颅内探针信号质量的降解，而这些层通常会先出现退化。该技术的主要验证是随着时间获取稳定、高质量的多模态电生理数据。

可重新密封的窗口允许反复插入探针，记录同一神经元群体的探针，跨越数周。在阿尔法波段，从尾部高密度颅内电极探针通道计算的相位锁定值矩阵显示基线至治疗后第21天会话间的功能结构稳定。这显示了可重复的再插入到同一皮层位置，而非对同一单个神经元进行正式追踪。

尽管短刀的微小插入平移排除了相同的单位主张，但阿尔法波段相互作用的整体层流和区域结构得以保留，支持慢性窗口允许对同一功能电路进行纵向采样。为直接验证慢性窗口支持同一深层结构跨会话的可重复层流定位，从探针的LFP通道计算了电流源密度或CSD图谱。刺激诱发的CSD谱显示，预期的层流下沉源特征，包括前边缘皮层和前扣带状区域，在每次会话间都得以保留。

两次会话间的层流功率覆盖层高度相似，皮尔逊相关系数为0.81。次级运动皮层观察到的差异很可能是由于不同记录之间运动的差异所致。由于CSD绘图包含解剖信息，它可以在会谈中提供一个非终端读数，显示每个探针当前正在采样的大脑区域，而这些区域与死后组织染色无关。

表面微型ECoG在不同会诊间的可重复性可独立量化，独立于颅内CSD读数。将第0天和第21天从微ECoG网格计算出的带限空间功率图叠加，分别计算两张图的像素级相关性，分别针对前方和尾方子网格计算。子网格轮廓相关性依然很高，两个会话的空间条码明显共局限于阵列前半半和尾半叶的同一皮层功率热点。

通过半透明网格可见的正弦波对齐队列，以及探针插入坐标处刻印的骨槽，支持了21天纵向间隔内微ECoG定位的毫米级可重复性。为进一步验证该技术，开颅术后约四周，对GFAP和IBA1进行了免疫组化染色。GFAP由星形胶质细胞表达，星形胶质细胞在反应性胶质细胞增生（如脑损伤或炎症）中被上调。

而IBA1则由小胶质细胞表达，这些小胶质细胞在神经炎症过程中更为活跃。验证队列包括完成完整两阶段手术并在术后第0、21和22天重新打开颅窗三次的动物。但该队列未进行微型ECoG置入或颅内探针插入。

在两次会诊之间，窗口会重新密封，就像电生理记录时一样。因此，该队列将慢性窗和反复硬膜暴露的炎症贡献与任何探针诱导的组织损伤隔离开来。在无手术对照组与接受手术的载体组之间，任何一个标志物均未观察到显著差异。

这些代表性显微照片未显示窗下方区域有反应性胶质增生或小胶质细胞激活的定性证据。然而，探针轨迹附近和探针插入半球附近观察到小胶质细胞和星形胶质细胞激活略有增加，这很可能是由于颅内探针插入速度过快所致。成功的手术会在皮层上方形成一个清晰透明的窗户，炎症极少。

慢性治疗期结束后，可能会出现一些脑部肿胀。这可以通过密切监测和管理，必要时使用额外的止痛药来控制。记录时，只需拆除盖子和密封剂，放置微型ECoG网格和神经像素探针，开始从清醒且行为正常的动物处采集数据。

总之，这一两阶段手术方案为小鼠创造大型慢性颅窗提供了一种可靠且高效的方法。该方法的主要优点是对硬膜的损伤极小，且提供了大量暴露，这对于同时放置表面微型ECoG网格和多个深脑神经像素探针至关重要。该方法使得对DMN及其他大型电路中网络范围的电生理动力学进行了前所未有的纵向研究。

它为复杂行为的神经基础和脑部疾病的病理生理学进行了更深入的研究打开了大门，最终有助于新疗法的发展。