Name: 肝纤维化小鼠模型中肝星状细胞形态的映射 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: 了解利用荧光标记、组织透明化和共聚焦显微镜技术，在小鼠完整肝脏组织中实现肝星状细胞三维形态重建的高分辨率成像方法。该流程支持纤维化疾病中细胞结构与功能关系的研究。

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本研究由 1R01 DK136016-01 和 5P30CA196521（NCI 中心资助）资助。显微成像和/或图像分析在西奈山伊坎医学院的显微成像与先进生物成像核心设施（Microscopy and Advanced Bioimaging CoRE）完成。本研究部分得到西奈山蒂施癌症研究所（Tisch Cancer Institute at Mount Sinai）的支持，资助编号为 P30 CA196521 — 癌症中心支持资助。

本研究中使用的所有小鼠实验均已获得西奈山医学院机构动物护理和使用委员会的批准。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 生成带有 tdTomato (TdT) 标记的造血干细胞（HSC）的小鼠
<ol>
	<li>建立 Tg(lox-stop-lox-TdTomato) 与 Tg(Lrat:Cre) 繁殖鼠（Jackson Laboratories 品系编号 #007914）20 和突变小鼠资源 &amp;#38; 研究中心（MMRRC）品系 #06959521-JAX，分别）。 
	注意：预计3周后产仔。应使用LratCre雌性小鼠进行育种，因已在雄性生殖系中检测到部分Cre表达。</li>
	<li>收集尾巴组织并对F1代小鼠进行基因型鉴定，以筛选出在肝星状细胞中特异性表达TdTomato荧光蛋白的Tg(Lrat:Cre);Tg(LSL-TdT)小鼠。</li>
</ol>
2. 原位 肝脏灌注与固定
<ol>
	<li>术前准备
	<ol>
		<li>通过混合 2 mL 氯胺酮、1 mL 赛拉嗪和 7 mL 水制备用于小鼠麻醉的氯胺酮/赛拉嗪混合液。 
		注意：氯胺酮为管制药品，实验室使用需具备相应许可和合规管理。</li>
		<li>制备含 4% 多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（1× PBS）灌注溶液。</li>
		<li>启动蠕动泵，使 1× PBS 流经管道，并将流速设定为 2 mL/min。 
		注意：确保管道中无气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>称量小鼠体重，以确定所需注射的氯胺酮/赛拉嗪混合液体积。</li>
	<li>将氯胺酮/赛拉嗪混合液经腹腔注射至小鼠体内。 
	注意：每 20 g 小鼠体重注射 200 µL 混合液。</li>
	<li>将小鼠放入带盖容器中，静置约 20 分钟，直至完全麻醉。 
	注意：轻捏小鼠脚趾以检查反射是否消失。开始灌注前需确认小鼠仍有生命体征。</li>
	<li>将小鼠从玻璃容器转移至手术平台，呈仰卧位。 
	警告：PFA 具有毒性和挥发性，因此灌注操作必须在化学通风橱内进行。根据机构生物安全指南，妥善收集并处理废液中的 PFA。</li>
	<li>用镊子夹住小鼠足掌，确认小鼠无任何反射或痉挛性动作。</li>
	<li>用针刺穿四个足掌，以固定小鼠腹部。</li>
	<li>用 70% 乙醇喷洒腹部，润湿毛发。</li>
	<li>用镊子夹起腹部中线处皮肤，对齐后肢，开始切开皮肤（双层）以暴露腹腔。</li>
	<li>使用 PBS 湿润的棉签将肠道及其他器官拨至一侧，并抬起左叶。</li>
	<li>小心剪开左叶与尾状叶之间相连的膜组织。</li>
	<li>使用缝线在左叶基部顶端结扎。</li>
	<li>在缝线结下方剪下左叶，并根据实验需求将其保留用于组织取样和处理（例如直接在液氮中速冻、包埋于光学切割温度（OCT）包埋剂中，或进行福尔马林固定）。</li>
	<li>使用 PBS 湿润的棉签移动肝脏，暴露门静脉。</li>
	<li>将导管针小心插入门静脉，位置约为门静脉长度的中段。 
	注意：为辅助导管插入，可在小鼠体下放置镊子以抬高身体，确保操作面更平坦。插入前应尽量使导管针与门静脉走向平行。</li>
	<li>撤出导管针。 
	注意：应观察到血液自导管回流，以确认插入成功。</li>
	<li>启动蠕动泵，设定流速为 2 mL/min，连接导管与管道，用 20 mL 1× PBS 对肝脏进行灌注。 
	注意：连接前需确保导管内完全充满血液，管道内完全充满灌注缓冲液，以杜绝任何气泡进入系统。</li>
	<li>使用止血钳夹闭肝脏上方的肺动脉，防止 1× PBS 流经心脏。</li>
	<li>剪开下腔静脉以释放压力积聚。</li>
	<li>将泵速调整至 5 mL/min。 
	注意：灌注过程约需 15 分钟完成。</li>
	<li>停止泵运行，更换储液瓶为 4% PFA 溶液。 
	注意：更换时储液瓶内应保留一定液体，停泵操作可避免管道中引入气泡。</li>
	<li>用 25 mL 4% PFA 对肝脏进行灌注。</li>
	<li>灌注完成后，剪断连接组织，将肝脏从周围器官中取出。</li>
	<li>将肝脏置于装有 25 mL 4% PFA 的 50 mL 锥形管中。</li>
	<li>将锥形管水平放置于摇床上，在&#160;4 °C、1.5 rpm 条件下过夜，以确保溶液充分流动。</li>
	<li>在摇床上用 1× PBS 室温洗涤肝脏 3 次，每次 30 分钟，转速为 1.5 rpm。</li>
	<li>将肝脏保存于含 0.02% NaN3 的 20 mL 1× PBS 中，4 °C 保存。 
	注意：此阶段可长期保存肝脏组织，至少可保存一年。</li>
</ol>
3. 基于iDISCO+的组织透明化
注意：iDISCO+ 方案的原始描述可参见文献17
第1天：样品脱水
<ol>
	<li>将肝组织样本切成大小约为 0.5–1 cm 的小块3. 
	注意：将不同的样品切割成不同形状，以便在成像步骤中更容易识别。</li>
	<li>在不同的玻璃瓶中，分别用蒸馏水配制20%（体积/体积）、40%、60%和80%的甲醇稀释液。</li>
	<li>将肝组织样本放入带螺旋盖的玻璃小瓶中（例如，4-7 mL）。 
	注意：将最多6块肝组织样本放入一个7 mL玻璃小瓶中。</li>
	<li>使用甲醇稀释法对样品进行脱水2O系列，分别在室温下以20%（体积比）、40%、60%和80%浓度各孵育1小时，置于8 rpm的旋转摇床上，不进行离心。</li>
	<li>在室温下，将样品置于轮转混合仪上，以8 rpm转速用另一份100%甲醇洗涤1小时，期间不进行离心。</li>
	<li>将样品在 4 °C 下冷却 30 分钟至 1 小时。</li>
	<li>在玻璃瓶中用甲醇配制66%（体积比）的二氯甲烷稀释液。 
	注意：每次均需新鲜配制稀释液。配制溶液时使用玻璃量筒，因为二氯甲烷（DCM）可溶解塑料（如聚苯乙烯）。</li>
	<li>在室温下，将样品置于66%二氯甲烷/甲醇溶液中，以8 rpm的速度在旋转轮上孵育过夜，期间不进行离心。 
	注意：加入溶液后，需防止样品浮至顶部。</li>
</ol>
第2天：样品漂白
<ol start="9">
	<li>在室温下，将样品置于轮式旋转器上，以 8 rpm 的速度用 100% 甲醇洗涤两次，每次 1 小时，期间不进行离心。</li>
	<li>将样品在 4 °C 下冷却 30 分钟至 1 小时。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，将样品置于预冷的甲醇中含 5% H2O2 的溶液（1 体积 30% H2O2 加 5 体积甲醇）中，在轮式旋转器上以 8 rpm 的速度避光处理过夜，期间不进行离心。 
	注意：每次均需新鲜配制该溶液。</li>
</ol>
第3-5天：样品透化
<ol start="12">
	<li>用甲醇/H2O系列溶液重水化：依次使用80%、60%、40%、20%甲醇溶液及1× PBS，在室温下以8 rpm转速于旋转摇床孵育1小时，期间不进行离心。</li>
	<li>用PTx.2溶液（表1）在室温下以8 rpm转速于旋转摇床洗涤样本两次，每次1小时，期间不进行离心。</li>
	<li>将样本在通透化溶液（表1）中于37 °C孵育2天。</li>
</ol>
第5-17天：免疫标记
<ol start="15">
	<li>将样本置于封闭液（表1）中，37 °C 条件下封闭2天。 
	注意：由于驴血清不稳定，每次均需新鲜配制封闭液。剩余封闭液可于4 °C&#160;保存最多1个月。</li>
	<li>将样本置于含5% DMSO和3%驴血清的PTwH缓冲液（表1）中，加入一抗稀释液，在37 °C、5 rpm的旋转仪上孵育4天，过程中不进行离心。 
	注意：建议一抗起始稀释比例为1:500。</li>
	<li>用PTwH缓冲液在室温下于8 rpm旋转仪上清洗样本，每次1小时，共清洗4–5次，过程中不进行离心。 
	注意：可选择让样本过夜清洗。</li>
	<li>将样本置于含3%驴血清的PTwH缓冲液中，加入二抗和碘化丙啶稀释液，在37 °C、5 rpm的旋转仪上孵育4天，过程中不进行离心。 
	注意：建议二抗起始稀释比例为1:500。碘化丙啶使用5 mg/mL储备液稀释至1:250工作浓度。</li>
	<li>用PTwH缓冲液在室温下于8 rpm旋转仪上清洗样本，每次1小时，共清洗4–5次，过程中不进行离心。</li>
	<li>将样本继续在PTwH缓冲液中于室温、8 rpm旋转仪上过夜清洗，过程中不进行离心。</li>
</ol>
第18天：透明化
<ol start="21">
	<li>使用甲醇与水（H2O）按体积比稀释的系列溶液进行样品脱水：20%（vol/vol）、40%、60%、80%，每步在室温下以8 rpm转速于旋转仪上孵育1小时，不进行离心。</li>
	<li>用100%甲醇在室温下旋转孵育1小时，重复洗涤两次，转速为8 rpm，不进行离心。</li>
	<li>将样品在二氯甲烷（DCM）与甲醇按体积比66%（vol/vol）配制的溶液中，于室温下在8 rpm转速的旋转仪上孵育3小时，不进行离心。</li>
	<li>用100%二氯甲烷（DCM）在室温下于8 rpm转速的旋转仪上洗涤两次，每次15分钟，不进行离心。</li>
	<li>在成像前，将样品于室温下在DBE中孵育过夜。</li>
	<li>样品可在DBE中长期保存，最长可达1年，且不影响染色信号。</li>
</ol>
4. 共聚焦显微镜成像
<ol start="1">
	<li>将澄清的样品置于带有 #1.5 玻璃底的 35 mm 玻底培养皿中。</li>
	<li>用肉桂酸乙酯充满培养皿，完全浸没样品。</li>
	<li>将培养皿放置在共聚焦显微镜上，调节焦距以确定信号最强的最佳焦平面。</li>
	<li>在信号最强的平面上采集拼接图像，以覆盖样品的较大区域，使用 1024 × 1024 格式和 600 扫描速度。 
	注意：使用较低倍率物镜（10× 或 20×）进行拼接成像，以减少成像时间和文件大小。</li>
	<li>根据拼接图像，选择感兴趣区域以采集更高分辨率的 z 扫描图像。</li>
	<li>对澄清后的组织进行 z 扫描成像，覆盖组织的整个深度，采用显微镜所能达到的最佳分辨率，使用 1024 × 1024 格式和 600 扫描速度。 
	注意：使用 40× 油镜以获得造血干细胞（HSC）成像的最佳分辨率。</li>
	<li>以 LIF 格式保存图像文件，并使用 Fiji 或 ImarisViewer 11.0.0 查看文件。</li>
</ol>
5. 用于单个造血干细胞三维重建与定量分析的图像分析
<ol>
	<li>使用 ImarisFileConverter 10.2.0 将图像文件转换为 IMS 格式。</li>
	<li>在 Imaris 10.2.0 中使用表面模型（Surface model）检测图像中的目标物体。</li>
	<li>使用创建向导对选定的三维感兴趣区域执行分析，然后将其应用于整幅图像。 
	注意：使用此方法可加快分析过程。</li>
	<li>选择源通道、绝对强度，并取消勾选平滑按钮，以定义整幅图像的强度阈值。</li>
	<li>调整阈值以捕获图像中的所有目标物体。</li>
	<li>使用体素数量过滤掉碎片状物体。</li>
	<li>完成向导操作，按下统计按钮以获取所有统计测量结果。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了一种可重复且可调整的样品制备流程，可实现完整肝组织中造血干细胞（HSC）形态的三维可视化与定量分析。该流程整合了遗传性荧光细胞标记、 原位 肝脏灌注及改良的iDISCO+透明化方法可实现大体积组织的单细胞分辨率成像，同时保留肝脏微环境的空间结构。
该方法成功的关键步骤之一是高效的肝脏灌注。灌注不完全可能导致血液和脂质滞留，从而造成透明效果差以及自发荧光增强23,24,25。成功插入导管后，可见血液回流（图1A）。若无血液回流，应使用注射器将1×PBS注入导管接头，以避免灌注过程中气泡进入肝脏，否则会阻塞血管并妨碍肝脏进一步灌注。将导管插入门静脉过深、接近肝叶时，可能导致整个肝脏灌注不完全。将导管插入门静脉是一个技术难度较高的步骤，容易意外穿破静脉和/或周围组织。一旦发生穿刺损伤，应保持门静脉导管原位，并迅速在...

纤维化，即组织的病理性瘢痕形成，是几乎所有慢性器官疾病的最终共同通路，在工业化国家约40%的死亡中起重要作用1。在肝脏中，纤维化由慢性损伤引起，例如病毒性肝炎、酒精使用，或日益常见的代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD），后者目前影响美国30-40%的成年人。肝脏的慢性损伤及其导致的进行性纤维化显著增加了终末期肝病（如肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌）的风险2,3,4,5。
肝星状细胞（HSCs）在肝脏稳态和纤维化发生过程中起核心作用。在健康肝脏中，HSCs 处于静息状态，储存维生素 A，并参与肝细胞的稳态维持以及整个肝脏的正常功能6,7。HSC 耗竭实验明确证实了这一点：在健康肝脏中几乎完全去除 HSCs 会导致肝脏质量下降，并严重限制肝脏再生能力7,8。当肝脏受损时，HSCs 被激活转化为类似肌成纤维细胞的细胞，这些细胞增殖、迁移至损伤区域，并过度产生细胞外基质（ECM），形成纤维化瘢痕。在纤维化肝脏中，活化的 HSCs 还是癌症相关成纤维细胞的来源，并在肝细胞癌中发挥促肿瘤作用9,10,11,12。静息状态的 HSCs 具有一种独特的类似神经元的形态，其细胞体较小，并延伸出长距离的突起。在纤维化过程中 HSCs 被激活后，会转变为扁平、片状的肌成纤维细胞形态13。尽管数十年的研究已阐明调控 HSCs 产生 ECM 的信号通路，但其独特神经元样形态的功能意义、该形态的调控机制、是否有助于 HSC 微环境中细胞间的相互作用，以及其对 HSC 纤维化特性和疾病进展的贡献，目前仍不清楚14,15。
目前用于观察肝星状细胞（HSCs）形态的方法仅限于对体外（in vitro）培养的细胞或体内（in vivo）组织切片进行二维（2D）成像，且很少能完整捕捉到HSCs在各个方向上延伸数个细胞体长度的突起结构。此外，最常用的HSC标志物——结蛋白（desmin），在免疫荧光染色中无法充分呈现HSCs独特的类神经元形态，因为结蛋白是一种细胞骨架蛋白，仅能标记HSCs内部的中间丝结构16。这些方法学上的局限性至今阻碍了在天然微环境中以单细胞分辨率三维（3D）地全面呈现HSCs的形态及其细胞间相互作用的能力。因此，关于HSCs的形态如何与其功能状态以及与邻近细胞类型的相互作用相关联等基本科学问题，仍悬而未决。
本文介绍了一种创新且全面的成像与分析流程，用于在完整肝组织中可视化并建模肝星状细胞（HSC）的形态。该方法整合了多项关键技术革新：（1）利用遗传报告小鼠模型对HSC进行荧光标记，（2）优化的 原位 肝脏灌注与固定以保存完整的组织结构和细胞间关系，（3）基于改良iDISCO的组织透明化方案以实现光学透明17，（4）用于深部组织成像的高分辨率共聚焦显微镜技术，以及（5）用于单个造血干细胞（HSC）三维图像重建与定量分析的定制化计算流程。该方案对组织样本尺寸和所需时间投入有一定限制，需在实验设计时予以考虑。综上，本方案为揭示HSC复杂的三维结构及其与邻近血管、免疫和实质细胞之间的空间关系，提供了可靠且可重复的技术框架。本文所展示的肝脏研究策略与分析流程亦可便捷地推广应用于其他器官。17,18,19.

<table><tbody><tr><td>抗RFP抗体，兔源，预吸附</td><td>Rockland</td><td>600-401-379</td><td></td></tr><tr><td>四室35 mm玻璃底培养皿，带20 mm微孔，#1.5盖玻片</td><td>Cellvis</td><td>D35C4201.5N</td><td></td></tr><tr><td>AnaSed注射液（赛拉嗪注射液）</td><td>Akorn, Inc.</td><td>NDC 593990110-20</td><td>20 mg/mL</td></tr><tr><td>锥形离心管：50 mL&amp;nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Medline</td><td>MDS202000</td><td></td></tr><tr><td>带锁扣的弯止血钳&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-117</td><td></td></tr><tr><td>Cy3标记的AffiniPure驴抗大鼠IgG（H+L）</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-165-153</td><td></td></tr><tr><td>精细手术剪，4.75&quot; 弯头，尖端锐利/钝</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>&lt;br/&gt; 728501</td><td></td></tr><tr><td>二苄基醚（DBE），98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>108014</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷（DCM），&amp;nbsp; &amp;ge;99.8%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO），&amp;ge;99.9%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647标记</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A31573</td><td></td></tr><tr><td>驴血清</td><td>EMD Millipore</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>肉桂酸乙酯，99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>112372</td><td></td></tr><tr><td>超精细显微解剖剪；24 mm刀片</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9232515</td><td></td></tr><tr><td>F4/80单克隆抗体，大鼠源</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-4801-82</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9214139</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Bio-Rad</td><td>1610718</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠盐</td><td>Chem-Impex</td><td>29984</td><td></td></tr><tr><td>Hybaid杂交炉</td><td>Triad Scientific</td><td>Maxi 14</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢，30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31642</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 10.2.0 软件</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImarisFileConverter 10.2.0 软件</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImarisViewer 11.0.0</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>静脉导管</td><td>Exel International Inc.</td><td>EXE 26751</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮盐酸盐注射液</td><td>Dechra</td><td>B8U4</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>LAS X 4.4.0.24861 软件</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Stellaris 8 共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲醇，HPLC级</td><td>Fisher</td><td>A452-2</td><td></td></tr><tr><td>多功能旋转仪</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td>Model 151</td><td></td></tr><tr><td>针头（27G × 1/2"）</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛，粉末，95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Gilson</td><td>Model Minipuls 3</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵管，MasterFlex</td><td>Thermo Scientific</td><td>96400-16</td><td>内径3.1 mm × 长7.6 m，过氧化物固化的硅胶精密泵管，L/S 16规格，1/8 in接头</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.01</td><td>无菌，pH 7.0–7.2，不含钙、镁</td></tr><tr><td>碘化丙啶，&amp;ge;94.0%（HPLC）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>American Line</td><td>66-0362</td><td></td></tr><tr><td>摇床平台</td><td>VWR</td><td>Model 200</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠，&amp;ge;99.5%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>缝合线</td><td>Ethicon</td><td>J109T</td><td></td></tr><tr><td>注射器（1 mL）</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Scientific</td><td>J20605-AP</td><td></td></tr><tr><td>螺口小瓶，带实心盖和铝衬垫，预组装</td><td>Sigma Aldrich</td><td>27470-U</td><td>体积7 mL，琥珀色玻璃小瓶，外径 &amp;times; 高17 mm &amp;times; 60 mm，螺纹规格15-425</td></tr></tbody></table>

在小鼠肝纤维化模型中绘制肝星状细胞形态

Mapping Hepatic Stellate Cell Morphology in Mouse Models of Liver Fibrosis

组织驻留成纤维细胞是多种组织中纤维化过程的细胞驱动因素。在肝脏中，肝星状细胞（HSCs）作为具有独特“星状”形态的驻留周细胞，在肝损伤时活化为促纤维化的肌成纤维细胞，进而形成肝纤维瘢痕。尽管数十年的研究已阐明了HSC活化的主要信号通路，但由于成像与分析技术的局限性，其独特的树突状形态的功能意义仍不明确。本方案介绍了一种全面的成像流程，用于在完整肝组织中可视化并建模HSC的形态。该方法结合利用小鼠遗传学对HSC进行荧光标记， 原位 基于肝脏灌注的组织制备方法，以及改良的iDISCO组织透明化技术，实现对厚度达数厘米的组织样本的光学透明化。透明化后的样本通过优化的共聚焦显微镜平台进行成像，并利用定制化的分析流程对图像数据集进行处理，从而在单细胞分辨率下实现单个肝星状细胞（HSCs）的三维重建。该技术流程共同实现了在复杂肝脏微环境中HSC形态的可重复性定位，包括其树突状突起及其与邻近细胞的空间关系。除肝脏外，该流程还可适用于其他器官中的成纤维细胞，如肺、肾、肠道和心脏，其中定居的间充质细胞在疾病中表现出类似的促纤维化作用。因此，该研究框架为开展跨器官比较研究建立了方法学基础，可用于探究纤维化疾病中成纤维细胞的结构-功能关系及其治疗脆弱性。

小鼠肝脏灌注和固定的成功表现为肝脏呈现均匀的浅米黄色，反映出血液被有效清除且固定液充分渗透（图1A，B）。灌注不当会导致出现暗红色或棕色的血凝块区域，这些区域会降低组织的光学清晰度，并在样本相应部位产生较高的背景信号（图1C）。
在组织透明化过程中，组织样本从灌注到二抗孵育阶段均保持浅米色外观。与之前步骤相比，组织样本在二抗孵育后颜色变得更白。当样本在DBE中孵育时，可达到完全的光学透明（图2）。此时组织呈透明状，具有坚硬的玻璃样质地，便于进行高分辨率的深层组织成像。
使用针对TdTomato标记的HSCs的抗体染色的透明化样本，在共聚焦显微镜下可保持强烈且稳定的荧光信号。抗体渗透不完全或抗体不兼容会导致最终图像中出现高背景信号17。拼图扫描可快速评估标记覆盖范围并捕获...

本方案介绍了一种全面的成像流程，用于在完整肝组织中可视化并建模肝星状细胞的形态。该方法结合利用小鼠遗传学对成纤维细胞进行荧光标记， 原位 基于肝脏灌注的组织制备，以及改良的iDISCO组织透明化方法，以实现光学透明。

组织驻留的成纤维细胞是多种组织中纤维化过程的细胞驱动因素。在肝脏中，肝星状细胞（HSCs）作为驻留的周细胞……

本方案介绍了一种全面的成像流程，用于在完整肝组织中可视化并建模肝星状细胞的形态。现有的二维成像技术无法完整呈现星状细胞的形态，限制了对细胞结构与功能的深入理解。本方案能够稳健地捕获复杂的三维结构。首先，捏压麻醉后小鼠的掌心以确认麻醉效果充分。用70%乙醇喷洒腹部，使毛发湿润。用镊子夹起与后肢对齐的腹部中线处皮肤，开始剪开皮肤以暴露腹腔。然后用 PBS 湿润的棉签将肠道和其他器官移至一侧，并抬起左叶。仔细剪断左叶与尾状叶之间相连的膜。然后用缝线在左叶顶部基部进行结扎。在缝合结下方切除左叶，并将其留出用于组织样本的采集和处理。使用经PBS润湿的棉签移动肝脏，暴露门静脉。然后在门静脉约中点处小心地插入导管针。移除导管针。确保有血液回流通过导管，以表明插入成功。将运行中的灌注泵连接的已充满液体的管路连接到导管，并用 20 毫升 PBS 灌注肝脏。用止血钳夹闭肝脏上方的肺动脉，以阻止 PBS 流经心脏。剪开下腔静脉以释放积聚的压力。将泵速调节至每分钟 5 毫升。15分钟后，停止泵流，将储液器更换为4%多聚甲醛，然后用25毫升4%多聚甲醛灌注肝脏。灌注完成后，剪除连接组织，将肝脏从周围器官中取出。将肝脏置于装有25毫升4%多聚甲醛的50毫升锥形管中。将试管置于4°C冷室中，以每分钟1.5转的速度在水平摇床上过夜孵育。次日，在室温下以每分钟1.5转的速度，于水平摇床上用PBS洗涤肝脏三次，每次30分钟。将肝脏转移至含0.02%叠氮化钠的20毫升PBS中，于4°C保存。将肝组织样本切成约0.5至1立方厘米大小的组织块。将肝组织样本转移至带螺旋盖的玻璃小瓶中。在室温下，使用20%至80%的水稀释甲醇系列溶液，在转轮摇床上以每分钟8转的速度依次脱水，每个浓度处理1小时。完成样本漂白、通透、免疫标记和透明化处理后，将样本在室温下置于二苄基醚中孵育过夜，再进行成像。样本可在二苄基醚中保存长达一年，染色信号不会损失。进行共聚焦成像时，将透明化后的样本置于带有1.5号玻璃底的35毫米玻璃底培养皿中。用肉桂酸乙酯充满培养皿，使样本完全浸没。然后将培养皿置于共聚焦显微镜的载物台上。在最亮的焦平面上获取拼接图像，以覆盖样本的较大区域，采用1024 × 1024的分辨率和600的扫描速度。根据图块图像，选择感兴趣区域以采集更高分辨率的Z轴扫描图像。接下来，使用显微镜支持的最高分辨率，以1024×1024的格式和600的扫描速度，获取贯穿透明化组织全深度的Z轴层扫图像。成功灌注并固定的实验小鼠肝脏呈现出均匀的浅米黄色。灌注不当会导致血栓形成暗红色或棕色区域，降低组织光学透明度，并使这些区域产生较高的背景信号。在二苄基醚中孵育后，组织达到完全光学透明，与透明前相比，组织呈现清晰状态。高分辨率Z轴层扫图像显示，单个肝星状细胞胞体延伸出精细的树突状突起。对照组和慢性四氯化碳肝损伤样本在共聚焦显微镜下均显示出强而稳定的荧光信号。该流程可重复地描绘出复杂微环境中星状细胞的形态，捕捉到树突状突起及其与邻近细胞的空间关系。在执行该实验方案时，所需时间投入是一个重要的考虑因素。透明化过程大约需要三周时间，因此需要提前规划。该平台能够实现精确的三维形态计量分析，将成纤维细胞的结构与功能相关联，从而加深对组织稳态及一种Z机制的理解。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

肝纤维化小鼠模型中肝星状细胞形态的映射

本文介绍了一种从小鼠肝脏中分离肝星状细胞的方法。为纯化星状细胞，将小鼠肝脏进行消化处理 原位 和 体外...

星状细胞分离的七个步骤

胆汁流的中断会导致严重的炎症性胆汁淤积性肝损伤，并伴随特征性的时间依赖性形态学改变序列。本文介绍了一种在小鼠中进行总胆管结扎的手术方案，可在21至28天后诱导出显著的纤维化反应。...

小鼠胆管结扎术：通过阻塞性胆汁淤积诱导炎症性肝损伤及纤维化

持续的纤维化伴随过量细胞外基质蛋白沉积可导致肝硬化。酒精滥用是严重肝病的主要病因之一。我们建立了一种乙醇诱导的斑马鱼肝纤维化模型，用于研究酒精诱导损伤后促进肝细胞再生的机制与策略。...

建立乙醇诱导的斑马鱼肝纤维化模型以研究前体细胞介导的肝细胞再生

本方案提供了一种简单且可靠的方法，用于制备来自小鼠的具有活性的精准切割肝组织片。这些离体组织样本可在实验室组织培养条件下维持数天，为研究肝脏病理生物学提供了一个灵活的模型。...

小鼠精准切割肝片作为肝脏生物学的离体研究模型

本方案介绍了一种具有伴随性纤维化间质区室的三维仿生模型。该模型采用生理相关浓度的水凝胶按比例制备，模拟间质细胞外基质的生物物理特性，而细胞外基质是细胞相互作用、肿瘤生长及转移的活性调节介质。...

一种用于在具有可调生物物理特性的三维环境中研究肿瘤-间质相互作用的肝癌仿生模型

非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中肝脏细胞外基质的三维成像

富含脂质的肝细胞在肝脏再生过程中具有内在作用，但通常在密度梯度离心过程中丢失。本文介绍了一种优化的细胞分离方案，可保留脂肪变性肝细胞，从而在小鼠部分肝切除术后获得具有代表性的再生肝细胞群体。...

小鼠部分肝切除术后再生肝细胞的分离

我们建立了一种小鼠慢性肝纤维化模型，该模型为胆道闭锁（BA）相关的病毒诱导肝纤维化机制研究提供了合适的动物模型，同时也为未来BA的治疗提供了一个研究平台。...

用于胆道闭锁研究的慢性肝纤维化小鼠模型

本研究的目的是开发一种用于肝纤维化早期诊断的新型三维数字模型，该模型包含患者肝脏中每个体素的硬度信息，因此可用于计算患者肝脏在不同纤维化阶段的分布比例。...

基于磁共振弹性成像的肝纤维化早期诊断三维数字模型

小鼠部分肝切除（2/3，即66%）模型在文献中已有充分描述，但用于模拟肝移植后小体积综合征的更大范围肝切除模型则较少被采用。本文介绍一种在小鼠中实施的扩展性78%肝切除手术方法，该操作在健康小鼠中可导致约50%的术后死亡率。...

小鼠手术模型中的扩大78%肝切除术

一种模拟代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）的小鼠模型，具有代谢功能障碍、肝脏基因表达改变以及肝组织病理学变化，且包含进展至晚期纤维化3期的纤维化特征，与人类MASLD相似。该模型可用于MASLD发病机制的研究以及新疗法的临床前研究。...

伴纤维化的代谢功能障碍相关脂肪性肝病小鼠模型

了解利用荧光标记、组织透明化和共聚焦显微镜技术，在小鼠完整肝脏组织中实现肝星状细胞三维形态重建的高分辨率成像方法。该流程支持纤维化疾病中细胞结构与功能关系的研究。

在小鼠肝纤维化模型中绘制肝星状细胞形态

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