Name: 快速制备重组人类SLFN14核糖核酸酶及通过质质光度计量分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-20T14:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 了解利用哺乳动物细胞系快速制备重组人类SLFN14核糖核酸酶的方法，并通过质质光度计量分析其化学计量比。该技术有助于深入研究真核生物基因调控中的核糖核酸酶功能。

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感谢Pillon实验室成员对本文稿的审阅。本工作由美国国立卫生研究院外部研究计划、国家普通医学科学研究所（NIGMS；R35GM147123，授予M.C.P.）资助，该资助最初授予贝勒医学院，后转移至纽约州立大学布法罗分校。C.D.M. 受美国国立卫生研究院培训基金（资助号：T32 GM159557）支持。&#160;

涉及HEK293细胞培养的实验应在符合批准的机构生物安全规程的生物安全二级（BSL-2）条件下进行。
1. 在哺乳动物细胞中瞬时表达 SLFN14Myc-Flag
<ol>
	<li>将哺乳动物HEK293悬浮细胞以0.5 × 106 个细胞/mL的密度接种至预热的无血清培养基中，最终体积为320 mL，置于通气带挡板的1 L锥形瓶中。</li>
	<li>于37 °C、125 rpm、8% CO2、75–80%湿度条件下培养24–32小时。</li>
	<li>使用台盼蓝染色和细胞计数仪检测细胞密度是否达到1.2–1.8 × 106 个细胞/mL，且细胞活力高于90%19。</li>
	<li>将40 mL培养物分装至八个锥形管中。</li>
	<li>在20–25 °C条件下，以400 × g离心5分钟收集细胞。</li>
	<li>弃去培养上清液。</li>
	<li>将每个细胞沉淀轻轻重悬于38 mL预热的无血清转染培养基中，最终体积为304 mL。 
	注意：步骤1.1中所述原始培养体积中剩余的16 mL将由步骤1.12所述的转染混合物补充。</li>
	<li>将细胞转移至一个新的通气带挡板的1 L锥形瓶中。</li>
	<li>在锥形管中，将编码重组SLFN14Myc-Flag基因的320 μg纯化质粒DNA加入8 mL无血清转染培养基中，于20–25 °C孵育5分钟。 
	注意：质粒浓度通常为500 ng/μL，最终体积为640 μL。</li>
	<li>与步骤1.9同时进行，将960 μg经0.22 μm滤膜除菌的PEI加入8 mL无血清转染培养基中，于20–25 °C孵育5分钟。 
	注意：工作液&#160;浓度通常为1 mg/mL，最终体积为960 μL。</li>
	<li>将PEI混合物（见步骤1.10）缓慢逐滴加入重组质粒DNA溶液（见步骤1.9）中，于20–25 °C孵育15分钟。</li>
	<li>将16 mL DNA/PEI混合物缓慢逐滴加入步骤1.8中准备好的细胞中。</li>
	<li>于37 °C、125 rpm、8% CO2、75–80%湿度条件下继续培养48小时。</li>
	<li>将40 mL转染后的细胞分装至八个锥形管中。</li>
	<li>以400 × g在20–25 °C离心5分钟收集转染细胞。</li>
	<li>弃去上清液，将八个细胞沉淀储存于-80 °C。</li>
</ol>
2. 两步法重组SLFN14Myc-Flag纯化
<ol>
	<li>抗Flag亲和层析。 
	&#8203;使用步骤1.16中获得的四个细胞沉淀，每份制备重复两次，进行抗Flag亲和层析实验。
	<ol>
		<li>树脂准备。
		<ol>
			<li>将抗Flag琼脂糖树脂在20–25 °C下平衡15分钟。</li>
			<li>在转移40 μL的50%树脂悬液至2 mL微量离心管前，轻轻倒置瓶身以重悬树脂。 
			注意：剪去移液器吸头末端，以便更容易吸取黏稠的悬液。</li>
			<li>用1 mL高盐洗涤缓冲液（50 mM Tris pH 7.4，600 mM NaCl，5 mM MgCl2，0.5 mM β-ME，0.1% Tween-20）重悬树脂。</li>
			<li>在4 °C下孵育45分钟。</li>
			<li>在4 °C下以8,000 × g离心树脂悬液2分钟。</li>
			<li>小心吸除并弃去高盐洗涤缓冲液，避免扰动树脂。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>细胞裂解液澄清。
		<ol>
			<li>将每个转染后的细胞沉淀用225 μL预冷的重悬缓冲液（50 mM Tris pH 7.4，600 mM NaCl，5 mM MgCl2，0.5 mM β-ME，0.5% Triton-X-100，1 mM PMSF，5 μg/mL亮抑蛋白酶肽，1 mM苯甲脒，0.7 μg/mL胃蛋白酶抑制剂A，0.25 U/mL Genius核酸酶）重悬，四个细胞沉淀总体积为900 μL。</li>
			<li>将细胞转移至预先在冰上预冷的2 mL微量离心管中。</li>
			<li>将微量离心管水平置于旋转混合仪上，在4 °C下孵育30分钟。 
			注意：保留20 μL总裂解液于-20 °C保存，用于在蛋白表达水平较低时进行故障排查。</li>
			<li>在4 °C下以21,300 × g离心20分钟，澄清细胞裂解液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>蛋白亲和捕获与洗涤。
		<ol>
			<li>将澄清后的裂解液（见步骤2.1.2.4）与平衡后的抗Flag树脂（见步骤2.1.1.6）混合。</li>
			<li>将裂解液-树脂混合物置于微量离心管中，水平放置于旋转混合仪上，在4 °C下孵育60分钟。</li>
			<li>在4 °C下以8,000 × g离心裂解液-树脂混合物2分钟，形成树脂沉淀。</li>
			<li>小心弃去约700 μL上清液，避免扰动树脂沉淀。 
			注意：在树脂结合后，保留20 μL上清液于-20 °C保存，用于在捕获效率较低时进行故障排查。</li>
			<li>重悬剩余的树脂-上清液混合物，并将溶液转移至插入空的2 mL微量离心管中的800 μL容量离心柱中。</li>
			<li>在4 °C下以1,000 × g离心离心柱2分钟，弃去穿流液。</li>
			<li>用500 μL高盐洗涤缓冲液冲洗步骤2.1.3.5中的空微量离心管，并将冲洗液转移至离心柱中。 
			注意：此步骤有助于回收微量离心管中残留的树脂。</li>
			<li>在4 °C下以1,000 × g离心离心柱2分钟，弃去穿流液。</li>
			<li>向离心柱中加入500 μL高盐洗涤缓冲液。在4 °C下以1,000 × g离心2分钟，弃去穿流液。重复此步骤，共进行四次高盐洗涤。</li>
			<li>向离心柱中加入500 μL低盐洗涤缓冲液（50 mM Tris pH 7.4，150 mM NaCl，5 mM MgCl2，0.5 mM β-ME，0.1% Tween-20）。在4 °C下以1,000 × g离心2分钟，弃去穿流液。重复此步骤，共进行两次低盐洗涤。</li>
			<li>向离心柱中加入500 μL ATP洗涤缓冲液（50 mM Tris pH 7.4，150 mM NaCl，5 mM MgCl2，0.5 mM β-ME，0.1% Tween-20，10 mM ATP）。堵住离心柱底部，在4 °C下孵育5分钟。打开离心柱底部，在4 °C下以1,000 × g离心2分钟，弃去穿流液。重复此步骤，共进行四次ATP洗涤。</li>
			<li>进行最后一次洗涤：向离心柱中加入500 μL低盐洗涤缓冲液。在4 °C下以1,000 × g离心2分钟，弃去穿流液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>3xFlag肽洗脱蛋白。
		<ol>
			<li>用低纤维擦拭纸轻拭离心柱底部以去除多余液体，并堵住离心柱底部。</li>
			<li>直接在树脂上方加入55 μL 3xFlag洗脱缓冲液（50 mM Tris pH 7.4，150 mM NaCl，5 mM MgCl2，0.5 mM β-ME，0.1% Tween-20，300 μg/mL 3xFlag肽）。</li>
			<li>用封口膜密封离心柱开口，并将离心柱放入1.7 mL微量离心管中。</li>
			<li>将离心柱垂直置于旋转混合仪上，在4 °C下孵育60分钟。 
			注意：为保持离心柱垂直，可用橡皮筋将微量离心管架固定在旋转混合仪上。</li>
			<li>移除封口膜和离心柱塞子。在4 °C下以1,000 × g离心2分钟，将洗脱的重组SLFN14Myc-Flag蛋白收集至洁净的1.7 mL微量离心管中。</li>
			<li>保留50 μL抗Flag树脂洗脱液用于后续尺寸排阻层析，另取5 μL用于SDS-PAGE分析。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>尺寸排阻层析。 
	&#8203;使用低盐脱盐缓冲液（150 mM NaCl）进行标准SLFN14Myc-Flag蛋白分析，或使用高盐脱盐缓冲液（500 mM NaCl）进行脱辅基SLFN14Myc-Flag蛋白表征。
	<ol>
		<li>合并步骤2.1.4.6中获得的两份50 μL抗Flag树脂洗脱液，共100 μL样品。</li>
		<li>准备一个分子量截留值为40 kDa的0.5 mL离心脱盐柱：松开盖子，移除底部封盖，并将柱插入2 mL微量离心管中。</li>
		<li>在4 °C下以700 × g离心脱盐柱1分钟，去除柱内保存液，弃去穿流液。</li>
		<li>向脱盐柱中加入300 μL低盐或高盐脱盐缓冲液（20 mM Tris pH 7.4，150/500 mM NaCl，1 mM MgCl2，1 mM TCEP）。在4 °C下以700 × g离心1–2分钟，弃去穿流液。重复此步骤三次，以充分平衡柱子。</li>
		<li>用低纤维擦拭纸轻拭脱盐柱底部。</li>
		<li>将脱盐柱转移至洁净的1.7 mL微量离心管中。</li>
		<li>将100 μL合并的抗Flag树脂洗脱液（见步骤2.2.1）加至柱床中心，避免扰动树脂。</li>
		<li>在4 °C下以700 × g离心脱盐柱2分钟，洗脱重组SLFN14Myc-Flag蛋白。</li>
		<li>保留95 μL回收的重组蛋白用于分子表征，另取5 μL用于SDS-PAGE分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>表征纯化的重组SLFN14Myc-Flag蛋白样品。
	<ol>
		<li>进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
		<ol>
			<li>将5 μL 2× Laemmli上样缓冲液与纯化过程中不同阶段收集的5 μL样品等体积混合。</li>
			<li>在95 °C下加热样品5分钟。</li>
			<li>在4–15% SDS-PAGE凝胶中，以200 V电泳30分钟，同时上样蛋白分子量标准和10 μL样品-Laemmli缓冲液混合物。</li>
			<li>在摇床上用考马斯亮蓝G-250染色液染色凝胶30分钟，随后在摇床上用去离子水脱色至背景清晰。</li>
			<li>观察蛋白条带，确认步骤2.2.9中回收的样品为单一蛋白条带，且其分子量与SLFN14Myc-Flag理论分子量107.5千道尔顿（kDa）相符。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过紫外/可见光分光光度法定量蛋白与核酸。
		<ol>
			<li>使用微量分光光度计，以2 μL低盐或高盐脱盐缓冲液（与蛋白储存缓冲液一致）作为空白对照。</li>
			<li>使用微量分光光度计，测定2 μL回收的重组SLFN14Myc-Flag蛋白（见步骤2.2.9）在260 nm和280 nm处的吸光度。</li>
			<li>根据280 nm处测得的吸光度值和其消光系数（93330 M-1 cm-1），利用比尔-朗伯定律20计算重组SLFN14Myc-Flag蛋白浓度。</li>
			<li>通过将260 nm处吸光度值除以280 nm处吸光度值，计算样品A260/280比值，以判断是否有核酸与重组SLFN14Myc-Flag蛋白共纯化。 
			注意：A260/280比值高于0.7可能表明存在核酸污染21。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过荧光法定量细胞RNA。
		<ol>
			<li>使用1–3 μL步骤2.2.9中回收的重组蛋白，采用高灵敏度RNA特异性荧光染料22定量RNA含量。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 利用质量光度法分析 SLFN14Myc-Flag 的分子质量
<ol>
	<li>质谱光度计仪器设置。
	<ol>
		<li>使用质谱光度计电子箱背面的开关打开激光器。</li>
		<li>打开隔振台，并点击 &#34;隔振&#34; 按钮以最小化仪器振动。</li>
		<li>启动 AcquireMP 软件。</li>
		<li>等待 1 小时，使仪器达到热平衡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>盖玻片准备。
	<ol>
		<li>使用尖端柔软的镊子将玻璃盖玻片垂直夹持。</li>
		<li>用 I 型超纯水冲洗玻璃盖玻片两面，随后用异丙醇冲洗。重复此步骤共三次。</li>
		<li>最后用 I 型超纯水对玻璃盖玻片每一面再冲洗一次，持续 45 秒。</li>
		<li>使用连接真空管线的洁净移液器吸头，通过抽吸方式轻柔地去除玻璃盖玻片上多余的水滴。</li>
		<li>将洁净的玻璃盖玻片存放于内衬镜头纸的塑料盒中，以便运输至质谱光度计。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将盖玻片安装到仪器上。
	<ol>
		<li>使用尖端柔软的镊子将一个 6 孔硅胶垫圈放置在金属对准工具上。</li>
		<li>将步骤 3.2.5 中准备的洁净玻璃盖玻片置于硅胶垫圈上方，并使用尖端柔软的镊子轻轻按压硅胶垫圈周围区域。 
		注意：切勿在样品孔上方施加压力。</li>
		<li>在质谱光度计的物镜上滴加一滴浸油。</li>
		<li>翻转玻璃盖玻片，使硅胶垫圈朝上，使用尖端柔软的镊子将其轻柔地放置在物镜上。</li>
		<li>使用磁铁固定玻璃盖玻片的左上角和右下角。</li>
		<li>在横向控制模式下，在 AcquireMP 软件中选择左上角的孔，以使激光对准孔的中心。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析宽范围蛋白质标准品。
	<ol>
		<li>通过将 1 μL 的 500 倍浓缩校准品原液稀释至 9 μL 的 1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，制备 50 倍稀释的宽范围校准溶液（90 kDa 至 1 MDa）。</li>
		<li>取步骤 3.4.1 中制备的 50 倍稀释宽范围校准溶液 2 μL，加入 18 μL 的 1×磷酸盐缓冲盐水，配制成 5 倍稀释的校准工作液。</li>
		<li>向空孔中加入 10 μL 经 0.22 μm 滤膜过滤的低盐或高盐脱盐缓冲液。 
		注意：此步骤中使用的过滤缓冲液必须与步骤 2.2.9 中用于制备 SLFN14Myc-Flag 样品的缓冲液相匹配。</li>
		<li>关闭盖子。</li>
		<li>在“寻找焦面”模式下，点击 AcquireMP 软件中的 &#34;液滴稀释&#34; 以确定样品孔的正确焦面位置。</li>
		<li>向缓冲液液滴（见步骤 3.4.3）中加入 10 μL 的 5 倍稀释校准工作液，并轻轻吹打混合溶液。</li>
		<li>关闭盖子。</li>
		<li>检查仪器设置，确认运动、信号、饱和度和锐度的数值稳定且处于最佳状态。 
		注意：最佳数值显示为蓝色，异常值则显示为橙色。</li>
		<li>点击 AcquireMP 软件中的 &#34;记录&#34; 按钮，录制一段 60 秒的视频。</li>
		<li>将结果文件（.mpr）以具有描述性的标题和时间戳命名并保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>创建校准曲线。
	<ol>
		<li>打开 DiscoverMP 软件。</li>
		<li>在“测量”选项下，点击 &#34;+ 打开&#34; 按钮，并导航至步骤 3.4.10 中的校准品结果文件。</li>
		<li>双击列出的蛋白质标准品文件以查看结果。</li>
		<li>在“绘图配置”中，将对比度边界分别调整为 0.00000 和 -0.03000。</li>
		<li>通过将光标拖过各个峰，手动为前四个蛋白质标准品峰定义高斯曲线。</li>
		<li>点击 &#34;创建&#34;，并选择 &#34;质量校准&#34;。</li>
		<li>在校准品标题下，将步骤 3.5.5 中拟合的每个校准峰分别指定为其已知的分子质量：86、172、258 和 344 kDa。</li>
		<li>验证校准曲线的 R2 接近 1.0，且最大质量误差（MME）小于 2%。</li>
		<li>点击 &#34;确认校准&#34;，并保存校准曲线文件（.mc）。 
		注意：质谱光度计应每小时重新校准一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在低盐和高盐条件下分析重组 SLFN14Myc-Flag 蛋白。
	<ol>
		<li>使用低盐脱盐缓冲液制备 50 μL 的 50 nM 重组 SLFN14Myc-Flag 蛋白溶液（见步骤 2.2.9），用于生理盐浓度条件下的常规样品分析；或使用高盐脱盐缓冲液制备，用于无辅基蛋白样品的表征。</li>
		<li>将 50 nM 重组 SLFN14Myc-Flag 蛋白混合物在 20–25 °C 下以 21,300 × g 离心 10 分钟，以去除可能存在的蛋白聚集体和灰尘。</li>
		<li>在横向控制模式下，点击 AcquireMP 软件中的 &#34;下一孔&#34; 按钮。</li>
		<li>向孔中加入 10 μL 经 0.22 μm 滤膜过滤的低盐或高盐脱盐缓冲液，并关闭盖子。 
		注意：此步骤中使用的过滤缓冲液必须与步骤 3.6.1 中用于制备 SLFN14Myc-Flag 样品稀释液的缓冲液相匹配。</li>
		<li>在“寻找焦面”模式下，点击 &#34;液滴稀释&#34; 以确定新样品孔的正确焦面位置。</li>
		<li>将步骤 3.6.2 中得到的 10 μL 50 nM 重组 SLFN14Myc-Flag 蛋白溶液加入缓冲液液滴中，并轻轻吹打混合样品。</li>
		<li>关闭盖子，并确保仪器设置处于步骤 3.4.8 所述的最佳状态。</li>
		<li>点击 AcquireMP 软件中的 &#34;记录&#34; 按钮，录制一段 60 秒的视频。 
		注意：最佳质量分辨率来自一段约有 1,000–4,000 总计数的 60 秒视频。</li>
		<li>将结果文件（.mpr）以具有描述性的标题和时间戳命名并保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算重组 SLFN14Myc-Flag 蛋白的分子质量和化学计量比。
	<ol>
		<li>在 DiscoverMP 软件的“测量”选项下，点击 &#34;+ 打开&#34; 按钮，选择步骤 3.6.9 中的结果文件。</li>
		<li>在“校准”选项下，双击步骤 3.5.9 中创建的校准曲线文件以应用校准。</li>
		<li>通过将光标拖过每个峰，手动为每个观察到的 SLFN14Myc-Flag 物种定义高斯曲线，以获得计算的分子质量值。</li>
		<li>根据三次独立测量结果，计算每种寡聚体物种的平均分子质量及其对应的标准偏差。</li>
		<li>通过将计算得到的平均分子质量与 SLFN14Myc-Flag 单体的理论质量值的整数倍进行比较，确定重组 SLFN14Myc-Flag 蛋白的化学计量比。 
		注意：SLFN14Myc-Flag 单体的理论质量为 107.5 kDa，二聚体为 215 kDa，三聚体为 322.5 kDa，四聚体为 430 kDa。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Liao, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rbpworld+for+exploring+functions+and+disease+associations+of+rna-binding+proteins+across+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rbpworld for exploring functions and disease associations of rna-binding proteins across species.</a> Nucleic Acids Res. 53 (D1), D220-D232 (2025).</li>
<li>Gebauer, F., Schwarzl, T., Valcarcel, J., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rna-binding+proteins+in+human+genetic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Rna-binding proteins in human genetic disease.</a> Nat Rev Genet. 22 (3), 185-198 (2021).</li>
<li>Poodts, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+expression+of+sars-cov-2+spike+rbd+using+the+insect+cell-baculovirus+system%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Improved expression of sars-cov-2 spike rbd using the insect cell-baculovirus system.</a> Viruses. 14 (12), (2022).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该蛋白质生产方案的性能和多功能性依赖于多个关键步骤。为了最大化重组蛋白的产量，我们采用HEK293细胞，因其对外源质粒DNA具有高效的摄取能力，并可在悬浮培养中达到较高的细胞密度，从而充分利用培养基体积23。在本大规模转基因递送方案中使用PEI转染试剂，因其与其他常用试剂相比，能够在相对较低的成本下实现较高的转染效率17。转染后的细胞仅短时间孵育，以促进重组蛋白的过表达，同时限制核酸酶固有的细胞毒性效应。当过表达的重组基因引发严重细胞毒性甚至细胞死亡时，将转染后的孵育时间从48小时缩短至24小时可能更为有利。在蛋白酶抑制剂存在条件下快速进行细胞裂解、裂解液澄清及蛋白捕获，可最大限度减少重组蛋白的降解。然而，对于蛋白酶敏感性蛋白，上述各步骤的孵育时间可缩短一半。为提高样品纯度，采用特异性抗Flag抗体进行样品纯化。在任何溶剂可及的末端或内部环区插入八氨基酸残基的Flag序列，可为多种不同蛋白提供一种通用的蛋白捕获策略。为进一步提升样品纯度以满足定量生物化学研究（如酶动力学）的需求，可将低分辨率脱盐柱替换为高分辨率分析型尺寸排阻色谱柱，或利用上游...

SLFN14（Schlafen 14）是一种研究尚不充分的核糖核酸酶，也是一种哺乳动物宿主限制性因子1,2,3。人类SLFN14蛋白属于由六个成员组成的SLFN基因调控因子家族，在免疫、抗病毒活性、化学敏感性以及细胞分化过程中发挥重要作用4,5,6,7,8。目前对SLFN基因调控因子作用机制的理解仍不完整；然而，许多家族成员具有核糖核酸酶活性，这对翻译调控至关重要7,9。SLFN核糖核酸酶通过蛋白同源二聚化被激活，形成一个复合的RNA结合裂隙，能够有效切割底物RNA10,11。为了防止细胞内发生非特异性RNA切割，大多数SLFN核糖核酸酶主要以单体形式存在，并依赖各家族成员特异的分子信号来激活5,7,11,12。
人源SLFN14的重组表达使得对该核糖核酸酶的全面分子研究成为可能，为深入理解其功能与调控机制提供了新的见解2,13,14纯化的重组SLFN14蛋白已加速了其结构依赖性tRNA切割活性的表征研究 体外 RNA切割实验2,14冷冻电子显微镜（cryoEM）对纯化的SLFN14蛋白的研究也揭示了SLFN14同源二聚体的结构，其中双链RNA结合于中央裂隙中2,13,14SLFN14的高级组装&#160;进一步通过质谱光度法（mass photometry）进行表征，这是一种用于测量分子质量的单分子技术。出乎意料的是，这种高灵敏度技术表明，SLFN14主要形成一种耐盐的同源二聚体，但也可形成一种功能未知的盐敏感型同源四聚体。2,13,14综上所述，获得纯化的人源SLFN14蛋白是一项关键性里程碑，为深入理解SLFN14介导的翻译调控机制提供了早期分子层面的洞察，必将推动该领域研究进入一个令人期待的新阶段。
重组SLFN14核糖核酸酶在历史上一直难以通过标准的蛋白质生产策略获得。最初描述SLFN14酶活性的研究报告指出，其产量低、稳定性差且溶解度低1。人类SLFN14蛋白具有长多肽链、显著的疏水性以及依赖核糖核酸酶的细胞毒性，这些特性共同极大地阻碍了常规细菌表达系统的应用1,13,14。然而，复杂的真核翻译机制和分子伴侣系统提供了一种强有力的替代方案，可高效表达全长的人类SLFN14蛋白15。杆状病毒-昆虫细胞表达系统和哺乳动物表达系统均已被用于制备适用于冷冻电镜（cryoEM）研究和生物化学检测的全长人类SLFN14蛋白2,13,14。然而，在某些情况下，来源于昆虫细胞的SLFN14蛋白需要引入稳定突变以防止样品聚集2。此外，杆状病毒介导的基因递送需要大量工作投入，并且耗时较长，可能延缓研究进展15,16。相比之下，从哺乳动物表达宿主中分离获得的重组SLFN14蛋白具有速度快的优势，并且在样品优化过程中无需进行蛋白质工程改造。
本方法旨在提供一种相对快速且操作简便的途径，用于制备适用于下游分子研究的重组野生型SLFN14蛋白。采用哺乳动物细胞可提供接近天然的环境，从而维持蛋白的正确折叠，无需对SLFN14蛋白进行工程化改造13。与病毒载体策略相比，基于化学法的基因递送方法还可将蛋白制备周期从数月缩短至数天15。为抵消哺乳动物细胞培养相对较高的成本，本方法采用了经济高效的聚乙烯亚胺（PEI）转染试剂，并使用悬浮培养的转染效率高的人胚肾293（HEK293）细胞17,18。为在样品处理过程中最大限度减少蛋白损失，该流程还采用了低样品消耗策略，用于SLFN14蛋白的纯化及样品质量控制的化学计量分析。本四天实验方案详细说明了以下操作步骤：1）在HEK293细胞中进行瞬时基因表达；2）使用离心柱的两步层析纯化流程；3）通过质量光度法测定蛋白的化学计量比。本方法最终获得的产物为带有双C端Myc-Flag标签的野生型人SLFN14蛋白（SLFN14Myc-Flag），可用于后续的冷冻电镜研究及定性生化表征13。该方法具有良好的通用性，可推广应用于其他研究尚不充分的人源RNA结合蛋白的分离与表征，特别是那些在异源表达系统中通常难以过表达的大分子量且具有细胞毒性的核糖核酸酶基因。因此，本方案降低了对人类蛋白质组进行全面分子表征的技术门槛。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇 (b-Me)</td><td>Sigma</td><td>M3148-500ML</td><td>14.3 M 储存液</td></tr><tr><td>AcquireMP 2024 R2</td><td>Refeyn</td><td>/</td><td>数据采集软件</td></tr><tr><td>腺苷-5'-三磷酸二钠盐三水合物 (ATP)</td><td>Chem-Impex International</td><td>00015-100G</td><td>调节溶液至 pH 7.0</td></tr><tr><td>抗Flag M2亲和凝胶</td><td>Millipore</td><td>A2220</td><td>抗Flag亲和树脂</td></tr><tr><td>盐酸苄脒水合物</td><td>Sigma</td><td>B6506-25G</td><td>蛋白酶抑制剂</td></tr><tr><td>广谱蛋白标准品 (10-250 kDa)</td><td>Bio-Rad</td><td>P7719S</td><td>预染蛋白标准品</td></tr><tr><td>Countess 3</td><td>Invitrogen</td><td>A49862</td><td>自动细胞计数仪</td></tr><tr><td>DiscoverMP v2024 R2</td><td>Refeyn</td><td>/</td><td>数据分析软件</td></tr><tr><td>杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>1x 储存液</td></tr><tr><td>DYKDDDDK 肽</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A36805</td><td>3xFlag 肽</td></tr><tr><td>FreeStyle 293-F 细胞</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R79007</td><td>哺乳动物悬浮细胞</td></tr><tr><td>Geniust M 核酸酶 DMF 版本</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-391121B</td><td>通用核酸酶</td></tr><tr><td>HyClone CDM4HEK293 培养基</td><td>Cytiva</td><td>SH3085802</td><td>无血清生长培养基</td></tr><tr><td>HyClone SFM4Transfx-293 培养基</td><td>Cytiva</td><td>SH3086002</td><td>瞬时转染培养基</td></tr><tr><td>Immersol 518F</td><td>Zeiss</td><td>4Y00-R0DY-1007-3BF3</td><td>浸油</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>3032-02</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli 样品缓冲液</td><td>Bio-Rad</td><td>1610737</td><td>2x 储存液</td></tr><tr><td>亮抑酶肽</td><td>VWR</td><td>J580-25MG</td><td>蛋白酶抑制剂</td></tr><tr><td>氯化镁六水合物 (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>MassFerence P1&amp;nbsp;</td><td>Refeyn</td><td>MP-CON-41033</td><td>500x 校准品储存液</td></tr><tr><td>MassGlass UC 样品制备试剂盒</td><td>Refeyn</td><td>MP-CON-21022</td><td>载玻片和垫圈</td></tr><tr><td>微型 Bio-Spin 柱</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204</td><td>空的聚丙烯离心柱</td></tr><tr><td>Milli-Q IQ 7000 系统</td><td>Millipore</td><td>ZIQ7000T0C</td><td>Ⅰ型超纯水</td></tr><tr><td>Mini-Protean TGX 免染凝胶</td><td>Bio-Rad</td><td>4568086</td><td>4-15% SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Minitron 带湿度、冷却和 CO2 控制</td><td>Infors</td><td>72175</td><td>培养摇床</td></tr><tr><td>MP 校准工具包</td><td>Refeyn</td><td>MP-CON-21019</td><td>校准工具、软头镊子、磁铁</td></tr><tr><td>纳米光度计</td><td>Implen</td><td>NP80</td><td>紫外-可见分光光度计</td></tr><tr><td>旋转混合器</td><td>Clay Adams Brand</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>抑肽酶 A</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-45036B</td><td>蛋白酶抑制剂</td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟 (PMSF)</td><td>Research Products International</td><td>P20270-25.0</td><td>蛋白酶抑制剂</td></tr><tr><td>聚碳酸酯摇瓶&amp;nbsp;</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>WPFBC1000S</td><td>带通气孔和挡板的烧瓶</td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺 (PEI) 分子量 40,000</td><td>Polysciences</td><td>24765</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>Qubit 4 荧光计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>Qubit RNA 高灵敏度检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32852</td><td>使用RNA特异性染料进行定量</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6065</td><td>Coomassie G-250</td></tr><tr><td>SLFN14 表达质粒 DNA</td><td>Origene</td><td>RC226257</td><td>人源带标签ORF克隆</td></tr><tr><td>氯化钠 (NaCl)</td><td>Millipore</td><td>1.37017</td><td></td></tr><tr><td>Tris, pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J60202.K2</td><td>1 M 缓冲液储存液</td></tr><tr><td>三(2-羧乙基)膦盐酸盐 (TCEP)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>TCEP10</td><td>TCEP</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>VWR</td><td>M143-1L</td><td>去垢剂</td></tr><tr><td>台盼蓝染色液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td>0.4% 储存液</td></tr><tr><td>吐温 20</td><td>VWR</td><td>0777-1L</td><td>去垢剂</td></tr><tr><td>TwoMP</td><td>Refeyn</td><td>MP-PRO-00001</td><td>质谱光度计</td></tr><tr><td>Zeba 40K 脱盐柱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A57759</td><td>尺寸排阻色谱</td></tr></tbody></table>

重组人slfn14核糖核酸酶的快速制备及通过质量光度法进行化学计量分析

Rapid Production of Recombinant Human SLFN14 Ribonuclease and Stoichiometric Analysis by Mass Photometry

核糖核酸酶是一类特异性的RNA结合蛋白，能够催化RNA的切割，并参与包括基因调控在内的多种生物学过程。然而，由于重组蛋白表达存在挑战，许多人类核糖核酸酶的结构、功能及调控机制仍缺乏充分表征。本方法介绍了一种高效的技术流程，用于人源SLFN14（SLFN14）核糖核酸酶的瞬时表达、纯化及化学计量分析。在HEK293悬浮细胞中表达带有Flag标签的重组SLFN14蛋白，并采用快速的两步纯化流程进行分离：首先通过抗Flag亲和层析，随后进行低分辨率的尺寸排阻层析。质量光度法（mass photometry）是一种高灵敏度的单分子检测技术，结果显示，在生理盐浓度条件下，SLFN14与细胞内RNA结合形成稳定的同源二聚体；而在高盐条件下，RNA发生解离，但同源二聚体结构仍得以维持。所获得的重组人源SLFN14蛋白适用于后续的结构研究及定性生化分析。该快速制备重组人源蛋白并进行样品表征的方法，可广泛应用于其他哺乳动物核糖核酸酶及RNA结合蛋白的制备，适用于生物物理与生化特性分析。

用于瞬时表达全长重组人SLFN14Myc-Flag蛋白的哺乳动物载体如图1所示。一个两步纯化流程展示了从HEK293细胞中分离SLFN14Myc-Flag蛋白的过程（图2A）。一个具有代表性的成功变性凝胶电泳结果展示了纯化后的SLFN14Myc-Flag蛋白（图2B）。亲和层析步骤依赖于SLFN14蛋白C端Flag标签与偶联了抗Flag抗体的树脂之间特异性的高亲和力相互作用，从而实现大部分样品的纯化。随后的尺寸排阻层析步骤则去除了用于从抗Flag亲和树脂上洗脱SLFN14Myc-Flag蛋白时过量使用的3xFlag肽，并将重组蛋白保存在适用于质量光度测定的储存缓冲液中。通过具有高质量参数（包括R2值为1.00，MME为0.3%）的校准曲线计算出纯化后SLFN14Myc-Flag蛋白的分子质量（<strong class="xfig...

本方案描述了重组人SLFN14核糖核酸酶的制备及其通过质量光度法进行的化学计量分析。

重组人SLFN14核糖核酸酶的快速制备及通过质量光度法进行化学计量分析

核糖核酸酶是一类特化的RNA结合蛋白，可催化RNA切割，并参与包括基因调控在内的多种生物学过程

我们的研究计划旨在表征在真核基因调控中功能尚不明确的核糖核酸酶的作用及其调控机制。由于真核核糖核酸酶结构复杂且具有细胞毒性，其重组表达通常具有挑战性。本快速实验方案利用哺乳动物细胞系来克服这些限制。首先，接种哺乳动物HEK293悬浮细胞，并在37摄氏度下孵育。使用台盼蓝染色液和细胞计数仪，确认细胞密度为每毫升120万至180万个细胞，且细胞活力高于90%。在锥形管中，加入320微克编码重组SLFN14 Myc-FLAG基因的纯化质粒DNA至8毫升无血清转染培养基中，于20至25摄氏度孵育5分钟。同时，在另一管中，将960微克经0.22微米滤器过滤除菌的PEI加入8毫升无血清转染培养基中。现在，将PEI混合物逐滴缓慢加入重组质粒DNA溶液中，在20至25摄氏度下孵育15分钟。接着，将16毫升DNA/PEI混合物逐滴缓慢加入已准备好的细胞中。将细胞在37摄氏度下孵育48小时。然后，将40毫升转染后的细胞分装到八个锥形管中。在20至25摄氏度下，以400×g离心5分钟，收集转染后的细胞。将每个转染细胞沉淀用225微升预冷的重悬缓冲液重悬，四个沉淀共重悬至总体积900微升。将重悬的细胞转移至预冷在冰上的2毫升微量离心管中。在4°C下，将微量离心管水平放置于摇床中孵育30分钟。随后，在4°C下以21,300×g离心20分钟，澄清细胞裂解液。将澄清的裂解液与已平衡的抗-Flag树脂在微量离心管中混合，置于4°C水平摇床上孵育60分钟。在4°C下以8,000g离心2分钟，使树脂沉淀。小心弃去约700微升上清液，避免扰动树脂沉淀。现在，重悬剩余的树脂上清液混合物，并将其转移至插入2毫升微量离心管中的空的800微升容量离心柱中。在4摄氏度下，以1000g离心2分钟。弃去穿流液后，用500微升高盐洗涤缓冲液冲洗之前使用的微量离心管，并将冲洗液转移至离心柱中。将离心柱在4°C、1000g条件下离心两分钟，并弃去穿流液。然后，向离心柱中加入500 µL高盐洗涤缓冲液，在4°C、1000g条件下再次离心两分钟。经过总共四次洗涤后，直接在树脂上加入 55 微升 3X FLAG 洗脱缓冲液。将离心柱垂直放置于摇床中，在 4 摄氏度下孵育 60 分钟。按照之前所示方法离心离心柱，以收集洗脱的重组 SLFN14 Myc-FLAG 蛋白。将100微升混合的抗Flag树脂洗脱液加入离心脱盐柱床中央，注意不要破坏树脂。在4°C下以700 × g离心2分钟，洗脱重组SLFN14 Myc-FLAG蛋白。使用微体积分光光度计，测定2微升回收的重组蛋白在260纳米和280纳米处的吸光度。向质量光度计的空孔中加入 10 微升经 0.22 微米滤膜过滤的低盐或高盐脱盐缓冲液，并盖上盖子。在“查找焦面”模式下，于 AcquireMP 软件中点击液滴稀释功能，以确定样品孔的正确焦面位置。然后向缓冲液液滴中加入 1

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

快速制备重组人类SLFN14核糖核酸酶及通过质质光度计量分析

本文描述了一种涉及FRET（福斯特共振能量转移）信号定量分析的新方法，用于研究酶动力学。通过该方法获得了SENP1（SUMO/Sentrin特异性蛋白酶1）催化结构域对pre-SUMO1（小泛素样修饰蛋白1）水解反应的KM和kcat值。这种基于定量FRET的蛋白酶动力学研究的一般原理可应用于其他蛋白酶的研究。...

定量FRET（Förster共振能量转移）分析用于SENP1蛋白酶动力学测定

总细胞RNA作为研究RNA合成与降解的短期变化以及RNA加工动力学的模板效果较差。本文介绍了一种利用4-硫代尿苷对新转录RNA进行代谢标记，随后通过巯基特异性生物素化并纯化新转录RNA的方法，从而克服上述局限性。...

细胞培养中新生转录RNA的代谢标记：用于高分辨率RNA合成、加工与降解的基因表达谱分析

外切核酸酶在维持基因组稳定性方面发挥着关键作用。WRN外切核酸酶功能的缺失会导致早衰。研究该核酸酶的底物及其他需求因素 体外 有助于阐明其作用...

一种基于荧光的外切酶检测方法用于表征人类早衰相关WRN外切酶的果蝇同源蛋白DmWRNexo及其在其他核酸酶中的应用

本方案介绍了如何在复杂的生物样品中使用选择反应监测技术对目标蛋白质进行绝对定量分析。该方法已用于准确量化小鼠巨噬细胞趋化信号通路中的蛋白质。文中详细描述了目标肽段的选择、检测方法的建立，以及定性和定量分析过程。...

选择性反应监测质谱法用于蛋白质绝对定量

本方案描述了染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、4-硫代尿苷测序（4sU-seq）、总RNA测序（total...

转录因子结合、转录、翻译及降解的实时分析以展示细胞激活过程中的全局事件

我们介绍了一种用于产生和扩增基因修饰的呼吸道合胞病毒（RSV）的方法，以及一种优化的RSV蚀斑检测法。我们通过构建两种重组病毒来演示该方案，这两种病毒分别可用于定量检测RSV的复制以及活体分析RSV包涵体及其相关颗粒的动态过程。...

重组呼吸道合胞病毒的制备、扩增与滴定

本文介绍了一种基于液相色谱-质谱（LC-MS）的测序方法的详细实验方案，该方法可作为直接测序短链RNA（&lt;35...

2D-HELS MS Seq：一种基于液相色谱-质谱的通用方法，用于直接从头测序含不同核苷酸修饰的RNA混合物

单分子荧光能量转移是一种用于追踪核糖体蛋白质合成过程中tRNA动态变化的方法。通过追踪单个核糖体，可以识别出非均质的群体，从而揭示其作用机制。该方法也可广泛用于追踪生物分子的构象变化，以阐明多种复杂生物系统中动态特性与功能之间的关系。单分子方法能够观测到传统系综方法因平均效应而无法捕捉的非限速步骤以及低丰度的关键中间态。...

单分子荧光能量转移研究核糖体蛋白质合成

本文演示了一种使用限域撞击射流（CIJ）混合器技术合成脂质纳米颗粒（LNPs）的详细方案，其中包括双射流CIJ和四射流多入口涡流混合器（µMIVM）。CIJ混合器可产生可重复的湍流微混合环境，从而制备出单一分散的LNPs。...

在受限撞击射流混合器中通过湍流合成脂质纳米颗粒

我们介绍一种改进的“使用重组元件进行蛋白质合成”（PURE）系统及无细胞蛋白合成用粗制核糖体的OnePot制备方案，重点在于通过控制细胞生长来最小化批次间的差异。...

优化一次性PURE与粗提核糖体的制备以实现可重复的无细胞蛋白质合成

本方案描述了从大肠杆菌（Escherichia...

重组表达与纯化疏水蛋白SC16 大肠杆菌 及其自组装过程的荧光检测监测

了解利用哺乳动物细胞系快速制备重组人类SLFN14核糖核酸酶的方法，并通过质质光度计量分析其化学计量比。该技术有助于深入研究真核生物基因调控中的核糖核酸酶功能。

重组人SLFN14核糖核酸酶的快速制备及通过质量光度法进行化学计量分析

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