在小鼠肝纤维化模型中绘制肝星状细胞形态

本方案介绍了一种全面的成像流程，用于在完整肝组织中可视化并建模肝星状细胞的形态。现有的二维成像技术无法完整呈现星状细胞的形态，限制了对细胞结构与功能的深入理解。本方案能够稳健地捕获复杂的三维结构。

首先，捏压麻醉后小鼠的掌心以确认麻醉效果充分。用70%乙醇喷洒腹部，使毛发湿润。用镊子夹起与后肢对齐的腹部中线处皮肤，开始剪开皮肤以暴露腹腔。

然后用 PBS 湿润的棉签将肠道和其他器官移至一侧，并抬起左叶。仔细剪断左叶与尾状叶之间相连的膜。然后用缝线在左叶顶部基部进行结扎。

在缝合结下方切除左叶，并将其留出用于组织样本的采集和处理。使用经PBS润湿的棉签移动肝脏，暴露门静脉。然后在门静脉约中点处小心地插入导管针。

移除导管针。确保有血液回流通过导管，以表明插入成功。将运行中的灌注泵连接的已充满液体的管路连接到导管，并用 20 毫升 PBS 灌注肝脏。

用止血钳夹闭肝脏上方的肺动脉，以阻止 PBS 流经心脏。剪开下腔静脉以释放积聚的压力。将泵速调节至每分钟 5 毫升。

15分钟后，停止泵流，将储液器更换为4%多聚甲醛，然后用25毫升4%多聚甲醛灌注肝脏。灌注完成后，剪除连接组织，将肝脏从周围器官中取出。将肝脏置于装有25毫升4%多聚甲醛的50毫升锥形管中。

将试管置于4°C冷室中，以每分钟1.5转的速度在水平摇床上过夜孵育。次日，在室温下以每分钟1.5转的速度，于水平摇床上用PBS洗涤肝脏三次，每次30分钟。将肝脏转移至含0.02%叠氮化钠的20毫升PBS中，于4°C保存。

将肝组织样本切成约0.5至1立方厘米大小的组织块。将肝组织样本转移至带螺旋盖的玻璃小瓶中。在室温下，使用20%至80%的水稀释甲醇系列溶液，在转轮摇床上以每分钟8转的速度依次脱水，每个浓度处理1小时。

完成样本漂白、通透、免疫标记和透明化处理后，将样本在室温下置于二苄基醚中孵育过夜，再进行成像。样本可在二苄基醚中保存长达一年，染色信号不会损失。进行共聚焦成像时，将透明化后的样本置于带有1.5号玻璃底的35毫米玻璃底培养皿中。

用肉桂酸乙酯充满培养皿，使样本完全浸没。然后将培养皿置于共聚焦显微镜的载物台上。在最亮的焦平面上获取拼接图像，以覆盖样本的较大区域，采用1024 × 1024的分辨率和600的扫描速度。

根据图块图像，选择感兴趣区域以采集更高分辨率的Z轴扫描图像。接下来，使用显微镜支持的最高分辨率，以1024×1024的格式和600的扫描速度，获取贯穿透明化组织全深度的Z轴层扫图像。成功灌注并固定的实验小鼠肝脏呈现出均匀的浅米黄色。

灌注不当会导致血栓形成暗红色或棕色区域，降低组织光学透明度，并使这些区域产生较高的背景信号。在二苄基醚中孵育后，组织达到完全光学透明，与透明前相比，组织呈现清晰状态。高分辨率Z轴层扫图像显示，单个肝星状细胞胞体延伸出精细的树突状突起。

对照组和慢性四氯化碳肝损伤样本在共聚焦显微镜下均显示出强而稳定的荧光信号。该流程可重复地描绘出复杂微环境中星状细胞的形态，捕捉到树突状突起及其与邻近细胞的空间关系。在执行该实验方案时，所需时间投入是一个重要的考虑因素。

透明化过程大约需要三周时间，因此需要提前规划。该平台能够实现精确的三维形态计量分析，将成纤维细胞的结构与功能相关联，从而加深对组织稳态及一种Z机制的理解。