Name: 冠状动脉旁路移植患者冠状动脉内动脉切除术组织中的单核分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-03T13:08:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 学习从冠状动脉旁路移植患者内膜切除组织中分离高质量单核细胞的方法，用于单核RNA测序分析。该技术可保留核完整性，支持不稳定动脉粥样硬化斑块的转录组学研究和细胞异质性分析。

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本研究工作得到了印度医学研究理事会（ICMR）（项目编号：EM/Dev/SG/34/01106/2024）以及艾哈迈达巴德U. N. Mehta心脏病学与研究中心的合作支持。Khushi Jani 感谢印度政府大学资助委员会（UGC）和科学与工业研究理事会（CSIR）授予的CSIR-UGC联合国家资格考试资格（NTA参考编号：241620143543）。

本研究经U. N. Mehta心脏病学与研究中心人类伦理委员会（EC/Approval/26/Cardio/14/12/2024）和古吉拉特生物技术大学（GBU_IHEC/2023/006）批准，并遵循其指导方针进行。所有参与者在样本采集前均签署了知情同意书。本研究纳入接受冠状动脉旁路移植术合并冠状动脉内膜剥脱术的患者。手术切除后，立即将内膜剥脱组织置于无血清的RPMI培养基中，于4 °C保存，并在约12小时内通过冻存管运送至实验室。有关本方案所用全部材料的详细信息，请参见材料表。
1. 细胞核分离
注意：所有步骤均需在冰上进行，并使用无菌材料。所有缓冲液均需新鲜配制。
<ol>
	<li>用无血清RPMI培养基清洗组织一至两次，以去除血液污渍和碎片。使用无菌镊子将组织转移至无菌培养皿中，并记录重量。</li>
	<li>使用手术刀（10号）将组织切成小块 &#8764;1 mm3 在大小上。</li>
	<li>通过将以下成分依次加入无核酸酶水中，配制 1 mL 裂解缓冲液：10 mM Tris-HCl（pH 7.4）、10 mM NaCl、3 mM MgCl₂（各成分均使用 1 M 储存液）、0.1%（v/v）Nonidet P-40。添加顺序如下：先加入无核酸酶水，然后依次加入 Tris-HCl、NaCl、MgCl₂&#8322;，最后加入NP-40，以避免起泡。 
	注意：裂解缓冲液应在使用当天新鲜配制，并始终置于冰上保持低温。切勿冷冻。</li>
	<li>向5 mL 微离心管中的组织加入预冷的1 mL 裂解缓冲液。</li>
	<li>在冰上使用微型研杵，施加轻柔且均匀的力，交替顺时针和逆时针旋转研磨，以裂解组织。裂解过程持续约30分钟，确保样品始终保持低温。 
	注意：将组织裂解至浑浊状态。使用 1000 &#181;用L型吸头通过移液轻轻混匀。</li>
	<li>使用100 μm滤网过滤溶液 &#181;使用孔径为 m 的滤网将液体过滤至 15 mL 离心管中，以去除碎片和组织块。 
	注意：滤液应变得较为澄清，可见的残渣应留在滤网上。</li>
	<li>以 500 x g 离心细胞核 g 4℃下离心5分钟 &#730;C，使用摆动桶转子。 
	注意：试管底部应出现可见的沉淀。</li>
	<li>使用普通孔径的移液器吸头小心移除上清液，避免扰动沉淀。</li>
	<li>通过混合1%牛血清白蛋白（BSA）（使用10%的储存液）、0.2 U/μL重组RNase抑制剂和1×磷酸盐缓冲液（PBS），配制细胞核洗涤和重悬缓冲液。&#181;L RNase抑制剂（使用20 U/&#181;1X杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中配制L储备液。按以下顺序依次加入成分：先加DPBS，然后加BSA，最后加RNase抑制剂。 
	注意：缓冲液应在使用当天新鲜配制，并始终置于冰上冷藏。切勿冷冻。</li>
	<li>将沉淀重悬于细胞核洗涤和重悬缓冲液中。使用前将缓冲液置于冰上预冷。</li>
	<li>通过使用5染色评估裂解效率和细胞活力 &#181;L 台盼蓝染色并在血细胞计数板中计数。 
	注意：如果仍存在活细胞，以500 x g离心 g 4℃下离心5分钟 &#730;C，然后重复步骤3-10。</li>
	<li>使用30 &#181;使用孔径为 m 的滤网将液体过滤至 15 mL 离心管中，以去除碎片和团块。</li>
	<li>以 500 x g 离心细胞核 g 4℃下离心5分钟 &#730;C，使用摆动桶转子。</li>
	<li>使用普通孔径的移液器吸头去除上清液，然后将沉淀重悬于 1 mL 核洗涤与重悬缓冲液中。</li>
</ol>
2. 分离细胞核的表征
<ol>
	<li>使用台盼蓝染色评估细胞核完整性。
	<ol>
		<li>取15 µL分离的细胞核悬液置于1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>加入5 µL台盼蓝染料（0.4% w/v），通过移液轻轻混匀。</li>
		<li>室温孵育5分钟，以确保充分染色。</li>
		<li>将10 µL染色后的混合液加载至血细胞计数板。</li>
		<li>在倒置复合显微镜下观察，检查细胞核形态并计数细胞核数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单细胞核悬液的流式细胞术分析
	<ol>
		<li>取1 mL分离的细胞核悬液，在4 ˚C条件下，使用摆动桶转子以500 × g离心5分钟。</li>
		<li>用普通孔径的移液枪头吸除上清液，并将沉淀重悬于200 µL FACS缓冲液（1× PBS + 1% BSA）中。</li>
		<li>将200 µL重悬的细胞核分为两份：保留100 µL作为未染色对照，另100 µL用于染色样本。</li>
		<li>向染色样本中加入1 µL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（1 mg/mL储备液），使终浓度达到10 µg/mL。轻轻混匀后，在避光条件下室温孵育5分钟，再进行流式细胞术分析。</li>
		<li>在本研究所用的流式细胞仪上，使用405 nm紫色激光，检测通道设为448/45 nm。先运行未染色对照样本，采集至少10,000个总群体事件。</li>
		<li>前向散射（FSC）电压设为183 V，侧向散射（SSC）电压设为300 V，V450（DAPI激光）电压设为400 V。FSC阈值设为10,000。 
		注：所有仪器的电压和增益设置在各样本间保持一致，以确保实验一致性。</li>
		<li>绘制前向散射面积（FSC-A）与前向散射高度（FSC-H）的散点图，以区分单细胞核与双联体及聚集体。对呈线性关系的事件画门，仅保留单细胞核。</li>
		<li>生成FSC-A与侧向散射面积（SSC-A）的双变量散点图。设置一个宽泛的门涵盖整个散射群体，因为分离的细胞核通常表现出异质性散射特征，无明显亚群。</li>
		<li>创建SSC-A与Violet 450 nm面积（V450-A）的二维密度（伪彩）图。利用未染色对照确定背景荧光，并指导精确设门。识别并圈选明显的DAPI⁺群体，对应完整细胞核。 
		注：由于仅使用一种荧光染料（DAPI），无需进行荧光补偿。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用共聚焦显微镜成像分离的细胞核
	<ol>
		<li>取50 µL细胞核悬液，向染色样本中加入1 µL DAPI（1 mg/mL），使终浓度达到10 µg/mL，轻轻混匀，并在避光条件下室温孵育5分钟，随后进行共聚焦成像。</li>
		<li>取5 µL染色后的细胞核悬液滴加至洁净载玻片上，加盖盖玻片。 
		注：避免固定，以保持细胞核形态完整。</li>
		<li>使用倒置共聚焦显微镜观察细胞核。打开共聚焦显微镜软件，先在10X明场下观察，再切换至40X明场。</li>
		<li>使用配备光谱检测器和PLAN APO λD 40X物镜（NA 0.95，RI 1.0）的激光扫描共聚焦显微镜采集图像。采用405 nm激光激发DAPI，收集429–474 nm发射光。</li>
		<li>成像参数如下：
		<ol>
			<li>检测器模式：多通道（GaAsP）</li>
			<li>扫描器：单向检流计扫描</li>
			<li>扫描模式：条带扫描</li>
			<li>线平均：2X</li>
			<li>分辨率：1024 × 1024 像素</li>
			<li>驻留时间：2.0 µs</li>
			<li>针孔大小：47.7 µm</li>
			<li>激光功率：0.1–9.3%（根据视野强度调整）</li>
			<li>检测器增益：37.8–45.9%</li>
			<li>缩放倍数：1.0X</li>
			<li>校准值：0.43–0.58 µm/像素</li>
		</ol>
		</li>
		<li>所有图像均使用AX相机在最小串扰模式下、相同光学配置中采集，成像过程中应启用完美聚焦系统（PFS），以维持Z平面稳定性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Rani, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+use+of+RPMI+Medium+to+preserve+cell+morphology+for+pleural%2Fperitoneal+fluid+cytology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of use of RPMI Medium to preserve cell morphology for pleural/peritoneal fluid cytology.</a> J. Cytol. 39 (1), 26-29 (2022).</li>
<li>Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+relief%3A+emerging+methods+to+mitigate+dissociation-induced+artefacts%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stress relief: emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts.</a> Trends Cell Biol. 31 (11), 888-897 (2021).</li>
<li>Slyper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+toolbox+for+fresh+and+frozen+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A single-cell and single-nucleus RNA-seq toolbox for fresh and frozen human tumors.</a> Nat. Med. 26 (5), 792-802 (2020).</li>
<li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nat. Protoc. 11 (3), 499-524 (2016).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案描述了一种优化的人类冠状动脉内膜剥脱术组织细胞核分离工作流程。此处所述的细胞核分离方案专门设计用于克服从晚期冠状动脉粥样硬化斑块中获取存活且完整细胞所面临的关键限制。与依赖强烈酶消化和机械解离的传统单细胞RNA测序（scRNA-seq）方法21,30不同，我们优化的方案采用含有非离子型去污剂（Nonidet P-40）的裂解缓冲液进行温和的机械匀浆，选择性释放细胞核，同时保持其结构完整性31。该方法在分析冠状动脉组织方面具有多项关键优势。首先，非离子型去污剂能有效破坏细胞膜，同时保持核膜完整，从而实现细胞核与细胞质成分、脂滴及细胞外碎片的清晰分离，避免这些杂质污染样本并阻碍微流控捕获系统32,33。其次，通过避免酶消化，我们防止了在晚期粥样硬化病变中特别丰富的脆弱细胞群体的选择性丢失，这些细胞通常会被传统的蛋白水解处理所破坏<sup class="xr...

动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）是全球导致死亡和残疾的首要原因，尽管治疗手段已取得重大进展，其疾病负担仍未减轻1。动脉粥样硬化是一种累及动脉壁的慢性炎症性疾病，由多种细胞群体之间复杂而动态的相互作用驱动，这些相互作用共同调控疾病从早期无症状阶段悄然进展为严重影响生活质量的心血管（CV）事件2。
在中型和大型动脉中，巨噬细胞内胆固醇沉积物的积聚是动脉粥样硬化的典型特征3。动脉粥样硬化斑块由脂肪酸、胆固醇、炎性细胞、钙、纤维蛋白、平滑肌细胞、内皮细胞以及内皮下层的细胞碎片组成4。动脉粥样硬化斑块分为两类：低风险斑块和高风险斑块。高风险斑块的特点是容易引发后续心血管事件，通常通过斑块侵蚀或破裂等机制实现5。
高危斑块的特征包括较大的脂质核心、大量炎性细胞、较少的平滑肌细胞、薄的纤维帽、微钙化、斑块内出血、新生血管以及坏死核心6。临床上对高危斑块的检测主要通过非侵入性和侵入性成像技术进行，分别为冠状动脉计算机断层扫描血管造影（CCTA）和光学相干断层成像（OCT）7,8。尽管心血管成像技术已取得诸多进展，但预测导致心肌梗死（MI）的动脉粥样硬化斑块破裂仍具挑战性，在临床实践中并不总是有效9。
尽管经过数十年的研究，我们仍然缺乏能够特异性识别高危斑块表型的可靠循环生物标志物，这在动脉粥样硬化的临床管理中留下了关键的空白。因此，迫切需要能够在更基础的生物学层面上表征这些斑块的分子策略7,10。在这一背景下，基于RNA的标志物受到了广泛关注，因为它们能够捕捉斑块微环境中复杂的转录活性11。近年来单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的发展尤为突出，其以前所未有的分辨率对动脉粥样硬化斑块中的单个细胞进行分析，揭示了与斑块易损性相关的不同细胞群体、基因表达模式及分子通路12,13。尽管取得了这些进展，目前对于参与动脉粥样硬化发展的各种细胞类型的调控过程、相互作用及其功能重要性仍知之甚少14。
当动脉粥样硬化负荷严重且弥漫时，外科血运重建成为确定的治疗策略。冠状动脉内膜剥脱术（CE）是冠状动脉旁路移植术（CABG）的一种外科辅助手段，通过机械方式从弥漫性病变的冠状动脉中去除动脉粥样硬化斑块，以实现旁路移植并完成心肌的完全血运重建15,16。动脉粥样硬化斑块及内膜剥脱标本在操作上尤为困难，因其含有大量坏死组织、脂质沉积物、纤维蛋白和钙化成分。当这些组织被分解用于分析时，会产生大量碎屑，堵塞滤膜和微流控系统，使得活单细胞的分离极为困难17,18。事实上，一项颈动脉斑块研究发现，组织处理后，活细胞仅占所有颗粒的不到1%；其余均为斑块碎屑18。
这一挑战因动脉粥样硬化斑块处于慢性代谢和氧化应激状态而进一步加剧，在这种状态下，经历凋亡、衰老及其他退行性过程的细胞导致细胞膜日益脆弱，易于破裂，使得 viable 单细胞的分离极为困难18,19,20。为制备单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）样品所需的机械和酶消化过程常常会损伤这些本已受损的细胞，进一步降低细胞活性，导致细胞捕获率低下。该过程还倾向于选择性丢失脆弱或稀有的细胞群体，从而对转录组数据以及最终结果中所代表的细胞类型引入显著偏差。在钙化或病变严重的斑块中，这一问题尤为突出，因为需要更剧烈的处理条件来分解组织，这会对细胞活性造成额外损伤18,21,22。
相比之下，细胞核即使在这些不利条件下仍能保持结构完整23。这主要归因于核膜——一种由核纤层蛋白（Lamin A/C 和 Lamin B）加固的双层脂质膜，为细胞核提供了机械刚性，使其能够抵抗渗透压、酶解及物理应力，而这些应力可轻易破坏细胞膜24,25。即使周围细胞质严重受损，核纤层仍可维持细胞核的形态26。因此，单核RNA测序（snRNA-seq）相较于单细胞RNA测序（scRNA-seq），在分析动脉粥样硬化组织时更具实用性和可靠性27。snRNA-seq通过获取完整细胞核而非完整细胞的转录信息，规避了细胞活力差和碎片含量高的限制，从而实现对斑块微环境更准确、更全面的转录组学分析18。
因此，在本研究中，我们提出了一种针对冠状动脉内膜剥脱术组织优化的细胞核分离方案，该方案采用基于非离子型去污剂的裂解方法，并根据组织钙化程度经验性调整裂解时间，以稳定获得高质量的细胞核，其结构和RNA完整性均得到保持，适用于后续的单核RNA测序（snRNA-seq）分析。

<table><tbody><tr><td>100 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>Miltenyi Biotech&amp;nbsp;</td><td>130-098-463</td><td></td></tr><tr><td>30 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>Miltenyi Biotech&amp;nbsp;</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>HiMedia</td><td>TC546-25G</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>MPW</td><td>NA</td><td>https://mpw.pl/en/offer/mpw-352r</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Nikon</td><td>NA&amp;nbsp;</td><td>Nikon Eclipse Ts2 倒置显微镜 (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ts2)</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td>Nikon Ti2-E 倒置共聚焦显微镜 (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series)</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>HiMedia</td><td>BG011C</td><td></td></tr><tr><td>CRYOCHIL 广口样本瓶</td><td>Tarsons</td><td>883191</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco (Thermofischer)</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>离心管（15 mL）</td><td>Tarsons</td><td>546021</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>663029</td><td>BD FACSLyric (3L12C 仪器 CEIVD)</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Axibio</td><td>CCB 100</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管（1.5 mL）</td><td>Tarsons</td><td>500010C</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管（5 mL）</td><td>Tarsons</td><td>500050</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂</td><td>Sigma</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>微型研磨棒</td><td>Tarsons</td><td>160020</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888-500G</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>HiMedia</td><td>MB143-100ML</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Gibco (Thermofischer)</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>RNase 抑制剂</td><td>Sigma</td><td>333540201</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco (Thermofischer)</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>载玻片&amp;nbsp;</td><td>Riviera</td><td>72910135</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T2194-100ML</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>302643-25G</td><td></td></tr></tbody></table>

冠状动脉旁路移植术患者冠状动脉内膜剥脱组织的单细胞核分离

Single Nuclei Isolation from Coronary Endarterectomy Tissue of Coronary Artery Bypass Graft Patients

动脉粥样硬化是一种慢性、进行性炎症性疾病，其特征是动脉壁内斑块的积聚。在斑块形成的过程中，某些病变会变得不稳定，被称为高风险斑块，可能引发心肌梗死（MI）。动脉粥样硬化斑块由平滑肌细胞、内皮细胞、免疫细胞、脂肪细胞和坏死细胞组成，这些细胞均可能导致斑块破裂。研究动脉粥样硬化斑块内的细胞异质性对于深入理解斑块不稳定的潜在机制至关重要。本文介绍了一种可重复性高的实验方案，用于从接受冠状动脉旁路移植术（CABG）患者的冠状动脉内膜剥脱组织中分离并验证细胞核。所有组织在收获前均保存于湿冰上的 Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基中，以维持细胞完整性。组织样本经精细剪碎后，在裂解缓冲液中使用微型研杵轻柔破碎，以裂解细胞并释放细胞核。通过台盼蓝排斥实验，在倒置显微镜下评估所分离细胞核的完整性和得率。DAPI染色可用于共聚焦显微镜下完整细胞核的可视化，而流式细胞术则提供基于荧光的定量分析，用于评估细胞核分离得率并验证细胞核群体。与传统的单细胞解离分离方法相比，细胞核分离可减少细胞应激，维持天然的转录组环境，从而避免基因表达的改变。本方法获得的高质量细胞核样品适用于后续应用，如单细胞核RNA测序（snRNA-seq）。

采集接受冠状动脉旁路移植术（CABG）患者的冠状动脉内膜剥脱组织。将组织称重后进行细胞核分离，进一步通过流式细胞术和共聚焦显微镜确认分离得到的细胞核（图1）。
台盼蓝评估细胞核分离质量 
保存在RPMI培养基中的组织经称重后为247.8 mg。将组织剪碎后，使用微型研杵在裂解缓冲液中进行匀浆，以分离细胞核（图2A-C）。在完成细胞核分离并进行台盼蓝染色后，我们观察到明显的细胞核群体，未见完整活细胞，证实组织裂解有效。在显微镜下，分离的细胞核呈致密、圆形、深蓝色的结构，表明细胞核成功分离。此外，悬浮液中细胞核浓度约为4,033 个/µL（图2D）。相比之下，钙化斑块组织获得的细胞核产量较低，质量也较差。显微镜下还观察到样本中存在不规则的聚集体和碎片，提示在重度钙化样本中有效释放细胞核存在困难（<str...

采用优化的解离方案对冠状动脉内膜切除术组织样本进行处理，以分离单个细胞核。通过三种互补方法验证分离细胞核的完整性：台盼蓝排斥染色法评估细胞膜完整性，DAPI标记共聚焦显微镜观察确认细胞核形态，流式细胞术定量细胞核得率与纯度。

动脉粥样硬化是一种慢性、进行性炎症性疾病，其特征是动脉壁内斑块的积聚。在……过程中

我们的主要研究重点是绘制不稳定动脉粥样硬化斑块中的细胞多样性图谱，以理解细胞间的相互作用，并开发基于RNA的预后标志物。由于膜脆性阻碍了从内膜剥脱术获取的组织中分离单细胞，因此本方案采用分离保存完整的细胞核的方法，从而实现对高危斑块进行转录组学分析。首先，准备好所有试剂和冰盒以开始实验操作。用无血清的RPMI培养基清洗组织一到两次，以去除血迹和碎片。使用无菌镊子将组织转移至无菌培养皿中，并记录重量。使用10号手术刀片将组织切成大约一立方毫米大小的小块。现在向1.5毫升微量离心管中加入1毫升预冷的裂解缓冲液和组织。将微量研磨杵置于冰上，用轻微且均匀的力度对组织进行研磨，交替顺时针和逆时针旋转微量研磨杵以裂解组织。将样品置于冰上，继续裂解约30分钟。使用孔径为100微米的滤网将溶液过滤至15毫升离心管中，以去除碎片和组织块。使用摆桶转子，在4摄氏度条件下以500 G离心力离心5分钟，收集细胞核。然后使用普通孔径的移液器吸头去除上清液，注意不要扰动沉淀。使用前将重悬缓冲液中的细胞核洗涤液置于冰上预冷。将沉淀重悬于预冷的细胞核洗涤及重悬缓冲液中。通过向样品等分试样中加入5 µL台盼蓝，使用血细胞计数板对细胞进行计数，快速评估裂解效率和细胞活力。若在显微镜下观察到活细胞，请重复裂解、过滤和离心步骤。然后将溶液经孔径30 µm的滤网过滤至15 mL离心管中，以去除碎片和细胞团块。使用摆桶转子，在 4 摄氏度条件下以 500 G 离心 5 分钟。离心后，用普通孔径的移液器吸头小心去除上清液，避免扰动沉淀物，并将沉淀物重悬于 1 毫升细胞核洗涤与重悬缓冲液中。取 15 微升分离的细胞核悬液加入 1.5 毫升微量离心管中。向细胞核悬液中加入5 µL浓度为0.4%（质量/体积）的台盼蓝染料，用移液器轻轻混匀。室温避光孵育5分钟后，取10 µL染色后的混合液加入血细胞计数板。在倒置显微镜下观察样品，评估细胞核形态并计数细胞核数量。取1毫升分离的细胞核悬液，使用摆桶转子在4摄氏度下以500 ×g离心5分钟。用普通孔径的移液器吸头小心移除上清液，避免扰动沉淀。将沉淀重悬于200微升荧光激活细胞分选缓冲液中，该缓冲液由PBS和1%牛血清白蛋白组成。将200微升重悬的细胞核分为两份。保留100微升作为未染色对照，其余100微升作为染色样品。向染色样品中加入1微升浓度为1毫克/毫升的DAPI储备液，使其终浓度达到10微克/毫升。用移液器轻轻混匀，室温避光孵育5分钟。将流式细胞仪设置为使用405纳米的紫色激光，并通过448/45纳米进行检测。先运行未染色对照样本，采集至少10,000个总群体事件。生成前向散射面积与前向散射高度的散点图，以区分单细胞、双联体及聚集体。圈选呈现线性关系的事件，以仅保留单细胞核。接着，生成前向散射面积与侧向散射面积的双变量图，并绘制一个宽泛的门控区域，涵盖整个散射群体。现在，创建一个侧向散射面积与紫光450纳米面积的二维密度伪彩图。使用未染色对照样本确定背景荧光，并指导设门位置。识别并圈选明显的DAPI阳性细胞群，该细胞群对应于完整的细胞核。取 50 微升细胞核悬液，加入 1 微升浓度为 1 毫克/毫升的 DAPI 储存液，使终浓度达到 10 微克/毫升。用移液器轻轻混匀，室温避光孵育 5 分钟，随后进行共聚焦成像。取 5 微升染色后的细胞核悬液滴加到洁净的玻片上，盖上盖玻片。接下来，打开共聚焦显微镜软件，在40倍明场下观察细胞核。最后，使用激光扫描共聚焦显微镜采集共聚焦图像。采用405纳米激光激发DAPI，并收集429至474纳米之间的发射光信号。经过细胞核分离和台盼蓝染色后，观察到明显的细胞核群体，且无完整活细胞存在，证实组织裂解有效。在显微镜下，分离的细胞核呈致密、圆形、深蓝色的结构，表明细胞核分离成功。钙化斑块组织产生的细胞核得率较低，且细胞核质量下降。未染色对照的流式细胞术检测结果显示，单细胞占比为77.88%，DAPI阳性事件占比为0.19%，反映了基础水平的自发荧光。DAPI染色样本显示单细胞占比为68.1%，DAPI阳性细胞核占比为25.31%，表明出现明显的荧光偏移。直方图分析显示，与未染色的细胞核群体相比，DAPI染色的细胞核荧光信号向右偏移。染色样品的共聚焦成像显示明亮的蓝色荧光细胞核，形态完整且标记均匀。单细胞核RNA测序分析在降维后鉴定出16个不同的细胞簇。执行本方案时最主要的挑战是该组织中存在高度钙化，这会严重影响细胞核的质量和得率。面部转录组是另一种可用来获取详细信息的方法，因此它能够提供有关特定基因表达以及细胞间相互作用的信息。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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小鼠瓣膜内皮细胞的分离

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外泌体负载胶原贴片联合非体外循环冠状动脉旁路移植术治疗慢性心肌缺血的猪外科模型

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